使用定點(diǎn)衍生化和lc/ms/ms工作流程分析一組腦腱黃瘤病生物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用定點(diǎn)衍生化和LC/MS/MS工作流程分析一組腦腱黃瘤 病生物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求了 2012年5月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/649, 044號(hào)的優(yōu)先權(quán)， 所述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文中。
[0003] 政府許可權(quán)利
[0004] 本發(fā)明可能已經(jīng)部分地在政府支持下，在NCRR和NIH的NCATS授予的OCTRI基金 編號(hào)5KL2 RR024141-04下完成。政府可以擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本文所述的教示涉及使用標(biāo)記試劑分析酮固醇膽汁酸前體的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0006] 新生兒篩查程序可以通過(guò)遺傳病癥的早起檢測(cè)和治療有效地拯救生命以及防止 嚴(yán)重的病態(tài)（例如智力遲鈍）。因此，篩查新生兒應(yīng)該擴(kuò)大到包括額外失調(diào)癥，特別是具有 治療選擇的失調(diào)癥。
[0007] 其中新生兒篩查程序可能特別有用的遺傳病癥包括那些涉及固醇路徑改變的 遺傳病癥。這些病癥可以導(dǎo)致過(guò)早的死亡和發(fā)病且包括病癥例如腦腱黃瘤?。–TX)、 Smith-Lemli-Opitz綜合癥、家族性高膽固醇血癥和先天性腎上腺增生。CTX在最近的一份 美國(guó)大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)報(bào)告中已經(jīng)被確定為普遍新生兒篩查的候選疾病。然而，為了有效， CTX的篩查和/或診斷方法必須具有足夠的靈敏性和選擇性。
[0008] CTX是由CYP27A基因（CYP27A基因也被稱(chēng)為固醇27-羥化酶基因）的突變所引起 的一種罕見(jiàn)遺傳性固醇病癥。CYP27A基因與在產(chǎn)生膽汁酸過(guò)程中具有重要性的P450酶有 關(guān)。當(dāng)CYP27A活性被抑制或阻斷時(shí)，膽汁酸前體將在各種組織中積累。CTX經(jīng)常在幼年時(shí) 期呈現(xiàn)，且伴隨著由酮固醇膽汁酸前體和其衍生物的積累所引起的癥狀緩慢增加。CTX經(jīng)常 直到成年期才被確診，而此時(shí)已經(jīng)造成顯著損害。CTX的生化表型顯示在圖12中。
[0009] 先前曾經(jīng)考慮過(guò)篩查27-羥化酶缺陷的生物標(biāo)記物。然而，CTX的生物標(biāo)記物是 酮固醇生物標(biāo)記物化合物，且因?yàn)檫@些生物標(biāo)記物在臨床和生物樣品（例如血漿）中的含 量通常很低，所以這種篩查提出了挑戰(zhàn)。另外，所述生物標(biāo)記物可能以甚至更低的含量存在 于未受影響的個(gè)體中，從而使得難以獲得參照。當(dāng)使用反相（RP)色譜法時(shí)，高疏水性酮類(lèi) 固醇給色譜分析帶來(lái)了挑戰(zhàn)。通過(guò)質(zhì)量分析來(lái)檢測(cè)和量化酮固醇生物標(biāo)記物類(lèi)固醇同樣特 別有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榇祟?lèi)化合物的電離效率不良、電離圖案復(fù)雜、同重元素化合物干擾質(zhì)量測(cè) 量以及樣品介質(zhì)中的低樣品濃度。
[0010] 可利用標(biāo)準(zhǔn)色譜技術(shù)（例如GC-MS方法）進(jìn)行化學(xué)衍生后的分析。參見(jiàn)例如 Song, J.等人，Journal of Chromatography B·，791 卷，1-2 期，（127-135) 2003,其內(nèi)容以 引用的方式并入本文中。還可以利用使用熒光檢測(cè)和某些免疫分析（包括放射免疫分析 (RIA))的方法，但這些方法通常不提供多組分分析。使用RIA的主要問(wèn)題是缺少特異性和 需要對(duì)每種類(lèi)固醇進(jìn)行不同分析。
[0011] 用來(lái)分析在CTX和腸道疾病中積累的酮固醇（例如5α-膽固-3-酮和其它 膽汁酸前體）的一種現(xiàn)有分析方法已被描述在（例如）美國(guó)專(zhuān)利案第8, 158, 435號(hào)； Andrea E.DeBarber 等人：Clinica Chimica Acta，411(2010)43-48;Akira Honda 等人： The Journal of Biological Chemistry 276, 37(2001)34579-34585;和 MCamilleri 等人 Neurogastroenterol Motil (2009)21，734_e43技術(shù)說(shuō)明中，所述文獻(xiàn)以引用的方式并入本 文中。GC-FID或GC-MS被用于CTX的生化篩查，所述篩查使用Girard P衍生化和ESI-MSMS 檢測(cè)。然而，基于GC的方法的限制包括長(zhǎng)分析時(shí)間（>30min)和復(fù)雜的樣品制備。
[0012] 以上與檢測(cè)和量化樣品中的酮固醇生物標(biāo)記物化合物有關(guān)的挑戰(zhàn)在希望快速篩 查和/或分析大量生物樣品中的特定受關(guān)注化合物或一組酮固醇膽汁酸前體時(shí)被放大。
