一種定量分析煙葉中12種類(lèi)黃酮物質(zhì)的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量分析煙葉中12種類(lèi)黃酮物質(zhì) 的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 類(lèi)黃酮物質(zhì)（fIavonoids)是指兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)中央三碳原子相互連接的一系列化 合物，它們廣泛分布于植物界，是植物重要的次生代謝產(chǎn)物。類(lèi)黃酮物質(zhì)已在很多植物體 中被證明與植物的抗蟲(chóng)和抗病相關(guān)。同時(shí)，黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)生物活性很強(qiáng)的化合物，是 一種天然的抗氧化劑，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。煙草中類(lèi)黃酮化合物(包括類(lèi) 黃酮糖苷及其苷元）還是煙草香味物質(zhì)的重要前體，其分解產(chǎn)物與煙草的香氣質(zhì)和香氣量 有關(guān)。在煙葉的調(diào)制、醇化和燃燒過(guò)程中，黃酮類(lèi)化合物可氧化分解，賦予優(yōu)雅清香氣味，增 加香氣量，因此，它們對(duì)改善煙草制品的品質(zhì)有著重要的作用。
[0003] 目前，關(guān)于煙草中類(lèi)黃酮物質(zhì)的分析檢測(cè)方法報(bào)道較少。1965年，Watanabe和 Wender采用溶劑提取和紙色譜分離的方法從煙草花的雄蕊中分離出蕓香苷、山奈酚苷、異 槲皮苷、黃芪苷、槲皮素-7-0-葡萄糖苷、煙花甙等黃酮類(lèi)化合物。1992年，Snook等采用 液相色譜法系統(tǒng)研究了 66種煙草花中的黃酮類(lèi)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同煙草花中黃酮類(lèi)物質(zhì)差異 很大。2007年，Tao Pang等采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜從煙葉中分離鑒定出蕓香苷、山柰酚苷、 槲皮苷等化合物。目前，煙草中類(lèi)黃酮物質(zhì)的定量分析方法只涉及含量最高的蕓香苷(槲皮 素-3-0-蕓香糖苷）和山奈酚-3-0-蕓香糖苷。這主要是由于傳統(tǒng)的高效液相色譜法靈敏 度較低無(wú)法檢測(cè)到低含量類(lèi)黃酮物質(zhì)，部分類(lèi)黃酮物質(zhì)之前未被鑒定也是原因之一。隨著 人們對(duì)煙草中類(lèi)黃酮物質(zhì)關(guān)注的增加，建立一種類(lèi)黃酮物質(zhì)全面定量分析方法變得十分必 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種定量分析煙葉中12種類(lèi)黃酮物質(zhì)的檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括樣品前處理、供試品溶液的制備、對(duì)照品溶液的 制備和測(cè)定步驟，具體包括： A、 樣品前處理：將待檢樣品煙葉研磨、冷凍干燥后置于1~4 °C保存?zhèn)溆茫?B、 供試品溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg的前處理后的樣品，加入1ml的甲醇-氯仿-水 提取溶液和200 μ 1的內(nèi)標(biāo)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液為黃豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，濃度 為I. 0 μ g/mL，經(jīng)超聲處理、離心后取上清液作為供試品溶液； C、 對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱(chēng)定各標(biāo)準(zhǔn)化合物，即12個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品和3個(gè)內(nèi)標(biāo)物黃 豆苷元、染料木苷和橙皮苷，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，得到lmg/ml的類(lèi)黃酮單標(biāo) 溶液，分別移取100 μ I lmg/ml的低濃度類(lèi)黃酮單標(biāo)溶液以及10mg/ml的高濃度類(lèi)黃酮單 標(biāo)溶液于100mL容量瓶中，以樣品提取溶液，即甲醇-氯仿-水提取溶液定容制備得到標(biāo) 準(zhǔn)混合溶液，以樣品提取溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，制成低濃度類(lèi)黃酮物質(zhì)濃度為1000、 600、400、100、60、40、10、6、4、1 ng/mL，體積為I mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度；此梯度對(duì)應(yīng)的高濃度 標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度為l〇〇、60、40、10、6、4、l、0. 