提取樣品中肌醇的方法、試劑盒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提取樣品中肌醇的方法、試劑盒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌醇（Inositol)，又稱1，2, 3, 4, 5, 6-環(huán)己六醇，最早從心肌和肝臟中分離得到， 分子式為C6H1206，結(jié)構(gòu)如式I所不。
[0004] 肌醇廣泛分布在動植物體內(nèi)，是參與新陳代謝活動的"生物活素"，具有免疫、預(yù)防 和治療某些疾病的作用。高等動物若缺乏肌醇，將會出現(xiàn)生長停滯和毛發(fā)脫落等現(xiàn)象，人體 對肌醇的需求量是l-2g/天，許多保健飲料和兒童食品都添加有微量肌醇。肌醇還是腸內(nèi) 某些微生物的生長因子，在其它維生素缺乏時(shí)，它能刺激微生物合成所缺乏的維生素。在發(fā) 酵和食品工業(yè)中，肌醇可用于多菌種培養(yǎng)、促進(jìn)酵母增長。此外，煙草中的肌醇含量較高，在 0. 1%~1%之間，不同地區(qū)與品種的煙葉其肌醇含量略有差別。
[0005] 目前，用于肌醇的檢測方法主要有重量法、微生物法、高碘酸鉀氧化法、示差折光 法、高效液相色譜法和氣相色譜法等。其中，重量法易污染環(huán)境；高碘酸鉀氧化法不能排除 鄰二醇化合物的干擾、專屬性較差；示差折光檢測法所用儀器不穩(wěn)定、干擾因素多；高效液 相色譜法對于成分復(fù)雜樣品分離效果差。而且，目前肌醇檢測方法的前處理均存在提取步 驟繁瑣、時(shí)間較長等問題，尤其是由于肌醇沸點(diǎn)高，采用氣相色譜法時(shí)需進(jìn)行柱前衍生化， 將其制備成低沸點(diǎn)酯類后才能進(jìn)行測定，前處理較為復(fù)雜。
[0006] 目前尚需一種簡便的前處理方法，以快速提取出樣品尤其是煙草或煙草制品中的 肌醇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明人得到了一種快速提取樣品中肌醇的方法，尤其適用于對肌醇含量較高的 煙草或煙草制品進(jìn)行提取，該方法快速簡便、選擇性好、重現(xiàn)性好。此外，發(fā)明人還首次采用 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對提取液中的肌醇進(jìn)行檢測，靈敏度高。
[0008] 本發(fā)明第一方面涉及一種提取樣品中肌醇的方法，包括如下步驟：用乙酸銨水溶 液浸潤樣品，得到提取液。
[0009] 所述浸潤指乙酸銨水溶液與樣品發(fā)生接觸時(shí)，液體附著在樣品表面或滲透到樣品 內(nèi)部的現(xiàn)象。具體地，浸潤時(shí)，乙酸銨水溶液液面至少為樣品高度的1/3或至少為樣品高度 的1/2,優(yōu)選，乙酸銨水溶液完全浸沒樣品。
[0010] 本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的方法中，所述樣品為煙草或煙草制品。
[0011] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，提取溶劑的選擇對肌醇分析有顯著影響，乙酸銨水溶液能將 樣品中的肌醇快速提取出來，提取率高且方法簡單。而采用其他的磷酸鈉緩沖溶液 (NaH2P04-Na2HP04)、磷酸鉀緩沖溶液（K2HP04-KH2P04)等無法對樣品中的肌醇進(jìn)行有效的提 取分析。
[0012] 本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的方法中，所述乙酸銨水溶液的濃度為0. 09-0. 15mol/L， 具體為 〇? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，優(yōu)選為 0?lmol/L。
[0013] 乙酸銨水溶液的濃度為0. 09-0. 15mol/L，可基本完全提取出樣品中的肌醇。
[0014] 本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的方法中，向每克所述樣品中添加乙酸銨水溶液的量為 250-1000mL，具體為 250mL、500mL、750mL或 1000mL，優(yōu)選為 500mL/g。
[0015] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，乙酸銨水溶液添加量過大時(shí)，信號微弱，容易受基線噪音的影響；添 加量過小時(shí)，對于肌醇含量高的樣品，容易出現(xiàn)信號值過飽和、測定不準(zhǔn)確的問題。將乙酸 銨水溶液添加量控制在250-1000mL/g，尤其是500mL/g，可以保有正常信號值，使測量準(zhǔn) 確，同時(shí)合適的乙酸銨水溶液添加量能夠使肌醇被均勻提取出來。
[0016] 本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的方法中，浸潤時(shí)間多l(xiāng)Omin，具體地，浸潤時(shí)間多30min、 多40min或多50min，優(yōu)選為30min。
[0017] 本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的方法中，所述浸潤在超聲下進(jìn)行；具體地，超聲功率為最 大功率的40 % ;更具體地，浸潤溫度為30-60 °C，具體為30 °C、40 °C、50 °C或60 °C。
[0018] 本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的方法中，還包括將提取液進(jìn)行過濾的步驟；具體地，以水 相濾膜過濾提取液；更具體地，所述水相濾膜的孔徑為0. 22ym。
[0019] 本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的方法中，還包括采用液相色譜-質(zhì)譜分析提取液的步 驟。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明任一的方法，液相色譜條件為如下（1)_(6)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)：
[0021] (1)色譜柱為菲羅門（V液相色譜柱；