[0013] 另外，傳統(tǒng)方法可能耗費(fèi)人力且缺少測(cè)量正常未受影響患者的血清或全血樣品所 必需的靈敏性，特別是對(duì)通常只能獲得少量樣品的新生兒篩查來(lái)說(shuō)。因此，希望擁有用于分 析受影響人類(lèi)樣品和正常人類(lèi)樣品中的CTX生物標(biāo)記物水平的簡(jiǎn)單和特定方法。
[0014] 因此，仍然需要適用于確認(rèn)和量化CTX的具靈敏性且選擇性的篩查測(cè)試。此測(cè)試 優(yōu)選對(duì)量化酮固醇和可用作CTX標(biāo)記物的其它分析物具有靈敏性和特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 根據(jù)本教示的一些廣泛方面，公開(kāi)了用于檢測(cè)和量化人類(lèi)樣品（例如受影響或正 常的人類(lèi)樣品）中的CTX和IBS(腸易激綜合癥）生物標(biāo)記物的方法。在許多實(shí)施例中，這 些方法使用本文所公開(kāi)的季氨氧基（QAO)試劑，以提高受關(guān)注分析物（例如CTX生物標(biāo)記 物）的電離效率，從而經(jīng)由質(zhì)譜法檢測(cè)實(shí)現(xiàn)所需LL0Q，即使對(duì)于低體積（例如小于約5微升 (μ L)的樣品體積，如小于10 μ L的樣品體積，例如在約3至約5 μ L的范圍內(nèi)）樣品來(lái)說(shuō)。 酮固醇膽汁酸前體是CTX和IBS生物標(biāo)記物的實(shí)例。
[0016] 在各個(gè)實(shí)施例中，本文所公開(kāi)的同位素富集型季氨氧基試劑可以用于通過(guò)與潔凈 標(biāo)準(zhǔn)物的簡(jiǎn)單反應(yīng)來(lái)制造每種受關(guān)注分析物的內(nèi)標(biāo)物。在一些實(shí)施例中，可以通過(guò)用本文 所公開(kāi)的季氨氧基試劑的同位素變體標(biāo)記已知濃度的多種生物標(biāo)記物分析物（即，用QAO 試劑的不同同位素變體標(biāo)記每種生物標(biāo)記物）來(lái)制造一組生物標(biāo)記物的內(nèi)標(biāo)物。可以將這 些內(nèi)標(biāo)物添加到測(cè)試樣品中以允許受關(guān)注生物標(biāo)記物的絕對(duì)量化。
[0017] 在各個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本教示的方法可以用于酮固醇生物標(biāo)記物的高靈敏性和特 異性分析，這允許從各種樣品（包括具有低體積和復(fù)雜生物基質(zhì)的樣品）中檢測(cè)酮類(lèi)固醇 膽汁酸前體。
[0018] 在一些實(shí)施例中，公開(kāi)了一種診斷或篩查27-羥化酶缺陷的方法，其包括用QAO試 劑（例如以上所公開(kāi)的QAO試劑）處理人類(lèi)樣品以標(biāo)記樣品中的一種或多種酮固醇膽汁酸 前體，以及對(duì)經(jīng)處理的樣品進(jìn)行LC-MS分析以檢測(cè)和量化標(biāo)記前體。
[0019] 在某些情況下，上述方法可以進(jìn)一步包括通過(guò)用本文所公開(kāi)的不同同位素標(biāo)記 QAO試劑標(biāo)記已知濃度的不同酮固醇膽汁酸前體制備一種或多種內(nèi)標(biāo)物。在一些實(shí)施例中， 這些內(nèi)標(biāo)物可以用來(lái)同時(shí)量化一組生物標(biāo)記物，例如使用LC-MS。例如，在一些實(shí)施例中，使 用這些內(nèi)標(biāo)物允許在LC-MS光譜儀的單次操作中檢測(cè)和量化一組生物標(biāo)記物。
[0020] 在一些實(shí)施例中，用于標(biāo)記供質(zhì)量分析用的酮固醇膽汁酸前體的季氨氧基（QAO) 試劑包括式（I)標(biāo)記試劑：
[0021] Y- (CH2)n-O-NH2(I)
[0022] 其中η是2、3、4、5或6且Y是：
[0023]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種診斷或篩查27-輕化酶CYP27A1缺陷的方法，其包括： 用式（I)的標(biāo)記試劑或其鹽或水合物使包含一種或多種麗固醇膽汁酸前體的分析物 衍生化，W形成標(biāo)記分析物： ￥-畑2)。-〇-畑2 訊 其中n是2、3、4、5或6,且Y是：
每個(gè)R4獨(dú)立地為H或支鏈或直鏈C i-Ci8焼基， m是1與20之間的整數(shù)，且 X是陰離子； 電離所述標(biāo)記分析物； 通過(guò)質(zhì)量分析檢測(cè)所述標(biāo)記分析物的特征離子碎片；W及 比較所述特征離子碎片與標(biāo)準(zhǔn)物的特征離子碎片的強(qiáng)度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述27-輕化酶CYP27A1缺陷是由腦膊黃瘤病CTX 所引起。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述27-輕化酶CYP27A1缺陷是由A 4-3-氧代類(lèi) 固醇-5B還原酶缺陷所引起。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種麗固醇膽汁酸前體包括下列各項(xiàng) 中的一個(gè)或多個(gè)： 7a-膽固帰-3-麗； 5a-膽固焼-3-麗； 4-膽固帰-3-麗； 7 a，12 a -二輕基-4-膽固帰-3-麗； 7 a -輕基-5目-膽固焼-3-麗；W及 7 a，12 a _二輕基-5 0 -膽固焼-3-麗。