6、0. 4、0.1 yg/mL ;在上述所有濃度梯度的溶液 中加入200 μ 1的內(nèi)標(biāo)溶液得到對(duì)照品溶液，內(nèi)標(biāo)溶液為黃豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水 溶液，濃度為1. 0 μ g/mL ; D、測(cè)定：經(jīng)色譜質(zhì)譜分析，以待測(cè)12個(gè)類(lèi)黃酮化合物的含量為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的色 譜峰面積與內(nèi)標(biāo)化合物的色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，建立工作曲線(xiàn)，對(duì)校正數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn) 性回歸，求得類(lèi)黃酮物質(zhì)的回歸方程，試樣中類(lèi)黃酮物質(zhì)的含量按下式進(jìn)行計(jì)算：
式中：C為煙草花瓣樣品中類(lèi)黃酮物質(zhì)的含量，單位μ g/g; X為儀器測(cè)得的萃取液的濃度，單位為ug/mL。
[0006] 本發(fā)明基于發(fā)明人2014年從煙草的葉和花中鑒定出17種類(lèi)黃酮物質(zhì)，其中9種 為煙草中首次被鑒定出來(lái)，使得建立了其中12種類(lèi)黃酮物質(zhì)的定量分析方法，本發(fā)明方法 的建立對(duì)于開(kāi)展煙草花瓣中類(lèi)黃酮物質(zhì)的相關(guān)研究具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0007] 圖1為本發(fā)明煙葉樣品的類(lèi)黃酮物質(zhì)分離色譜圖； 圖中：①~?編號(hào)的色譜圖對(duì)應(yīng)的化合物依次為槲皮素-3-0-蕓香苷、槲皮素-3-0-葡 萄糖苷、山奈酸_3_0_蕓香苷、異鼠李素-3-0-蕓香糖苷、山奈酸-3-0-匍萄糖苷、異鼠李 素-3-0-匍萄糖苷、二氫懈皮素、柚皮素-7-0-匍萄糖、二氫山奈酸、木樨草素、懈皮素、異鼠 李素； 圖2為本發(fā)明煙葉樣品的類(lèi)黃酮物質(zhì)分離總離子流色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009] 本發(fā)明所述的定量分析煙葉中12種類(lèi)黃酮物質(zhì)的檢測(cè)方法，包括樣品前處理、供 試品溶液的制備、對(duì)照品溶液的制備和測(cè)定步驟，具體包括： A、 樣品前處理：將待檢樣品煙葉研磨、冷凍干燥后置于1~4 °C保存?zhèn)溆茫?B、 供試品溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg的前處理后的樣品，加入1ml的甲醇-氯仿-水 提取溶液和200 μ 1的內(nèi)標(biāo)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液為黃豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，濃度 為I. 0 μ g/mL，經(jīng)超聲處理、離心后取上清液作為供試品溶液； C、 對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱(chēng)定各標(biāo)準(zhǔn)化合物，即12個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品和3個(gè)內(nèi)標(biāo)物黃 豆苷元、染料木苷和橙皮苷，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，得到lmg/ml的類(lèi)黃酮單標(biāo) 溶液，分別移取100 μ I lmg/ml的低濃度類(lèi)黃酮單標(biāo)溶液以及10mg/ml的高濃度類(lèi)黃酮單 標(biāo)溶液于100mL容量瓶中，以樣品提取溶液，即甲醇-氯仿-水提取溶液定容制備得到標(biāo) 準(zhǔn)混合溶液，以樣品提取溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，制成低濃度類(lèi)黃酮物質(zhì)濃度為1000、 600、400、100、60、40、10、6、4、1 ng/mL，體積為I mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度；此梯度對(duì)應(yīng)的高濃度 標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度為l〇〇、60、40、10、6、4、l、0. 6、0. 