專利名稱:監(jiān)測細(xì)胞和生物分子生物學(xué)行為的生物傳感器及傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物傳感器領(lǐng)域，特別是基于阻抗技術(shù)對細(xì)胞和核酸、蛋白等生物分子的生物學(xué)行為進(jìn)行監(jiān)測。本發(fā)明具體包括利用阻抗技術(shù)監(jiān)測細(xì)胞和生物大分子生物學(xué)行為的器件和傳感方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的監(jiān)測細(xì)胞和生物大分子生物學(xué)行為的方法有很多，但主要是一些生化和免疫學(xué)的方法，例如用熒光染料標(biāo)記，然后用紫外光激發(fā)，用熒光顯微鏡檢測。用MTT/XTT比色法測定細(xì)胞增值能力是一個(gè)用生化方法測定細(xì)胞生物學(xué)行為的一個(gè)代表性示例，這種方法的原理是在代謝旺盛的正常細(xì)胞中，其線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶，可將四唑鹽類物質(zhì)(如MTT、XTT、WST-1等)還原為紫色的結(jié)晶狀的物質(zhì)，沉積在細(xì)胞周圍，因而紫色結(jié)晶的量反映了細(xì)胞增值能力的大小。從而，只要通過酶標(biāo)儀讀取OD值，就可以測定到細(xì)胞的增值狀態(tài)(Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survivalapplication to proliferationand cytotoxicity assays.J Immunol Methods.1983 655-63.)。MTT方法的優(yōu)勢主要在于其操作相對簡單，靈敏度高，因而取得了比較廣泛的應(yīng)用。但是，這類用生物化學(xué)和免疫學(xué)手段監(jiān)測細(xì)胞生物學(xué)行為的方法也存在一些難以克服的問題，例如不能連續(xù)、實(shí)時(shí)監(jiān)測，需要進(jìn)行熒光或抗體等化學(xué)標(biāo)記，對細(xì)胞會造成一定的化學(xué)毒害，難以實(shí)現(xiàn)高度自動化的監(jiān)測等等。
一些生物物理的方法能夠在一定程度上克服上述缺點(diǎn)中的一項(xiàng)甚至多項(xiàng)，例如用電旋轉(zhuǎn)的方法監(jiān)測細(xì)胞活性和在藥物作用下細(xì)胞生物學(xué)行為的改變(中國專利高通量電旋轉(zhuǎn)檢測的裝置和方法申請(專利)號00124086.2程京；許俊泉；朱小山；劉理天；王小波；吳鐳)?；谧杩箿y量的細(xì)胞和生物大分子生物學(xué)行為的監(jiān)測方法也是一種非常靈敏的，能夠?qū)崟r(shí)、連續(xù)測量，無需化學(xué)標(biāo)記的生物物理方法，在下面的文獻(xiàn)資料中有相關(guān)闡述(Giaever I.and Keese C.R.，″Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field″，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，1984，vol.81，pp 3761-3764)。
細(xì)胞電阻抗主要由器件上電極與溶液界面以及溶液中的離子環(huán)境決定，同時(shí)也由細(xì)胞在電極上的貼附狀態(tài)決定，例如當(dāng)細(xì)胞在電極上伸展的時(shí)候，與電極的接觸面積增大，這時(shí)阻抗值便會上升；反之，當(dāng)細(xì)胞死亡的時(shí)候阻抗則會降低。當(dāng)細(xì)胞的狀態(tài)，例如細(xì)胞的形態(tài)、繁殖能力、貼附狀態(tài)等發(fā)生變化的時(shí)候，阻抗值也會相應(yīng)的發(fā)生變化，已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明阻抗測量的方法比一些常用的生化方法更為靈敏。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種監(jiān)測細(xì)胞和生物分子生物學(xué)行為的生物傳感器和傳感方法。該傳感器的特征在于在絕緣的基質(zhì)上面附著兩個(gè)或兩個(gè)以上的電極，絕緣的基質(zhì)和電極的材料均為生物相容性好的材料；所述傳感器的電極至少有兩個(gè)；所述傳感器的絕緣基質(zhì)的材料是包含玻璃、或硅、或高分子聚合物材料或它們的組合在內(nèi)的生物相容性好的絕緣材料；所述傳感器的電極是包含金屬、或非金屬、或他們的組合在內(nèi)的導(dǎo)電體材料。
