一種基于熒光猝滅的蛋白激酶活性分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以納米二氧化鐘(Nano Ceria)為磷酸化多肽特異性識(shí)別以及熒光猝滅元件，操作簡(jiǎn)單、成本低廉的即混即測(cè)型蛋白激酶活性檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是指細(xì)胞外信號(hào)分子通過與細(xì)胞表面或胞內(nèi)受體的結(jié)合，引發(fā)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)胞內(nèi)特定蛋白酶的活性或誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)的過程。在此過程中，蛋白質(zhì)磷酸化發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞內(nèi)大部分的生命過程，如代謝、物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)、生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡、神經(jīng)活動(dòng)等都與蛋白質(zhì)磷酸化密切相關(guān)。
[0003]蛋白激酶是調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化的最重要的生物分子。蛋白激酶是能夠?qū)-磷酸基團(tuán)從腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)上轉(zhuǎn)移至底物蛋白特定氨基酸殘基上的一大類酶，目前已發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶超過500種，人體約30%的蛋白質(zhì)受到激酶的調(diào)控。其一方面通過磷酸化作用調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)的活性，另一方面通過蛋白質(zhì)的逐級(jí)磷酸化，使信號(hào)逐級(jí)放大引起細(xì)胞反應(yīng)。因此，蛋白激酶的活性失調(diào)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路出現(xiàn)傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致老年癡呆、腫瘤等多種疾病。例如，蛋白激酶B (PKB)在許多惡性腫瘤中都有著過高的活性，腫瘤細(xì)胞的增殖往往都伴隨著多種酪氨酸激酶(PTK)活性的異常活躍；而蛋白激酶A(PKA)的活性失調(diào)與老年癡呆癥的發(fā)生密切相關(guān)。
[0004]由于許多重大疾病的發(fā)生都與蛋白激酶活性異?；钴S密切有關(guān)，因此對(duì)蛋白激酶活性進(jìn)行準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)是深入揭示疾病發(fā)生機(jī)制，對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行早期診斷的重要途徑。此外，設(shè)計(jì)和開發(fā)以蛋白激酶為靶點(diǎn)的新藥，通過抑制過高的蛋白激酶活性進(jìn)而有效調(diào)節(jié)、控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療疾病，無(wú)疑是一種高效的途徑。這也使得蛋白激酶成為治療癌癥、糖尿病、老年癡呆等復(fù)雜疾病的重要藥物靶點(diǎn)，據(jù)報(bào)道，當(dāng)前很大一部分新藥的研發(fā)都是以蛋白激酶作為作用靶點(diǎn)的。因此，開發(fā)建立操作簡(jiǎn)單、成本低廉、快速靈敏的蛋白激酶活性分析方法，是相關(guān)領(lǐng)域研宄的關(guān)鍵基礎(chǔ)和前提。
[0005]傳統(tǒng)的蛋白激酶活性檢測(cè)方法可大致歸結(jié)為如下幾類:(I)放射性標(biāo)記技術(shù)，曾是蛋白激酶活性分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。但存在放射性污染問題，對(duì)人體及環(huán)境都存在一定危害，因此雖尚有一些應(yīng)用，但正逐漸被其它技術(shù)所取代。(2)基于抗體的識(shí)別技術(shù)。利用對(duì)特定磷酸化氨基酸位點(diǎn)具有特異性識(shí)別能力的親和抗體，結(jié)合熒光、光散射、電化學(xué)及比色等各種檢測(cè)技術(shù)，是當(dāng)前蛋白激酶活性分析領(lǐng)域最為活躍的研宄方向。雖然該類方法目前已經(jīng)取得了很好的進(jìn)展，但仍面臨著如下挑戰(zhàn):首先，磷酸化識(shí)別抗體制備復(fù)雜，檢測(cè)不同的激酶需要不同的抗體，成本高，且其活性會(huì)受到儲(chǔ)存環(huán)境、反應(yīng)介質(zhì)及個(gè)人操作等多種因素的影響，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性造成較大影響。其次，基于抗體識(shí)別的蛋白激酶活性檢測(cè)方法往往需要在抗體上面預(yù)先連接熒光或電化學(xué)活性的標(biāo)記物，這就大大增加了操作的復(fù)雜性，限制了其應(yīng)用范圍。另外，多數(shù)磷酸化識(shí)別抗體都是活性蛋白，以此類激酶活性檢測(cè)方法進(jìn)行酶抑制劑藥物篩選和開發(fā)時(shí)，有時(shí)很難區(qū)分抑制作用是來(lái)源于待篩選的分子對(duì)激酶還是對(duì)抗體活性的抑制，不適于大規(guī)模的抑制劑藥物篩選。
