一種快速篩選含有EGCG3"Me茶樹(shù)資源的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及經(jīng)濟(jì)作物種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速篩選含有EGCG3" Me茶樹(shù)資源的方法。
【背景技術(shù)】
[0002](-)_表沒(méi)食子兒茶素3-0 (3-0-甲基)沒(méi)食子酸酯(EGCG3" Me)和(_)_表沒(méi)食子兒茶素3-0(4-0-甲基)沒(méi)食子酸酯(EGCG4" Me)是茶樹(shù)中兩種重要的兒茶素衍生物。研宄發(fā)現(xiàn)，EGCG3" Me和EGCG4" Me對(duì)治療花粉過(guò)敏等過(guò)敏反應(yīng)癥有極其顯著的效果，其生物學(xué)功能己經(jīng)在體外和體內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。EGCG3" Me和EGCG3" Me抑制小鼠皮膚被動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)的效果是EGCG的兩倍。甲基化EGCG不僅能抑制組胺釋放從而抑制肥大細(xì)胞的活性，還能抑制肥大細(xì)胞的PTK活性，抑制由FC ε RI引發(fā)的神經(jīng)刺激以及直接抑制PS/TK活性。近年來(lái)，花粉癥已成為變態(tài)反應(yīng)性疾病中最常見(jiàn)的疾病之一，如大約有30%的日本人患有不同程度的花粉過(guò)敏癥，因此有關(guān)茶葉甲基化EGCG的研宄受到高度重視。然而，由于富含甲基化EGCG的茶樹(shù)資源稀少，國(guó)內(nèi)甲基化EGCG的研宄報(bào)道甚少。我國(guó)是茶樹(shù)原產(chǎn)地，生態(tài)資源優(yōu)越，茶樹(shù)種資源豐富。截至2013年底，國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹(shù)圃和勒海分圃已收集保存國(guó)內(nèi)19個(gè)省市、8個(gè)國(guó)家的茶組植物資源共3000多份，其中野生資源約占10%、地方品種60%、選育品種和育種材料30%，有77個(gè)國(guó)家級(jí)茶樹(shù)良種和110個(gè)省級(jí)良種。這些茶樹(shù)種質(zhì)資源是茶樹(shù)種質(zhì)創(chuàng)新、品種選育、生產(chǎn)利用的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，建立快速高通量的茶葉內(nèi)含成分分析方法，快速獲取茶樹(shù)優(yōu)異資源，是當(dāng)前茶樹(shù)育種和種質(zhì)創(chuàng)新的重要方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種快速篩選含有EGCG3 " Me茶樹(shù)資源的方法。
[0004]為達(dá)到上述目的，具體采用如下的技術(shù)方案:
[0005]一種快速篩選含有EGCG3 " Me茶樹(shù)資源的方法，包括以下步驟:
[0006](I)樣品溶液的制備:稱(chēng)取茶葉樣品研磨成粉末，然后加入甲醇回流提取，所述茶葉樣品與甲醇的質(zhì)量體積比(g/ml)為1:125?1:250過(guò)濾，得到樣品溶液；
[0007](2)對(duì)照品溶液的制備:將EGCG、ECG、EGCG3" Me、EGC、EC溶解在甲醇中得到對(duì)照品溶液；
[0008](3)將樣品溶液和對(duì)照品溶液點(diǎn)在同一聚酰胺薄層板上，用展開(kāi)劑展開(kāi)，所述展開(kāi)劑中按體積比甲醇:乙酸:丙酮=(8?10):(4?6):3，取出，晾干，在薄層掃描儀中掃描，顯色，將樣品與對(duì)照品對(duì)比，將樣品與對(duì)照品對(duì)比，如果樣品出現(xiàn)與EGCG3 " Me相同的Rf，則樣品中含有EGCG3 " Me，如果樣品不出現(xiàn)與EGCG3 " Me相同的Rf，則樣品中不含EGCG3" Me0
[0009]進(jìn)一步的，在本發(fā)明技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，還可以快速篩選出富含EGCG3" Me茶樹(shù)資源，其中一種具體的實(shí)施方式為:當(dāng)步驟(3)出現(xiàn)與EGCG3" Me相同的Rf，則樣品中含有EGCG3" Me，此時(shí)計(jì)算EGCG3" Me的峰面積，如果EGCG3" Me ^ 0.5%,則認(rèn)為樣品中富含EGCG3" Me。
[0010]本發(fā)明所述茶葉樣品由茶樹(shù)鮮葉一芽二三葉冷凍干燥18_24h得到。
[0011]茶樹(shù)鮮葉取樣時(shí)要求取樣的茶樹(shù)為茶樹(shù)資源生長(zhǎng)條件及生長(zhǎng)勢(shì)基本一致、且取樣時(shí)間點(diǎn)一致。
[0012]步驟(3)中的顯色可選用現(xiàn)有技術(shù)中所有的顯色方法，例如將晾干后的聚酰胺薄層板放入薄層掃描儀中掃描，用5%的三氯化鐵乙醇溶液顯色，用電吹風(fēng)吹干薄層板至斑點(diǎn)顯色。
[0013]優(yōu)選的，為了使EGCG3" Me的響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)，掃描后峰面積最大，使得樣品的檢測(cè)更加靈敏，通過(guò)光譜掃描(200-600nm)，確定EGCG3" Me的最大吸收波長(zhǎng)為280nm。
