賴氨酸增強牛血清白蛋白修飾發(fā)光碳量子點熒光探針測定Cu的制作方法
【專利說明】賴氨酸增強牛血清白蛋白修飾發(fā)光碳量子點熒光探針測定
Cu2+
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生化分子技術(shù)領(lǐng)域，用BSA和Lys連續(xù)修飾⑶s來減少其表面缺陷實現(xiàn)增強其熒光信號的目的，不僅提高了方法的靈敏度，而且開發(fā)了測定Cu2+的熒光探針，擴展了 CDs的應(yīng)用新領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]銅離子(Cu2+)是一種非常重要的生命元素，其在人體中的含量僅次于鋅和鐵，對于動物機體而言，它在許多重要生理活動如細(xì)胞呼吸、生物合成和代謝中有重要作用。但是過量的cu2+不僅會誘發(fā)各種神經(jīng)疾病如阿爾茨海默氏病、帕金森病和瘋?cè)瞬〉?，對藻類、真菌類、?xì)菌和病毒等生命有機體也是有害的。因此，自然環(huán)境和生物體內(nèi)Cu2+的選擇性檢測及控制對環(huán)境保護和人體健康具有重大意義。
[0003]發(fā)光碳量子點(CDs)是近年來出現(xiàn)的一種新型熒光納米顆粒，具有化學(xué)惰性和良好的光學(xué)性能。與有機染料和半導(dǎo)體量子點相比較，CDs不僅熒光信號穩(wěn)定，無光閃爍，激發(fā)波長和發(fā)射波長可調(diào)控，而且具有生物相容性好，毒性小等優(yōu)勢。目前CDs己被用于DNA、P043、溶菌酶、凝血酶、亞硝酸鹽、葡萄糖、Ag\ Hg2+及生物巰基化合物、cu 2+的測定。
[0004]本發(fā)明采用賴氨酸(Lys)增強牛血清白蛋白(BSA)修飾碳量子點(⑶s)熒光探針測定痕量Cu2+0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是建立一種新的人體Cu2+的檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:借助1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的活化作用，利用牛血清白蛋白(BSA)的-NH2與碳量子點(CDs)的-C00H反應(yīng)得到產(chǎn)物CDs-BSA，該產(chǎn)物中的-C00H和_順2與賴氨酸(Lys)中的-C00H和-NH2反應(yīng)生成新的包覆層，減少CDs的表面缺陷，從而極大程度地提高CDs的熒光信號，首次開發(fā)了 CDs-BSA-Lys熒光探針；并基于Cu2+與CDs-BSA-Lys分子中的-C00H和_順2作用形成了不發(fā)熒光的配合物導(dǎo)致體系的熒光劇烈猝滅的現(xiàn)象，建立了 Lys增強BSA修飾CDs熒光探針測定痕量Cu2+的方法。包括如下步驟:
(1)Cu2+工作液:取1000 μ gmL 1 Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋成1.0 X 10 9mol mL 1，1.0X10 12 mol mL 1的Cu 2+溶液作為工作液。
[0007](2) CDs的制備:將4.000g葡萄糖和20.00 mL PEG-200混合后溶解在6.00 mL去離子水中，得到澄清的溶液。然后將該溶液放置于微波爐中，在540 W的功率下微波2 min,即得到淡黃色的⑶s。最后溶液經(jīng)透析袋透析24小時后用水定容至100 mL。
[0008](3) BSA修飾CDs:取20.00 mL CDs，加入 10.00 mL 20.0 mM EDC和5.00 mL 20.0mMNHS，在37°C磁力攪拌條件下活化30 min后加入5.00 mL 50.0 mgmL ^SA，反應(yīng)2小時。再將溶液放在4°C冰箱里隔夜使EDC和NHS去活化。之后將溶液在llOOOrpm條件下離心30min,以除去過多的BSA。取10.00 mL離心后的⑶s_BSA至100mL容量瓶中，并定容搖勻。
[0009](4)測定 Cu2+的過程:取 1.00 mL CDs-BSA、1.0 μ ml Lys、1.00 mL pH=5.00 的 PBS緩沖液和不同用量的Cu2+于lOmL比色管中，定容并迅速搖勻后，置于50°C水浴下反應(yīng)10min，然后冰水浴冷卻5 min。同時，進行空白實驗。測定⑶s-BSA_LyS-Cu2+體系的熒光，其中試液的熒光強度為F:，空自液的熒光強度為F。，并計算TFbFfF。)。
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0011]實施例1
采用賴氨酸(Lys)增強牛血清白蛋白(BSA)修飾碳量子點(CDs)熒光探針測定痕量Cu2+，包括如下步驟:
(1)Cu2+工作液:取1000 μ gmL 1 Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋成1.0 X 10 9mol mL 1，
1.0X10 12 mol mL 1的Cu 2+溶液作為工作液。
[0012](2) CDs的制備:將4.000g葡萄糖和20.00 mL PEG-200混合后溶解在6.00 mL去離子水中，得到澄清的溶液。然后將該溶液放置于微波爐中，在540 W的功率下微波2 min,即得到淡黃色的⑶s。最后溶液經(jīng)透析袋透析24小時后用水定容至100 mL。