[0006]因此，考慮到蛋白激酶抑制劑篩選工作量大以及檢測(cè)成本等各方面的需要，理想的蛋白激酶活性檢測(cè)方法應(yīng)擺脫對(duì)識(shí)別抗體和放射性標(biāo)記的依賴性，且需滿足操作簡(jiǎn)便、成本低廉、靈敏度高等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低、快速靈敏、無(wú)需復(fù)雜儀器的即混即測(cè)型(mix-and-read)蛋白激酶活性分析方法。
[0008]解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成:
[0009]由下述步驟組成:
[0010]1、將已知活性的蛋白激酶與其對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記多肽底物混合進(jìn)行磷酸化反應(yīng)。
[0011]2、將納米二氧化鈰水溶液與步驟I中磷酸化反應(yīng)后的溶液混合，檢測(cè)混合體系的熒光強(qiáng)度，根據(jù)不同活性蛋白激酶對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012]3、按照上述步驟I和2測(cè)試待測(cè)蛋白激酶對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)待測(cè)蛋白激酶活性的定量分析。
[0013]上述步驟I中，所述的熒光標(biāo)記多肽底物中的熒光標(biāo)記物為熒光素類、羅丹明類、香豆素類及其衍生物中的任意一種或花青染料或半導(dǎo)體量子點(diǎn)，具體如:羧基四甲基羅丹明、2，7- 二甲基-4，5- 二氯-6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、德克薩斯紅、3H-吲哚菁染料等；所述的蛋白激酶是能夠?qū)⒔z氨酸、蘇氨酸或酪氨酸蛋白磷酸化的激酶，具體如:蛋白激酶A、蛋白激酶C、SRC激酶等。
[0014]上述步驟2中，優(yōu)選按照每微摩爾熒光標(biāo)記多肽底物加入10?80mg納米二氧化鐘，且控制混合體系中納米二氧化鐘的濃度為15?120 μ g/mL ;進(jìn)一步優(yōu)選按照每微摩爾熒光標(biāo)記多肽底物加入20?60mg納米二氧化鈰，且控制混合體系中納米二氧化鈰的濃度為40?80 μ g/mL ;其中所述的納米二氧化鐘的粒徑為5?lOOnm。
[0015]本發(fā)明的有益效果如下:
[0016]1、本發(fā)明首次提出利用納米二氧化鈰可通過其表面鈰離子與磷酸基團(tuán)的強(qiáng)結(jié)合能力選擇性捕獲蛋白激酶催化生成的磷酸化多肽底物，以及二氧化鈰對(duì)吸附在其表面的熒光染料的強(qiáng)猝滅能力，構(gòu)建非放射性、非抗體依賴性蛋白激酶活性分析方法，該方法除了必需的蛋白激酶反應(yīng)體系外，只需要二氧化鈰這一種額外的檢測(cè)試劑，克服了傳統(tǒng)放射性標(biāo)記及抗體識(shí)別方法中存在的放射性危害、步驟繁瑣、成本高昂、需要專業(yè)人員操作等不足，具有快速可靠、經(jīng)濟(jì)靈敏等諸多的優(yōu)勢(shì)，在普通的化學(xué)及生物相關(guān)實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。
[0017]2、本發(fā)明所建立的蛋白激酶活性分析方法操作極為簡(jiǎn)便，只需將蛋白激酶反應(yīng)體系直接與納米二氧化鈰溶液混合后即可馬上進(jìn)行熒光信號(hào)的讀出，真正實(shí)現(xiàn)了即混即測(cè)型的蛋白激酶活性分析。
[0018]3、熒光分析方法非常適合于與一些自動(dòng)化儀器相結(jié)合進(jìn)行高通亮檢測(cè)，因此本發(fā)明提出的這種操作簡(jiǎn)單、成本低廉的分析方法在高通量蛋白激酶抑制劑的篩選研宄中也展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
【附圖說明】
[0019]圖1是熒光強(qiáng)度隨PKA活性變化的熒光光譜圖。
[0020]圖2是(Ftl-F)/Ftl值隨PKA活性變化的線性曲線圖。
[0021]圖3是蛋白激酶C(PKC)對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記未磷酸化多肽底物在加入納米二氧化鈰前(曲線a)、后(曲線b)的熒光光譜圖。
[0022]圖4是蛋白激酶PKC對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記磷酸化多肽底物在加入納米二氧化鈰前(曲線a)、后(曲線b)的熒光光譜圖。
[0023]圖5是熒光強(qiáng)度隨抑制劑H-89濃度變化的熒光光譜圖。
[0024]圖6是熒光強(qiáng)度隨抑制劑H-89的濃度對(duì)數(shù)值變化的曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。
[0026]實(shí)施例1
[0027]以PKA為例，其活性分析方法如下:
[0028]1、將6 yL50 μπιο?噸4羧基四甲基羅丹明標(biāo)記的多肽(由吉爾生化上海有限公司提供，多肽的氨基酸序列為L(zhǎng)RRASLG)水溶液、4.8 μ L500 ymol.T1ATP水溶液加入離心管中，然后加入不同體積的0.1U.μ L-1或IU.μ L ^的PKA水溶液并用5OmmoI.L ^1Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.5，25°C，含1mmol.T1MgCl2)定容至100 μ L，使所得混合體系中PKA活性分別為 0,0.0001,0.0005,0.001,0.002,0.005,0.01,0.02,0.03,0.05,0.1,0.5U.μ ?Λ在恒溫培養(yǎng)振蕩器上37°C溫育60分鐘，進(jìn)行磷酸化反應(yīng)。
[0029]2、向步驟I中磷酸化反應(yīng)后的溶液中加入100 UL 120 μ g/mL納米二氧化鈰(粒徑為20nm