檢測抗-tnf藥物和自身抗體的試驗的制作方法
【專利說明】檢測抗-TNF藥物和自身抗體的試驗
[0001] 本申請是中國專利申請201080060442. 5的分案申請，原申請的申請日是2010年 10月26日，發(fā)明名稱是"檢測抗-TNF藥物和自身抗體的試驗"。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2009年10月26日遞交的美國臨時申請?zhí)?1/255, 048,2009年11 月19日遞交的美國臨時申請?zhí)?1/262, 877,2010年4月15日遞交的美國臨時申請?zhí)?61/324, 635, 2010年5月17日遞交的美國臨時申請?zhí)?1/345, 567, 2010年6月3日遞交的 美國臨時申請?zhí)?1/351，269, 2010年10月4日遞交的美國臨時申請?zhí)?1/389, 672和2010 年10月15日遞交的美國臨時專利申請?zhí)?1/393, 581的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用納入本文 用于所有目的。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 自身免疫疾病是重要和廣泛傳播的醫(yī)學(xué)難題。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)是一種影 響到200萬以上美國人的自身免疫疾病。RA引起關(guān)節(jié)慢性炎癥且通常為進(jìn)行性疾病，可能 導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和功能殘疾。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因未知，但該病的病因?qū)W涉及遺傳傾向、傳染 因子和環(huán)境因素?；钴S性RA的癥狀包括疲勞、缺乏食欲、低燒、肌肉關(guān)節(jié)疼痛和僵硬。還有 在該病突發(fā)過程中，由于滑膜炎癥，關(guān)節(jié)經(jīng)常紅腫、疼痛和觸痛。此外，由于RA是全身性疾 病，炎癥可能影響關(guān)節(jié)以外的機體器官和區(qū)域，包括眼睛和口腔的腺體、肺襯膜、心包膜和 血管。
[0006] 處理RA和其他自身免疫疾病的傳統(tǒng)療法包括采用作用快速的"第一線藥物"和作 用較慢的"第二線藥物"。第一線藥物能減輕疼痛和炎癥。這類第一線藥物的示例包括可口 服給藥或直接注射入組織和關(guān)節(jié)的阿斯匹林、萘普生、布洛芬、依托度酸和其他非類固醇消 炎藥（NSAID)，以及皮質(zhì)激素。第二線藥物能促進(jìn)疾病緩解，防止關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞，也稱為改 良疾病抗類風(fēng)濕藥物或DMARD。第二線藥物的示例包括：金、氫化氯奎、柳氮磺吡啶，和免疫 抑制劑，如氨甲喋呤、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和環(huán)孢霉素。然而，這些藥物中的許 多有有害的副作用。因此，已在尋找對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫失調(diào)的其他療法。
[0007] 腫瘤壞死因子- a (TNF-α )是由許多細(xì)胞類型包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生 的一種細(xì)胞因子，起初是根據(jù)它能誘導(dǎo)某些小鼠腫瘤壞死而鑒定。后來，與惡病質(zhì)有關(guān)的稱 為惡液質(zhì)的因子顯示與TNF-α相同。TNF-α在病理生理學(xué)上涉及到多種其他人類疾病和 失調(diào)，包括休克、敗血癥、感染、自身免疫病、RA、克羅恩病、移植物排斥和移植物抗宿主病。
[0008] 由于人TNF-a (hTNF-a )在多種人類失調(diào)中起有害作用，已設(shè)計了治療策略來抑 制或?qū)筯TNF-a的活性。具體說，已尋找到能抑制和中和hTNF-a活性的抗體，作為抑制 hTNF-a的工具。一些最早的這類抗體是用hTNF-a免疫小鼠的淋巴細(xì)胞制備的雜交瘤所 分泌的小鼠單克隆抗體（mAb)(參見Moeller等人的美國專利號5, 231，024)。雖然這些小 鼠抗-hTNF-a抗體常常顯示對hTNF-a有高親和力能中和hTNF-a的活性，但小鼠抗體給 予人所產(chǎn)生的相關(guān)問題，如血清半衰期短、不能觸發(fā)人類某些效應(yīng)器的功能和在人體中引 發(fā)產(chǎn)生抗小鼠抗體的不良免疫應(yīng)答（"人抗-小鼠抗體"(HAM)反應(yīng)）限制了其體內(nèi)應(yīng)用。