[0014]作為步驟(I) 一種優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟(I)為:稱(chēng)取茶葉樣品研磨成粉末，然后加入甲醇回流提取10-20min，所述茶葉樣品與甲醇的質(zhì)量體積比為1:125?1:250，此時(shí)樣品中EGCG3" Me提取效率最高，而且樣品濃度適中，有利于薄層色譜點(diǎn)樣。
[0015]步驟(I)的一種具體的實(shí)施方式為:準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1Og茶葉樣品，研磨成粉末，然后加入50ml甲醇，加熱回流提取lOmin，過(guò)濾，即得樣品溶液。
[0016]步驟(I)得到的樣品溶液可以在冷凍(_20°C )的條件保存?zhèn)溆谩?br>[0017]具體的，步驟(2)中EGCG、ECG、EGCG3 " Me、EGC、EC與甲醇的質(zhì)量體積比均為(0.1?l)mg:lml ;優(yōu)選地，EGCG、ECG、EGCG3 " Me、EGC、EC與甲醇的質(zhì)量體積比均為0.5mg:Iml0
[0018]優(yōu)選地，步驟(3)中取樣品溶液和對(duì)照品溶液各5?10 μ I點(diǎn)在同一聚酰胺薄層板上，用展開(kāi)劑展開(kāi)。
[0019]作為展開(kāi)劑的優(yōu)選實(shí)施方式有以下三種:
[0020](I)按體積比甲醇:乙酸:丙酮=8:5:3 ；
[0021](2)按體積比甲醇:乙酸:丙酮=10:5:3 ;
[0022](3)按體積比甲醇:乙酸:丙酮=10:6:3 ;
[0023]當(dāng)展開(kāi)劑選用上述三種方式的任意一種時(shí)，樣品中EGCG3" Me均能與樣品中其它兒茶素達(dá)到良好的分離，有利于EGCG3" Me的定性定量。
[0024]本發(fā)明提供的方法前處理簡(jiǎn)單、快速，每次可以同時(shí)測(cè)定10個(gè)以上的茶葉樣品，適合大量樣品的分析測(cè)定；而高效液相色譜每次只能測(cè)定I個(gè)茶葉樣品，分析時(shí)間長(zhǎng)，且前處理復(fù)雜，與高效液相色譜法相比，本發(fā)明提供的方法能夠簡(jiǎn)便、快速、高通量的篩選出含有(富含)EGCG3" Me的茶樹(shù)資源。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為實(shí)施例1的薄層分離圖譜；
[0026]圖中1、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG) ;2、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG) ;3、EGCG3" Me ;4、表沒(méi)食子兒茶素(EGC) ;5、表兒茶素(EC) ;6_8均為茶葉樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1
[0029]以湖南省茶葉研宄所高橋茶葉實(shí)驗(yàn)茶場(chǎng)茶樹(shù)品種資源為考察對(duì)象，于2014年3月30號(hào)取樣，總共采集20個(gè)樣品，采集茶樹(shù)鮮葉一芽二三葉，冷凍干燥18-24h得茶葉樣品。
[0030]快速篩選富含EGCG3 " Me茶樹(shù)資源的方法，具體包括以下步驟:
[0031](I)準(zhǔn)確稱(chēng)取0.20g茶葉樣品，研磨成粉末，然后加入50ml甲醇，加熱回流提取lOmin，過(guò)濾，得到樣品溶液；
[0032](2)準(zhǔn)確稱(chēng)取EGCG 0.5mg，加Iml甲醇溶解，得到EGCG對(duì)照品溶液，濃度為0.5mg/ml，作為定性和半定量的標(biāo)準(zhǔn)；
[0033]準(zhǔn)確稱(chēng)取ECG 0.5mg，加Iml甲醇溶解，得到ECG對(duì)照品溶液，濃度為0.5mg/ml，作為定性和半定量的標(biāo)準(zhǔn)；
[0034]準(zhǔn)確稱(chēng)取EGCG3" Me 0.5mg，加Iml甲醇溶解，得到EGCG3" Me對(duì)照品溶液，濃度0.5mg/ml，作為定性和半定量的標(biāo)準(zhǔn)；
[0035]準(zhǔn)確稱(chēng)取EGC 0.5mg，加Iml甲醇溶解，得到EGC對(duì)照品溶液，濃度為0.5mg/ml，作為定性和半定量的標(biāo)準(zhǔn)；
[0036]準(zhǔn)確稱(chēng)取EC 0.5mg，加Iml甲醇溶解，得到EC對(duì)照品溶液，濃度為0.5mg/ml，作為定性和半定量的標(biāo)準(zhǔn)；
[0037](3)吸取對(duì)照品溶液和樣品的溶液各6 μ 1，點(diǎn)在同一聚酰胺薄層板上、距板底Icm處同一水平線(xiàn)上，展開(kāi)劑是甲醇、乙酸和丙酮，甲醇、乙酸和丙酮的體積比是8:5:3，平衡5?lOmin，展開(kāi)，展開(kāi)至距板頂Icm處取出，瞭干，放入薄層掃描儀中掃描，波長(zhǎng)280nm，用5%的三氯化鐵乙醇溶液顯色，用電吹風(fēng)吹干薄層板至斑點(diǎn)顯色。
[0038]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在圖1中從左到右依次為表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)、EG