基于多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的適配體傳感器制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及所述的基于多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的適配體傳感器制備，屬于農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，奶產(chǎn)量大幅度提高，新鮮牛奶和奶制品已經(jīng)成為人民(尤其是老人和兒童)生活食品中的重要組成部分。抗生素被廣泛用于預(yù)防及治療奶牛疾病，由于頻繁、超劑量使用，使得牛奶等動(dòng)物源食品中存在一定量的抗生素殘留。長(zhǎng)期飲用或食用有抗生素殘留的牛乳或乳制品，也就相當(dāng)于長(zhǎng)期低劑量的攝入抗生素，從而使人體腸道內(nèi)的正常菌群受到抑制，導(dǎo)致致病菌大量繁殖引起全身或局部感染。由于奶牛乳腺炎發(fā)病率較高，用四環(huán)素來(lái)治療乳腺炎等產(chǎn)科疾病仍較普遍，這容易導(dǎo)致在牛奶中四環(huán)素的殘留。過(guò)量使用四環(huán)素類(lèi)抗生素不可避免會(huì)使母體代謝產(chǎn)物等相關(guān)抗生素殘留于動(dòng)物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中，進(jìn)而通過(guò)食物鏈影響人體健康。牛奶中含有抗生素殘留，不僅對(duì)人的健康造成很大的危害，而且對(duì)乳品加工企業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。因此必須嚴(yán)格控制牛奶中抗生素殘留，除了要做好科學(xué)飼養(yǎng)、精心管理、正確擠奶和預(yù)防疾病外，還要規(guī)范抗生素的使用。因此要避免上述情況的發(fā)生，除了從源頭上控制抗生素的使用外，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出動(dòng)物源食品中的抗生素殘留是保障畜產(chǎn)品安全的有效途徑?？梢?jiàn)，加強(qiáng)對(duì)牛奶等農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留的檢測(cè)，尤其是保障人類(lèi)健康有著十分深遠(yuǎn)的意義。
[0003]傳統(tǒng)的抗生素殘留檢測(cè)方法主要有:氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/LC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)、熒光分析、酶聯(lián)免疫法(ELISA)。這些方法雖然選擇性好、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢出限低，可同時(shí)檢測(cè)多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品前處理過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)，并且對(duì)分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。核酸適配體(Aptamer)是人工合成的核酸序列，經(jīng)多次篩選獲得的核酸適配體與靶分子有很高的特異性和親和力。而且適配體是由體外篩選和擴(kuò)增獲得的，不需要免疫動(dòng)物或培養(yǎng)細(xì)胞，具有極好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，很高的純度，可以避免產(chǎn)生批間差異。另外，核酸適配體無(wú)免疫原性，可在不同溫度、不同離子濃度、金屬螯合劑存在條件下反復(fù)變性和復(fù)性，在合成過(guò)程中，各種報(bào)告分子(熒光素或生物素)和功能集團(tuán)可精確地結(jié)合在適配體位點(diǎn)上。目前用抗體進(jìn)行檢測(cè)和診斷的技術(shù)幾乎可以全部由適配體來(lái)代替?？股厥切》肿影肟乖镔|(zhì)，難以制備相應(yīng)的抗體，即使制備出相應(yīng)的抗體，也存在免疫傳感器的信號(hào)弱、重復(fù)使用性差、重現(xiàn)性不能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的要求等問(wèn)題。核酸適配體就可以很好的解決這個(gè)問(wèn)題。與傳統(tǒng)的分析方法相比，適配體具有如下特點(diǎn):(I)較高的選擇性，因此不需要對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行分離，即不用對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。(2)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，體積小，使用方便，特別是便攜式的免疫傳感器，非常有利于農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量的快速測(cè)定。(3)可實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線檢測(cè)，使食品加工過(guò)程的質(zhì)量控制變得簡(jiǎn)便。(4)響應(yīng)速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，免疫傳感器制作成本低，且可反復(fù)使用。