4、0.1 yg/mL ;在上述所有濃度梯度的溶液 中加入200 μ 1的內(nèi)標(biāo)溶液得到對(duì)照品溶液，內(nèi)標(biāo)溶液為黃豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水 溶液，濃度為1. 0 μ g/mL ; D、測(cè)定：經(jīng)色譜質(zhì)譜分析，以待測(cè)12個(gè)類(lèi)黃酮化合物的含量為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的色 譜峰面積與內(nèi)標(biāo)化合物的色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)，建立工作曲線(xiàn)，對(duì)校正數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn) 性回歸，求得類(lèi)黃酮物質(zhì)的回歸方程，試樣中類(lèi)黃酮物質(zhì)的含量按下式進(jìn)行計(jì)算：
式中：C為煙草花瓣樣品中類(lèi)黃酮物質(zhì)的含量，單位μ g/g; X為儀器測(cè)得的萃取液的濃度，單位為ug/mL。
[0010] A步驟中所述的研磨是將待檢樣品煙葉放入研缽，加液氮冷凍，研磨粉碎。
[0011] A步驟中所述的甲醇-氯仿-水提取溶液的體積配比為5:2:2。
[0012] D步驟中所述的色譜分析條件為：色譜柱，Waters BEH C18 (15 cm X 2. I _， I. 7 μ m粒徑);A相，水；B相，乙腈，兩相均添加0. 1%的甲酸和0. 2 mmol/L的醋酸銨；流動(dòng)性 梯度，0-lmin，10%B ;l-9min, 10%B-90%B ;9-llmin，90%B-100%B ; 11-11. lmin，100%B-10%B ; II. l-13min，保持 10%B ;柱溫 30°C，進(jìn)樣量 2 yL，流速(λ 25 mL/min。
[0013] D步驟中所述的質(zhì)譜分析條件為：離子源，電噴霧電離離子源；噴霧電壓，-4000 V;簾氣壓力，40 psi;離子源溫度，700 °C;輔助氣1，60 psi;輔助氣2,50 psi;去簇電 壓，-100 V ;化合物定量離子及能量見(jiàn)表1， 表1類(lèi)黃酮物質(zhì)分析質(zhì)譜定量離子及碰撞能量
下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明： 實(shí)驗(yàn)試劑及裝置： 乙腈(色譜級(jí))、甲醇（色譜級(jí))、乙醇（色譜級(jí)）購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)Merck公司。超純水由 Millipore純化系統(tǒng)制備。二氫山奈酚、二氫槲皮素、槲皮素、蕓香苷、山奈酚-3-0-蕓 香糖苷、異鼠李素、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、木犀草素、異鼠李素-3-0-葡萄糖苷、異鼠李 素-3-0-蕓香糖苷、山奈酸-3-0-匍萄糖苷、柚皮素-7-0-匍萄糖苷等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及黃? 苷元、染料木苷(葡萄糖基)、橙皮苷(蕓香糖基）等內(nèi)標(biāo)物質(zhì)購(gòu)買(mǎi)于Sigma-Aldrich，Alfa Aesar和百靈威公司。Waters UPLC液相色譜儀(美國(guó)），AB SCIEX 5500三重四極桿質(zhì)譜儀 (美國(guó)）。SB-50D超聲波提取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司）;Waters BEH C18(15 cm X 2.1mm, L7 μπι粒徑)反相色譜柱（Waters, USA)，MILLI-Q 純水機(jī)（MILLIP0RE 公司）， LD5-2A離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司），渦旋混勻器(荷蘭Breda公司）；CP2245分析天 平(感量0.0 OOlg，德國(guó)Sartorious公司）。
[0014] 實(shí)施例1 一一煙草栽培品種K326中煙葉類(lèi)黃酮物質(zhì)的定量分析 實(shí)驗(yàn)材料：新鮮凍干的K326成熟期中部煙葉。
[0015] 實(shí)驗(yàn)方法： 準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg的凍干煙葉樣本，加入I mL提取劑（甲醇-氯仿-水，5:2:2,體積 比）和200 μ L內(nèi)標(biāo)溶液（I. 0 μ g/mL)，超聲30 min，離心，取上清液轉(zhuǎn)入液相色譜進(jìn)樣小 瓶分析。
[0016] 色譜分析條件條件：色譜柱，Waters BEH C18 (15 cm X 2. I mm，L 7 μπι 粒徑）;A 相，水；B相，乙腈，兩相均添加0. 1%的甲酸和0. 2 mmol/L的醋酸銨；流動(dòng)性梯度，0-lmin， 10%B ；l-9min, 10%B_90%B ;9_1lmin，90%B_100%B ;11-11. lmin，100%B_