[0022] (2)進(jìn)樣量為 5yL;
[0023] (3)流動相為0? 1 %醋酸水溶液；
[0024] (4)流速為 0? 8mL/min;
[0025] ⑶柱溫為40°C;
[0026] (6)采用等度洗脫程序，洗脫時(shí)間3min。
[0027] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用菲羅門C18液相色譜柱分析提取液，得到的色譜峰型較好、響應(yīng)值 較高；色譜峰響應(yīng)值隨著進(jìn)樣量增加而增加，但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣量過高時(shí)，肌醇色譜峰出現(xiàn) 裂縫，影響了檢測的準(zhǔn)確性；以〇. 1 %醋酸水溶液作流動相，色譜峰值較好、響應(yīng)值較高。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明任一的方法，質(zhì)譜條件為如下（1)_(7)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)：
[0029] (1)掃描方式為負(fù)離子掃描；
[0030] (2)定量離子對179/87,定性離子對179/59 ;
[0031] (3)碰撞能為-25V;
[0032] (4)離子源為電噴霧電離源；
[0033] (5)檢測方式為多反應(yīng)檢測；
[0034] (6)電噴霧電壓為-4500V;
[0035] (7)離子源溫度為55(TC。
[0036] 以負(fù)離子方式掃描，碰撞能為-25V，選擇定量離子對179/87,定性離子對179/59 進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確度高、靈敏度高、回收率高、重復(fù)性好。選擇其他碰撞能和定量離子對檢測時(shí) 準(zhǔn)確度較低。
[0037] 本發(fā)明第二方面涉及一種提取樣品中肌醇的試劑盒，包括乙酸銨水溶液和水相濾 膜。
[0038] 本發(fā)明第二方面任一的試劑盒，包括如下（1)_(5)中任意的一項(xiàng)或者多項(xiàng)：
[0039] (1)所述乙酸銨水溶液的濃度為0? 09-0. 15mol/L，優(yōu)選為0?lmol/L;
[0040] (2)乙酸銨水溶液的量至少為250mL，具體為250-1000mL，優(yōu)選為500mL;
[0041] (3)所述水相濾膜的孔徑為0? 22ym;
[0042] (4)所述試劑盒為定量分析試劑盒；
[0043] (5)所述樣品為煙草或煙草制品。
[0044] 本發(fā)明第三方面涉及所述試劑盒在提取樣品中肌醇，或者在控制樣品質(zhì)量中的用 途；具體地，所述樣品為煙草或煙草制品。
[0045] 發(fā)明的有益效果
[0046] (1)本發(fā)明以乙酸銨水溶液浸潤樣品，即能從樣品特別是煙草或煙草制品中提取 肌醇，方法簡單，無需使用有毒性的有機(jī)溶劑。
[0047] (2)本發(fā)明首次采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析提取液中的肌醇，快速準(zhǔn)確、靈敏 度高、操作簡單。
[0048] (3)使用本發(fā)明方法提取樣品中肌醇的回收率高、重復(fù)性好。檢測煙草或煙草制 品的樣品時(shí)，幾乎不存在雜峰，目標(biāo)物線性相關(guān)性較好，將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋一定倍數(shù)，以信噪 比S/N= 3計(jì)算出肌醇的檢出限為0. 07mg/g，以信噪比S/N= 10計(jì)算出肌醇的定量限為 0. 22mg/g，平均回收率為93. 4 %~94. 9 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD〈5 %(n= 6)。
【附圖說明】
[0049] 圖1 :本發(fā)明實(shí)施例1中分析方法的流程圖。
[0050] 圖2 :本發(fā)明實(shí)施例1中標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。
[0051] 圖3 :本發(fā)明實(shí)施例1中提取液的色譜圖。
[0052] 圖4 :本發(fā)明實(shí)施例1中肌醇的質(zhì)譜圖。
[0053] 圖5 :本發(fā)明實(shí)施例1中肌醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0054] 圖6 :本發(fā)明實(shí)施例2中不同提取溶劑與色譜峰面積的關(guān)系圖。
[0055] 圖7 :本發(fā)明實(shí)施例3中添加量為25mL乙酸銨水溶液時(shí)的色譜圖；
[0056] 圖8 :本發(fā)明實(shí)施例3中添加量為100mL乙酸銨水溶液時(shí)的色譜圖；
[0057] 圖9 :本發(fā)明實(shí)施例4中不同提取時(shí)間與測得的肌醇含量的關(guān)系圖。
[0058] 圖10 :本發(fā)明實(shí)施例7中純水作流動相的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0060] 實(shí)施例1 :對煙草制品中肌醇含量的分析
[0061] 分析方法如圖1所示：
[0062] (1)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.lg肌醇，精確至0.OOOlg，用0.lmol/L乙酸銨水溶液溶 解后轉(zhuǎn)移至l〇〇mL棕色容量瓶中定容，配制成lmg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別移取0.lmL、0. 5mL、 lmL、2mL、3mL和5mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液至100mL容量瓶中，用0.lmol/L乙酸銨水溶液定容，得 到肌醇濃度分別為 1yg/mL、5yg/mL、10yg/mL、20yg/mL、30yg/mL和 50yg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶 液，避光4°C保存，取