[0004]發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷以及操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)四環(huán)素殘留的適配體傳感器的制備方法。將和抗生素特異性識(shí)別的適配體有效固定到工作電極表面，是提高適配體傳感器檢測(cè)抗生素殘留性能的關(guān)鍵?；谶m配體傳感器的檢測(cè)方法具有攜帶方便、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、可實(shí)現(xiàn)抗生素殘留的在線定性定量測(cè)量等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]其技術(shù)方案為:所述的基于多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的適配體傳感器制備，其特征在于:在由多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的工作電極表面，滴涂四環(huán)素適配體，制備四環(huán)素適配體傳感器，將四環(huán)素適配體傳感器用于牛奶中四環(huán)素殘留的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)以上功能，本發(fā)明的基于多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的適配體傳感器制備:(I)多壁碳-殼聚糖(MWCNTs-CHIT)復(fù)合物的制備:將ImL乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到10mL水中制成1.0%乙酸。在盛有10mL 1.0%乙酸的燒杯中添加0.5g的殼聚糖，在室溫下不斷攪拌直至燒杯當(dāng)中的殼聚糖完全溶解為止，得到殼聚糖溶液備用。再取1mL所得殼聚糖溶液，再將2.5mg的多壁碳溶于上述制備的0.lwt%的殼聚糖溶液中，在超聲清洗儀中超聲2h直至溶液呈現(xiàn)出均勻穩(wěn)定的狀態(tài)為止，即得多壁碳-殼聚糖(MWCNTs-CHIT)復(fù)合物；(2)納米四氧化鐵-殼聚糖復(fù)合物的制備:取1mL制備多壁碳-殼聚糖(MWCNTs-CHIT)復(fù)合物時(shí)所得殼聚糖溶液，再將2.5mg的納米四氧化三鐵溶于上述制備的0.1%的殼聚糖溶液中，不斷攪拌至所得的溶液均勻穩(wěn)定為止；(3)取5yL制備好的多壁碳-殼聚糖(MWCNTs-CHIT)復(fù)合物的制備滴涂在預(yù)處理好的玻碳電極表面，常溫干燥，用PH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈?；⑷電極表面晾干后，取5 μ L納米四氧化鐵-殼聚糖(Fe3O4-CHIT)復(fù)合物滴涂在電極表面，常溫下靜置至干燥，然后用超純水沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈桑?5)然后將5yL 5mM的四環(huán)素適配體滴在上述經(jīng)納米材料修飾好的電極上，用橡膠帽蓋住防止水分的蒸發(fā)，4h后用超純水沖洗表面，晾干保存在4°C條件下備用。
[0007]所述的基于多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的適配體傳感器制備，其特征在于:玻碳電極(d=3mm)的清洗，適配體傳感器敏感界面的構(gòu)建及過(guò)程表征(制備多壁碳-殼聚糖和納米四氧化鐵-殼聚糖復(fù)合物，利用多壁碳、殼聚糖和四氧化三鐵的協(xié)同作用共同修飾電極)，適配體傳感器工作曲線的建立，適配體傳感器性能的檢測(cè)，適配體傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。
[0008]所述的基于多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的適配體傳感器制備，其特征在于:實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，主要包括適配體濃度、測(cè)試底液的pH以及測(cè)試時(shí)間和溫度；所制備的適配體傳感器的工作曲線為:Δ I ( μΑ)=5.6119LogC(M)-4.7036 (R2=0.9762)；適配體傳感器性能檢測(cè)包括重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、再生性、特異性以及適配體傳感器對(duì)牛奶樣品回收率的測(cè)定。