[0009] 近年來，已采用生物學(xué)療法來治療自身免疫疾失調(diào)如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。例如，四種 TNF- α抑制劑：嵌合性抗-TNF- a mAb REMICADE? (英夫利昔單抗），TNFR-IgFc融合蛋白 ENBREL? (依那西普），人抗-TNF a mAb HUMIRA? (阿達(dá)木單抗）和 PEG化（PEGylated)的 Fab 片段一.CIMZIA? (賽妥珠單抗）已經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。CIMZIA?也用 于治療中等至嚴(yán)重的克羅恩?。á牵ｋm然已證明這些生物治療劑能成功地治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎和其他自身免疫疾病如CD，但不是所有的治療對象對這種治療有反應(yīng)或反應(yīng)良好。而且， 給予TNF-α抑制劑可能會誘導(dǎo)對該藥物的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致產(chǎn)生自身抗體，如人抗-嵌合抗 體（HACA)、人抗-人源化抗體（HAHA)和人抗-小鼠抗體（HAMA)。這類HACA、HAHA或HAMA 免疫應(yīng)答可能與免疫治療TNF-α抑制劑的超敏反應(yīng)和藥代動力學(xué)顯著改變和生物擾亂相 關(guān)，阻礙了用該類藥物作進(jìn)一步治療。因此，本領(lǐng)域需要檢測患者樣品中存在抗-TNF-α生 物制劑和/或其自身抗體的試驗，以監(jiān)視TNF-α抑制劑的治療效果和指導(dǎo)治療決策。本發(fā) 明滿足了這種需求并提供相關(guān)的效益。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 已證明TNF-α涉及炎癥疾病，自身免疫疾病，病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染，惡性腫瘤 和/或神經(jīng)變性疾病，它是采用特異性生物學(xué)方法治療疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和克羅恩病 的有用靶標(biāo)。TNF-α抑制劑，如抗-TNFa抗體是一類重要的治療劑。因此，需要檢測存在 抗-TNF α生物制劑和/或及自身抗體的試驗方法。
[0012] 因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供檢測樣品中抗-TNFa藥物的存在或水平的 方法，包括：
[0013] (a)使標(biāo)記TNF α與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物的樣品接觸，形成含抗-TNF a 藥物的標(biāo)記復(fù)合物（即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物），（其中標(biāo)記TNF α和抗-TNF α藥物彼此不 共價結(jié)合）；
[0014] (b)標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析以（如從游離的標(biāo)記TNFa中）分離標(biāo)記 的復(fù)合物；和
[0015] (c)檢測標(biāo)記的復(fù)合物，從而檢測抗-TNF α藥物的存在或水平。
[0016] 在某些情況下，所述方法可用于檢測例如接受抗-TNFa藥物治療對象的樣品中 REMICADE?(英夫利昔單抗）、ENBREL?(依那西普）、HUMIRA?(阿達(dá)木單抗）和CIMZIA? (賽妥珠單抗）的水平。
[0017] 在另一實施方式中，本發(fā)明提供檢測樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在或水 平的方法，包括：
[0018] (a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物自身抗體的樣品接觸， 形成含自身抗體的標(biāo)記復(fù)合物（即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物），（其中標(biāo)記抗-TNFa藥物與自 身抗體彼此不共價結(jié)合）；
[0019] (b)標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析以（如從游離的標(biāo)記TNF α藥物中）分離 標(biāo)記的復(fù)合物；和
[0020] (C)檢測標(biāo)記的復(fù)合物，從而檢測自身抗體的存在或水平。
[0021] 在某些情況下，所述方法可用于檢測例如接受抗-TNFa藥物治療對象樣品中的 自身抗體水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗體（HACA)、人抗-人源化抗體（HAHA)和人 抗-小鼠抗體（HAMA)。
[0022] 在另一實施方式中，本發(fā)明提供檢測樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在或水 平的方法，包括：
[0023] (a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物和標(biāo)記TNF α與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物自身 抗體的樣品接觸，在標(biāo)記抗-TNFa藥物、標(biāo)記TNFa與自身抗體之間形成第一標(biāo)記復(fù)合 物（即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物）；（其中第一標(biāo)記復(fù)合物的組分彼此不共價結(jié)合）和在標(biāo)記 抗-TNFa藥物與自身抗體之間形成第二標(biāo)記復(fù)合物（即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物），（其中第 二標(biāo)記復(fù)合物的組分彼此不共價結(jié)合），其中標(biāo)記抗-TNF α藥物和標(biāo)記TNF α所含的標(biāo)記 不相同；