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述一種或多種麗固醇膽汁酸前體包括7 a-膽固 帰-3-麗、5 a -膽固焼-3-麗、4-膽固帰-3-麗和7 a，12 a -二輕基-4-膽固帰-3-麗中 的至少兩個(gè)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述衍生化包括使包括7 a -膽固帰-3-麗和 7 a，12 a -二輕基-4-膽固帰-3-麗的一組分析物衍生化。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述分析物組包括7 a -膽固帰-3-麗、5 a -膽固 焼-3-麗、4-膽固帰-3-麗和7 a , 12 a -二輕基-4-膽固帰-3-麗。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述標(biāo)記試劑具有W下結(jié)構(gòu)：
或其鹽或水合物。

9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分析物是從生物基質(zhì)獲得。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述生物基質(zhì)包括鮮血、干血粉、血清或血漿。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述生物基質(zhì)的體積為10 y L或更少。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述特征離子碎片為中性丟失碎片，其包括所述 分析物和所述標(biāo)記試劑或其部分的結(jié)構(gòu)碎片。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括W下步驟：用式（I)的標(biāo)記試劑使一種 或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物衍生化W形成標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)同位素富集，W及電 離所述標(biāo)記分析物和所述標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物二者。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)化合物包括7 a -膽固帰-3-麗和 7 a，12 a -二輕基-4-膽固帰-3-麗。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述檢測(cè)是在單次質(zhì)量分析操作中進(jìn)行。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其進(jìn)一步包括測(cè)量所述標(biāo)記分析物相對(duì)于同位素標(biāo) 記標(biāo)準(zhǔn)物的相對(duì)濃度。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中電離所述標(biāo)記分析物的所述步驟是利用約10至 約130eV范圍內(nèi)的碰撞能量進(jìn)行。
18. -種用于分析麗固醇膽汁酸前體的試劑盒，其包括： 一組麗固醇膽汁酸前體標(biāo)準(zhǔn)物； 一組質(zhì)量標(biāo)記，其包括兩種或更多種式（I)化合物： ￥-畑2)。-〇-畑2 訊 其中n是2、3、4、5或6且Y是：
每個(gè)R4獨(dú)立地為H或支鏈或直鏈C i-Ci8焼基， m是1與20之間的整數(shù)，且 X是陰離子； 或其鹽或水合物， W及緩沖劑、試劑、分離柱和用于進(jìn)行分析的說(shuō)明書(shū)中的一個(gè)或多個(gè)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述組的麗固醇膽汁酸前體標(biāo)準(zhǔn)物包括下列 各項(xiàng)中的兩個(gè)或更多個(gè)： 7a-膽固帰-3-麗（7a C4); 5 a -膽固焼-3-麗； 4-膽固帰-3-麗； 7 a，12 a -二輕基-4-膽固帰-3-麗； 7 a -輕基-5目-膽固焼-3-麗；W及 7 a，12 a _二輕基-5 0 -膽固焼-3-麗。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述組的麗固醇膽汁酸前體包括7 a -膽固 帰-3-麗和7 a , 12 a -二輕基-4-膽固帰-3-麗。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供用于分析人血漿、血清或全血中的酮固醇生物標(biāo)記物(例如膽汁酸前體)的方法、標(biāo)記試劑、標(biāo)記試劑組和標(biāo)記技術(shù)。此方法被用于篩查新生兒的腦腱黃瘤病CTX。此外還揭示了用于標(biāo)記、分析和量化酮固醇生物標(biāo)記物的方法，以及同樣使用質(zhì)譜法的方法。
【IPC分類(lèi)】G01N33-50, G01N33-48
【公開(kāi)號(hào)】CN104603617
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380026048
【發(fā)明人】A·迪巴貝爾, S·普卡雅斯特哈, R·D·施泰納, M·魏茵斯托克
【申請(qǐng)人】Dh科技發(fā)展私人貿(mào)易有限公司, 俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2013年5月17日
【公告號(hào)】CA2873650A1, EP2850430A1, WO2013171568A1