[0009]其制備原理為:適配體生物傳感器以適配體作為識(shí)別元件，通過(guò)固定化技術(shù)將適配體結(jié)合到感受器表面，適配體與目標(biāo)物結(jié)合后，形成的復(fù)合物與產(chǎn)生的物理或化學(xué)信號(hào)相關(guān)聯(lián)，由換能器將其轉(zhuǎn)化為與待測(cè)物質(zhì)濃度(或活度)有關(guān)的可定量或者可處理的物理化學(xué)信號(hào)，再通過(guò)二次儀表放大并且輸出信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明采用多壁碳-殼聚糖和納米四氧化鐵-殼聚糖復(fù)合物修飾電極。多壁碳-殼聚糖復(fù)合物作為修飾電極的第一層物質(zhì)不僅可以作為分子導(dǎo)線加速電子在電子表面的傳遞。殼聚糖屬于多糖類(lèi)，它具有優(yōu)異的成膜性、吸附性、透氣性和滲透性，成膜后具有很好的吸附性、穩(wěn)定性和良好的生物相容性，其豐富的氨基、多孔性結(jié)構(gòu)使它被廣泛用于生物分子的固定和修飾電極的制備。納米四氧化鐵的鐵離子可促進(jìn)電極與測(cè)試底液直接的電子傳遞，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的二級(jí)放大。且殼聚糖很好的生物相容性，為適配體在電極表面的固定提供了一個(gè)良好的生物界面，保持了適配體的生物活性以用來(lái)和四環(huán)素進(jìn)行有效的結(jié)合。采用本發(fā)明一種牛奶中四環(huán)素殘留的適配體傳感器制備及檢測(cè)方法，可以在牛奶上市前，進(jìn)行四環(huán)素殘留的快速測(cè)定，直接對(duì)四環(huán)素殘留量是否超標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，避免因食用含有四環(huán)素的牛奶而引起四環(huán)素在人體內(nèi)的蓄積造成嚴(yán)重的后果，為畜牧產(chǎn)品安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供殘留檢測(cè)的技術(shù)支撐。
[0010]所述的基于多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的適配體傳感器制備，其特征在于:對(duì)裸玻碳電極以及MWCNTs-CHIT修飾的電極、MWCNTS-CHIT/Fe304-CHIT復(fù)合修飾電極，以及復(fù)合物修飾電極后固定適配體、適配體傳感器結(jié)合四環(huán)素后的逐步修飾過(guò)程進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)表征。循環(huán)伏安測(cè)試是在-0.2-0.6V，掃速為0.05V/s的條件下進(jìn)行，其測(cè)試底液為含 5mmol/L [Fe (CN) 6Γ/4_和 0.lmol/L KCl 的混合液的 0.lmol/L pH7.5 的磷酸鹽緩沖溶液。通過(guò)交流阻抗方法(EIS)在室溫下進(jìn)行表征，可變電壓為5mV，頻率范圍為
0.1Hz-1OOkHzο四環(huán)素的殘留濃度可通過(guò)適配體與四環(huán)素結(jié)合前后導(dǎo)致適配體傳感器電流變化量(Δ I=I1- 12))進(jìn)行測(cè)量，其中I1S適配體傳感器與待測(cè)目標(biāo)物反應(yīng)前在測(cè)試底液中的電流，12代表修飾電極與待測(cè)目標(biāo)物反應(yīng)后在測(cè)試底液中的電流。
[0011]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):基于多壁碳-殼聚糖/納米四氧化鐵-殼聚糖修飾的適配體傳感器制備，其特征在于:(I)適配體傳感器制備前裸玻碳電極的清洗、活化和性能測(cè)試，如果測(cè)試循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在SOmV以下，氧化峰和還原峰對(duì)稱(chēng)，則所述玻碳電極可使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求。(2)清洗好的玻碳電極表面滴涂分散均勻的多壁碳-殼聚糖復(fù)合物分散液，晾干后，滴涂納米四氧化鐵-殼聚糖，然后固定四環(huán)素適配體。適配體傳感器制備結(jié)束后，放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0012]所述適配體傳感器的制備工藝如下:在預(yù)處理好的玻碳電極(GCE)表面滴涂5 yL制備好的多壁碳-殼聚糖(MWCNTs-CHIT)復(fù)合物，常溫干燥，用pH7.5的磷酸鹽緩沖液沖洗電極表面得多壁碳-殼聚糖修飾電極(MWCNTs-CHIT/GCE);接著在MWCNTs_CHIT/GCE電極上滴涂5 μ L納米四氧化鐵-殼聚糖(