[0024] (b)第一標(biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析，以分離第一標(biāo)記 復(fù)合物與第二標(biāo)記復(fù)合物（例如彼此分離，和與游離的標(biāo)記TNF α和游離的標(biāo)記抗-TNF a 藥物分離）；和
[0025] (C)檢測第一標(biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記復(fù)合物，從而當(dāng)?shù)谝粯?biāo)記復(fù)合物和第二標(biāo)記 復(fù)合物都存在時，檢測非中和形式自身抗體（即不干擾抗-TNFa藥物與TNFa之間結(jié)合的 自身抗體）的存在或水平；當(dāng)只存在第二標(biāo)記復(fù)合物時，檢測中和形式自身抗體（即干擾 抗-TNF α藥物與TNF α之間結(jié)合的自身抗體）的存在或水平。
[0026] 在某些情況下，所述方法可用于檢測接受抗-TNF α藥物治療對象樣品中的自身 抗體水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗體（HACA)、人抗-人源化抗體（HAHA)和人抗-小 鼠抗體（HAMA)。
[0027] 在一個相關(guān)實施方式中，本發(fā)明提供檢測樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的存在 或水平的方法，包括：
[0028] (a)使標(biāo)記抗-TNF α藥物與含有或懷疑含有抗-TNF α藥物自身抗體的樣品接觸， 在標(biāo)記抗-TNF α藥物與自身抗體之間形成第一標(biāo)記復(fù)合物（即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物）（其 中標(biāo)記抗-TNF α藥物與自身抗體彼此不共價結(jié)合）；
[0029] (b)第一標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行分子大小排阻層析，以（如從游離的標(biāo)記抗-TNFa藥物 中）分離第一標(biāo)記復(fù)合物；
[0030] (C)檢測第一標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測存在的自身抗體或其水平；
[0031] (d)使標(biāo)記TNF α與第一標(biāo)記復(fù)合物接觸，在標(biāo)記TNF α藥物與標(biāo)記TNF α之間形 成第二標(biāo)記復(fù)合物（即免疫復(fù)合物或偶聯(lián)物）（其中標(biāo)記抗-TNF α藥物與標(biāo)記TNF α彼此 不共價結(jié)合），其中標(biāo)記TNF α藥物與標(biāo)記TNF α所含的標(biāo)記不相同；
[0032] (e)第二標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)行第二分子大小排阻層析，以（如從游離的標(biāo)記TNF α中） 分離第二標(biāo)記復(fù)合物；和
[0033] (f)檢測第二標(biāo)記復(fù)合物，從而檢測中和形式的自身抗體（即干擾抗-TNF α藥物 與TNF- α之間結(jié)合的自身抗體）的存在或水平。
[0034] 在某些情況下，所述方法可用于檢測接受抗-TNF α藥物治療對象樣品中的自身 抗體的水平，包括但不限于：人抗-嵌合抗體（HACA)、人抗-人源化抗體（HAHA)和人抗-小 鼠抗體（HAMA)。
[0035] 在另一個實施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對象提供確定 抗-TNF α藥物有效量的方法，所述方法包括：
[0036] (a)測量對象第一樣品中的抗-TNF α藥物水平，包括：
[0037] (i)使第一樣品接觸一定量的標(biāo)記TNF a，形成含標(biāo)記TNF α與抗-TNF α藥物的 第一復(fù)合物；和
[0038] (ii)用分子大小排阻層析檢測第一復(fù)合物，從而測量抗-TNF α藥物的水平；
[0039] (b)測量所述對象第二樣品中抗-TNFa藥物自身抗體的水平，包括：
[0040] ⑴使第二樣品接觸一定量的標(biāo)記抗-TNF α藥物，形成含標(biāo)記抗-TNF α藥物與自 身抗體的第二復(fù)合物；和
[0041] (ii)用分子大小排阻層析檢測第二復(fù)合物，從而檢測自身抗體的水平；和
[0042] (c)從步驟（a)測得的抗-TNFa藥物水平減去步驟（b)測得的自身抗體水平，從 而測得抗-TNFa藥物的有效量。
[0043] 在另一個實施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對象提供最優(yōu)化 抗-TNF α藥物治療劑量的方法，所述方法包括：