[0013](3) BSA修飾CDs:取20.00 mL CDs，加入 10.00 mL 20.0 mM EDC和5.00 mL 20.0mMNHS，在37°C磁力攪拌條件下活化30 min后加入5.00 mL 50.0 mgmL ^SA，反應(yīng)2小時。再將溶液放在4°C冰箱里隔夜使EDC和NHS去活化。之后將溶液在llOOOrpm條件下離心30min,以除去過多的BSA。取10.00 mL離心后的⑶s_BSA至100mL容量瓶中，并定容搖勻。
[0014](4)測定 Cu2+的過程:取 1.00 mL CDs-BSA、1.0 μ ml Lys、1.00 mL pH=5.00 的 PBS緩沖液和不同用量的Cu2+于lOmL比色管中，定容并迅速搖勻后，置于50°C水浴下反應(yīng)10min，然后冰水浴冷卻5 min。同時，進行空白實驗。測定⑶s-BSA_LyS-Cu2+體系的熒光，其中試液的熒光強度為F:，空自液的熒光強度為F。，并計算TFbFfF。)。
[0015]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.賴氨酸增強牛血清白蛋白修飾發(fā)光碳量子點熒光探針測定Cu2+，其特征在于:建立Lys增強BSA修飾⑶s熒光探針測定痕量Cu2+的方法。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體內(nèi)重金屬的檢測方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)Cu2+工作液:取1000 μ gmL 1 Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋成1.0 X 10 9mol mL \1.0X10 12 mol mL 1的Cu 2+溶液作為工作液； (2)CDs的制備:將4.000g葡萄糖和20.00 mL PEG-200混合后溶解在6.00 mL去離子水中，得到澄清的溶液；然后將該溶液放置于微波爐中，在540 W的功率下微波2 min，即得到淡黃色的⑶s ;最后溶液經(jīng)透析袋透析24小時后用水定容至100 mL ;(3)BSA 修飾 CDs:取 20.00 mL CDs，加入 10.00 mL 20.0 mM EDC 和 5.00 mL 20.0mMNHS，在37°C磁力攪拌條件下活化30 min后加入5.00 mL 50.0 mgmL ^SA，反應(yīng)2小時；再將溶液放在4°C冰箱里隔夜使EDC和NHS去活化；之后將溶液在llOOOrpm條件下離心30min,以除去過多的BSA ;取10.00 mL離心后的⑶s_BSA至100mL容量瓶中，并定容搖勻；(4)測定Cu2+的過程:取 1.00 mL CDs-BSA、1.0 μ ml Lys、L00 mL pH=5.00 的 PBS 緩沖液和不同用量的Cu2+于10mL比色管中，定容并迅速搖勻后，置于50°C水浴下反應(yīng)10 min,然后冰水浴冷卻5 min ;同時，進行空白實驗；測定CDs-BSA-Lys-Cu2+體系的熒光，其中試液的熒光強度為F:，空自液的熒光強度為F。，并計算TFbFfF。)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，采用pH=5.00的PBS溶液來調(diào)節(jié)體系的酸度。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，反應(yīng)的溫度和時間分別設(shè)定為 50°C、lOmin。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，用423nm為工作波長實現(xiàn)對Cu2+含量的測定。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人體內(nèi)重金屬離子的檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是借助l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的活化作用，利用牛血清白蛋白（BSA）的-NH2與碳量子點(CDs)的-COOH反應(yīng)得到產(chǎn)物CDs-BSA，該產(chǎn)物中的-COOH和-NH2與賴氨酸（Lys）中的-COOH和-NH2反應(yīng)生成新的包覆層，減少CDs的表面缺陷，從而極大程度地提高CDs的熒光信號，首次開發(fā)了CDs-BSA-Lys熒光探針；并基于Cu2+與CDs-BSA-Lys分子中的-COOH和-NH2作用形成了不發(fā)熒光的配合物導(dǎo)致體系的熒光劇烈猝滅的現(xiàn)象，建立了Lys增強BSA修飾CDs熒光探針測定痕量Cu2+的方法。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105403547
【申請?zhí)枴緾N201510832640
【發(fā)明人】劉乃山, 馮騁武, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年11月26日