己二烯雌酚抗體在多種雌酚同時檢測中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測和分析化學技術領域，涉及一種能同時識別三種雌性激 素類似化合物，即己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的己二烯雌酚抗體在三種雌酚同時檢 測中的應用，具體的說是一種基于抗體交叉反應的免疫電化學檢測方法，以及對食品中含 有的上述三種雌性激素類似化合物的同時檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 己稀雌酷（diethylstilbestrol, DES)、己二稀雌酷（dienestrol, DE)和己燒雌酷 (hexestrol，HEX)(結構式見圖1)屬于1，2-二苯乙烯類藥物，它們是人工合成的雌激素類 物質。二苯乙烯類激素具有促進動物生長、提高飼料轉化率和減少脂肪合成等作用，20世紀 60年代曾為各國官方批準使用的促生長劑，用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。但是濫用1，2-二苯乙烯類藥 物會導致動物生理系統(tǒng)功能失調(diào)甚至不可逆的病變，并通過食物鏈最終危害人類健康，長 期攝入會干擾人體正常的激素平衡，導致機體代謝紊亂、發(fā)育異常腫瘤、女性乳腺癌和子宮 內(nèi)膜異位、胎兒畸形等嚴重的問題，在我國和歐美等國家都禁止在動物養(yǎng)殖過程中使用。
[0003] 目前用于DES、DE和HEX殘留檢測的方法主要有氣相色譜-質譜聯(lián)用法、液相色 譜-質譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等。但是這些分析方法需要大型分析儀 器，過程操作繁瑣，不能實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，有必要研宄建立更加高效、快速、靈敏的快速檢測方 法。免疫分析是有效快速的重要檢測方法之一，但是目前雌酚的免疫分析大都是特異性分 析檢測，即每種檢測方法只能檢測一種特定化合物，不適合快速初篩，因此，同時檢測多種 雌酚的多殘留免疫分析方法就成為亟待發(fā)展的關鍵技術，其中，能同時識別多種雌酚的抗 體是關鍵環(huán)節(jié)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種基于己二烯雌酚抗體能同時檢測三種雌性激素類似化合物， 即己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的免疫電化學檢測方法，具有很低的檢出限（己烯雌 酚的檢測限為0. 2ng/mL，己二烯雌酚的檢測限為0. 05ng/mL，己烷雌酚的檢測限為0. 5ng/ mL)和較寬的線性范圍（己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚分別為1~4000ng/mL、10~ 4000ng/mL 和 100 ~4000ng/mL)。
[0005] 所述的能共同檢測己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的免疫電化學檢測方法包括 以下步驟：
[0006] 1)納米復合物修飾的免疫電化學傳感器的制備：首先對玻碳電極進行打磨、拋 光和超聲清洗；然后用電化學方法在玻碳電極表面沉積金納米粒子；最后將雌酚一石墨 烯一殼聚糖混合液滴涂于納米金沉積的電極表面制得所述的免疫電化學傳感器；
[0007] 2)標準溶液的配制：配制一組包括空白標樣在內(nèi)的含有不同濃度游離雌酚的PH 為7. 4的磷酸緩沖溶液為標準溶液，其中含有相同濃度的己二烯雌酚抗體；
[0008] 3)工作曲線的建立：將所述免疫傳感器分別浸入標準溶液中孵育，孵育后用磷酸 緩沖溶液沖洗免疫傳感器，在K3Fe (CN)6溶液中進行差分脈沖伏安（DPV)掃描，記錄響應電 流；空白標樣的響應電流為Id，含有游離雌酚的標樣的響應電流為Ix，響應電流的增加值 Δ I等于含有游離雌酚的標樣的響應電流一與空白標樣的響應電流IC1的差值。將所述Λ I 與標準溶液中雌酚的濃度C繪制成ΛΙ-C工作曲線，采用線性回歸法得到ΛΙ-C線性回歸 方程；
[0009] 4)雌酚濃度的測定：將待測樣品配制為含有與步驟2)相同濃度的己二烯雌酚抗 體的磷酸緩沖溶液，按照步驟3)的方法對所述免疫傳感器進行孵育和差分脈沖伏安掃描， 記錄響應電流；根據(jù)響應電流的增加值和ΛΙ-C線性回歸方程，得到雌酚含量。
[0010] 本發(fā)明有如下的有益效果：由于采用了對三種雌性激素類化合物即己烯雌酚、己 二烯雌酚和己烷雌酚都具有較高交叉反應率的己二烯雌酚抗體，因而能實現(xiàn)對上述三種雌 性激素類化合物的共同檢測。并且具有很低的檢出限和較寬的線性范圍。
【附圖說明】
[0011] 圖1己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的結構式。
[0012] 圖2為納米金/己烯雌酚/石墨烯/殼聚糖復合物修飾的免疫電化學傳感器在含 有效價濃度為I :6400的己二烯雌酚抗體和不同濃度的游離的己烯雌酚（a)納米金/石墨 烯/己烯雌酚/殼聚糖修飾電極修飾電極，在含有相同濃度的己二烯雌酚抗體和不同濃度 的游離的己稀雌酷（b)4000ng/mL，（c)3000ng/mL，（d) 1000ng/mL，（e)500ng/mL，（f) IOOng/ mL，（g) 50ng/mL，（h) Ing/mL，（i) Ong/mL 的孵育液中孵育后，在 2mM 的 K3 [Fe (CN) 6]的 PBS 溶 液中的DPV曲線圖。插入圖為響應電流的變化Δ I與己烯雌酚濃度的線性曲線圖。
[0013] 圖3為納米金/己二烯雌酚/石墨烯/殼聚糖復合物修飾的免疫電化學傳感器 在含有效價濃度為I :6400的己二烯雌酚抗體和不同濃度的游離的己二烯雌酚（a)納米金 /石墨烯/己二烯雌酚/殼聚糖修飾電極修飾電極，在含有相同濃度的己二烯雌酚抗體和 不同濃度的游離的己二稀雌酷（b)4000ng/mL，（c)3000ng/mL，（d)2000ng/mL，（e) 1000ng/ mL，（f)500ng/mL，（g)100ng/mL，（h)50ng/mL，（i)10ng/mL，（j)0ng/mL 的孵育液中孵育后， 在2mM的K3[Fe(CN)6]的PBS溶液中的DPV曲線圖。插入圖為響應電流的變化Λ I與己二 烯雌酚濃度的線性曲線圖。
[0014] 圖4為納米金/己烷雌酚/石墨烯/殼聚糖復合物修飾的免疫電化學傳感器在含 有效價濃度為I :6400的己二烯雌酚抗體和不同濃度的游離的己烷雌酚（a)納米金/石墨 烯/己烷雌酚/殼聚糖修飾電極修飾電極，在含有相同濃度的己二烯雌酚抗體和不同濃度 的游離的己燒雌酷（b)4000ng/mL，（c)3000ng/mL，（d)2000ng/mL，（e) 1000ng/mL，（