[0044] (a)按照本發(fā)明方法測定抗-TNF α藥物的有效量；
[0045] (b)比較抗-TNF α藥物的有效量與抗-TNF α藥物的水平；和
[0046] (c)根據(jù)步驟（b)的比較，確定抗-TNF α藥物的后續(xù)劑量，從而最優(yōu)化抗-TNF a 藥物的治療劑量。
[0047] 在另一個實施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對象提供最優(yōu)化 抗-TNF α藥物治療和/或減輕其毒性的方法，所述方法包括：：
[0048] (a)測定所述對象第一樣品中的抗-TNF α藥物水平；
[0049] (b)測定所述對象第二樣品中抗-TNF α藥物自身抗體的水平；和
[0050] (c)根據(jù)抗-TNF α藥物和自身抗體水平，確定所述對象的后續(xù)療程，從而最優(yōu)化 抗-TNF α藥物的治療和/或減輕其毒性。
[0051] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供參比內(nèi)部對照檢測含有或懷疑含有抗-TNFa 藥物的樣品中抗-TNF α藥物的存在或水平的方法，所述方法包括：
[0052] (a)使一定量的標(biāo)記TNF α和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對照接觸樣品，形成標(biāo)記TNF α與 抗-TNF α藥物的復(fù)合物；
[0053] (b)用分子大小排阻層析檢測標(biāo)記TNF α和標(biāo)記內(nèi)部對照；
[0054] (c)從作為分子大小排阻層析洗脫時間的函數(shù)的信號強度圖像計算標(biāo)記TNF α峰 曲線下面積的積分；
[0055] (d)從作為分子大小排阻層析洗脫時間的函數(shù)的信號強度圖像計算標(biāo)記內(nèi)部對照 峰曲線下面積的積分；
[0056] (e)用標(biāo)記TNFa的量除以標(biāo)記內(nèi)部對照的量確定第一比率；
[0057] (f)用步驟（C)測得的積分除以步驟（d)測得的積分確定第二比率；和
[0058] (g)比較步驟（e)測得的第一比率與步驟（f)測得的第二比率，從而參比內(nèi)部對照 確定抗-TNF α藥物的存在或水平
[0059] 在另一個實施方式中，本發(fā)明向接受抗-TNFa藥物治療的對象提供最優(yōu)化 抗-TNF α藥物治療劑量的方法，所述方法包括：根據(jù)上面章節(jié)步驟（e)的標(biāo)記TNF α與標(biāo) 記內(nèi)部對照比率和上面章節(jié)步驟（f)的標(biāo)記TNFa與標(biāo)記內(nèi)部對照比率的比較，確定所述 對象抗-TNF α藥物的后續(xù)劑量，從而最優(yōu)化抗-TNF α藥物的治療劑量。
[0060] 在某些實施方式中，本發(fā)明提供參比內(nèi)部對照檢測含有或懷疑含有自身抗體的樣 品中抗-TNF α藥物自身抗體的存在或水平的方法，所述方法包括：
[0061] (a)使一定量的標(biāo)記抗-TNFa藥物和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對照與樣品接觸，形成標(biāo) 記抗-TNF a藥物與自身抗體的復(fù)合物；
[0062] (b)用分子大小排阻層析檢測標(biāo)記抗-TNF a和標(biāo)記內(nèi)部對照；
[0063] (c)從作為分子大小排阻層析洗脫時間的函數(shù)的信號強度圖計算標(biāo)記抗-TNFa 藥物峰曲線下面積的積分；
[0064] (d)從作為分子大小排阻層析洗脫時間的函數(shù)的信號強度圖計算標(biāo)記內(nèi)部對照峰 曲線下面積的積分；
[0065] (e)將標(biāo)記抗-TNFa藥物含量除以標(biāo)記內(nèi)部對照含量，測得第一比率；和
[0066] (f)除以步驟（C)和⑷所得的積分，測得第二比率；和
[0067] (g)比較步驟（e)測得的第一比率與步驟（f)測得的第二比率，從而參比內(nèi)部對照 確定自身抗體的存在或水平。
[0068] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供測定樣品中抗-TNFa藥物的存在或水平，和 抗-TNF a藥物自身抗體的存在或水平的試劑盒，該試劑盒包括：
[0069] (a)含一定量的標(biāo)記TNF α的第一檢測底物；
[0070] (b)含一定量的標(biāo)記抗-TNFa的第二檢測底物；
[0071] (c)任選的第三檢測底物，其含一定量的標(biāo)記TNFa和一定量的標(biāo)記內(nèi)部對照；
[0072] (d)任選的第四檢測底物，其含一定量的標(biāo)記抗-TNF a藥物a和一定量的標(biāo)記內(nèi) 部對照；
[0073] (e)任選的提取對象樣品的工具；和
[0074] (f)任選的使用該試劑盒的說明書小冊。
[0075] 本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀以下詳述和【附圖說明】將會明白本發(fā)明的其他目的、特征 和優(yōu)點。
[0076] 附圖簡要說明
[0077] 圖1.顯示本發(fā)明試驗的示例實施方式，其中采用分子大小排阻HPLC來檢測 TNF a -Alexa647與