本發(fā)明提出的監(jiān)測細(xì)胞和生物分子生物學(xué)行為的傳感方法，其特征在于該方法依次含有以下幾個(gè)步驟第一，在傳感器上培養(yǎng)細(xì)胞或黏附DNA、或蛋白質(zhì)生物大分子；第二，將傳感器與限流電阻串連后接入測量裝置；第三，測量裝置對傳感器與電阻構(gòu)成的串連電路上加載正弦交流電信號；第四，測量裝置同時(shí)測量傳感器上的正弦交流電壓信號和加載的正弦交流電壓信號，并根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算傳感器的阻抗
，計(jì)算公式如下Z.=U.2U.1R]]>其中
為傳感器上的正弦交流電信號，
為加載在傳感器和限流電阻兩端的正弦交流電壓信號，R為限流電阻的阻值。
本發(fā)明利用這種傳感器和傳感方法實(shí)時(shí)監(jiān)測了THP-1細(xì)胞在佛波脂誘導(dǎo)下分化為THP-1巨噬細(xì)胞的過程，實(shí)驗(yàn)裝置包括傳感器、阻抗測量儀以及一臺計(jì)算機(jī)，我們在實(shí)驗(yàn)中采用的激勵(lì)信號的頻率為1KHz、20KHz、30KHz、40KHz、50KHz、80KHz、100KHz、200KHz和250KHz，電壓的幅值為2V。在實(shí)驗(yàn)中，我們實(shí)時(shí)監(jiān)測了THP-1細(xì)胞分化全過程中阻抗曲線的變化。
該方法還具有靈敏，能夠?qū)崟r(shí)、連續(xù)測量，無需化學(xué)標(biāo)記，不會對細(xì)胞造成化學(xué)毒害，并且易于實(shí)現(xiàn)自動化測量等優(yōu)點(diǎn)。
圖1A和圖1B是細(xì)胞電阻抗測量器件的示意圖，其中圖1B是圖1A中局部的放大圖。1-電極，2-絕緣基質(zhì)。
圖2是測量裝置的原理框圖。
圖3阻抗計(jì)算的原理圖及其公式說明。
具體實(shí)施方式本發(fā)明的技術(shù)方案是在利用微加工技術(shù)制作的微電極器件上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)，在電極上加以微弱的交流電場，當(dāng)細(xì)胞在微器件上貼壁生長的時(shí)候會對電場造成阻礙作用(即阻抗)，當(dāng)細(xì)胞由于生長、增值、分化以及收到藥物刺激而導(dǎo)致其形態(tài)發(fā)生變化的時(shí)候，其對電場的阻礙作用(即阻抗)便會發(fā)生變化，因而，通過對其阻抗的監(jiān)測，便可以間接監(jiān)測細(xì)胞的生物學(xué)行為。同樣，當(dāng)生物大分子附著在微電極器件上時(shí)，也會對微弱的交流電場帶來阻礙作用，當(dāng)生物分子的某些生物學(xué)行為發(fā)生變化時(shí)，例如抗原和抗體發(fā)生結(jié)合，也會帶來阻抗的改變，通過對其阻抗的監(jiān)測，便可以間接監(jiān)測生物大分子的生物學(xué)行為。
本發(fā)明所提供的器件包括附著在絕緣體上的非絕緣電極，絕緣體可以是玻璃、硅、高分子聚合物，例如聚碳酸脂等材料。電極可以是金等金屬，也可以是氧化銦錫等金屬氧化物。一個(gè)器件上有兩個(gè)或兩個(gè)以上的電極，并用引線把電極引出器件，與測量裝置相連，測量阻抗值。測量時(shí)，需要產(chǎn)生一定頻率和幅值的正弦波信號，通過串連的電阻(K歐姆——M歐姆數(shù)量級，具體阻值根據(jù)器件的阻抗確定)接入測量裝置，電阻的阻值約為傳感器阻抗值的千倍左右，從而使傳感器工作在恒流源模式。數(shù)據(jù)采集模塊分別將傳感器上的電壓信號和總電壓模擬信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，采集到控制模塊，通過軟件分析，得出傳感器的阻抗信息，包括阻抗的模和相位。該測量裝置可以提供多個(gè)頻率下的阻抗信息，測量每個(gè)頻率下的阻抗只需要最多5秒，也就是說如果只測量一個(gè)頻率下的阻抗，可以每隔5秒中測量一次，達(dá)到了實(shí)時(shí)測量的要求。
在此所用，“生物學(xué)行為”包括但并不僅僅包括細(xì)胞的形態(tài)變化、細(xì)胞的增值、分化以及細(xì)胞在藥物作用下所發(fā)生的變化；包括并不僅僅包括蛋白、核酸等生物大分子的相互作用等。
器件的加工和封裝本發(fā)明中，用于阻抗測量的電極是在玻璃基質(zhì)上用微加工中常用的光刻工藝，刻出電極的圖形，然后用真空蒸鍍工藝將金蒸鍍在玻璃基質(zhì)表面，去除光刻膠后形成傳感器的電極部分。用紫外膠將上述電極粘接在塑料培養(yǎng)皿底部，并用導(dǎo)電膠將導(dǎo)線與電極粘接在一起，導(dǎo)電膠固化后上面覆蓋紫外膠，防止在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)對細(xì)胞可能造成的毒性，導(dǎo)線引出培養(yǎng)皿并與測量裝置相連。
權(quán)利要求
1.監(jiān)測細(xì)胞和生物分子生物學(xué)行為的生物傳感器，該傳感器的特征在于在絕緣的基質(zhì)上面附著兩個(gè)或兩個(gè)以上的電極，絕緣的基質(zhì)和電極的材料均為生物相容性好的材料。
2.如權(quán)利要求
1所述的監(jiān)測細(xì)胞和生物分子生物學(xué)行為的生物傳感器，其特征在于，該傳感器的電極至少有兩個(gè)。
3.如權(quán)利要求
1所述的監(jiān)測細(xì)胞和生物分子生物學(xué)行為的生物傳感器，其特征在于，該傳感器的絕緣基質(zhì)的材料是包含玻璃、或硅、或高分子聚合物材料或它們的組合在內(nèi)的生物相容性好的絕緣材料。
4.如權(quán)利要求
1所述的監(jiān)測細(xì)胞和生物分子生物學(xué)行為的生物傳感器，其特征在于，該傳感器的電極是包含金屬、或非金屬、或他們的組合在內(nèi)的導(dǎo)電體材料。
5.監(jiān)測細(xì)胞和生物分子生物學(xué)行為的傳感方法，其特征在于該方法依次含有以下幾個(gè)步驟第一，在傳感器上培養(yǎng)細(xì)胞或黏附DNA、或蛋白質(zhì)生物大分子；第二，將傳感器與限流電阻串連后接入測量裝置；第三，測量裝置對傳感器與電阻構(gòu)成的串連電路上加載正弦交流電信號；第四，測量裝置同時(shí)測量傳感器上的正弦交流電壓信號和加載的正弦交流電壓信號，并根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算傳感器的阻抗
，計(jì)算公式如下Z.=U.2U.1R]]>其中
為傳感器上的正弦交流電信號，
為加載在傳感器和限流電阻兩端的正弦交流電壓信號，R為限流電阻的阻值。
專利摘要
本發(fā)明涉及生物傳感器領(lǐng)域，特別是基于阻抗技術(shù)對細(xì)胞和核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的生物學(xué)行為進(jìn)行監(jiān)測。本發(fā)明所涉及的傳感器的特征在于在絕緣基質(zhì)上附著兩個(gè)或兩個(gè)以上的電極，絕緣基質(zhì)和電極的材料均為生物相容性較好的材料。本發(fā)明所涉及的傳感方法的特征在于通過測量傳感器的阻抗，實(shí)現(xiàn)間接、實(shí)時(shí)測量細(xì)胞和生物大分子的生物學(xué)行為。本發(fā)明是一種對細(xì)胞和生物分子的生物學(xué)行為進(jìn)行自動化、實(shí)時(shí)監(jiān)測的方法，具有靈敏，能夠?qū)崟r(shí)、連續(xù)測量，無需化學(xué)標(biāo)記，不會對細(xì)胞造成化學(xué)毒害，并且易于實(shí)現(xiàn)自動化測量等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/00GK1996001SQ200610011110
公開日2007年7月11日 申請日期2006年1月6日
發(fā)明者王磊, 郭旻, 程京 申請人:博奧生物有限公司, 清華大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan