本發(fā)明涉及檢測(cè)試劑盒，具體的涉及一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈的試劑盒及其制備和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、免疫球蛋白分子均由兩條相同的重鏈(h鏈)和兩條相同的輕鏈(l鏈)通過(guò)二硫鍵連接形成，兩條相同的輕鏈分為κ(kappa)型和λ(lambda)型，可以標(biāo)記帶有輕鏈的b淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和免疫母細(xì)胞。正常情況下輕鏈和重鏈的分泌是平衡的，二者可以結(jié)合形成完整的免疫球蛋白分子。淋巴b細(xì)胞在發(fā)育成熟的過(guò)程中，其基因結(jié)構(gòu)需要不斷的重排組合，其合成的免疫球蛋白重鏈有幾種不同的類型，但輕鏈都為κ或λ，正常人體淋巴結(jié)中表達(dá)不同輕鏈的b細(xì)胞數(shù)κ：λ約為2：1。

2、正常漿細(xì)胞和反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥系多克隆性，既有κ鏈漿細(xì)胞也有λ鏈漿細(xì)胞，κ/λ比值在正常范圍內(nèi)。當(dāng)多發(fā)性骨髓瘤(mm)發(fā)生時(shí)，會(huì)過(guò)量產(chǎn)生一種單克隆免疫球蛋白輕鏈并同時(shí)抑制另一種輕鏈的生成，異常漿細(xì)胞分泌單一類型的免疫球蛋白從而使κ/λ比值失去平衡，比值的升高或降低分別提示患κ或λ型多發(fā)性骨髓瘤的可能。多發(fā)性骨髓瘤中有一輕鏈占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，提示漿細(xì)胞存在單克隆性增生。但對(duì)于同時(shí)含有κ和λ的雙克隆多發(fā)性骨髓瘤和反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥無(wú)法區(qū)分，需要結(jié)合其它免疫指標(biāo)進(jìn)行鑒別。綜上κ/λ比值的失衡是區(qū)分發(fā)性骨髓瘤漿細(xì)胞單克隆性增生和b細(xì)胞淋巴瘤等其他疾病的重要指標(biāo)。

3、目前κ游離輕鏈檢測(cè)多采用電泳法、免疫固定電泳法、膠乳比濁法和膠乳增強(qiáng)法，但此類方法檢測(cè)范圍窄，靈敏度低，且受結(jié)合輕鏈影響較大，已不能滿足逐漸增長(zhǎng)的臨床檢驗(yàn)需求。

4、化學(xué)發(fā)光法是近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用的一種檢測(cè)方法，已成熟用于檢測(cè)血液或體液標(biāo)本中的蛋白及小分子物質(zhì)，能夠得到靈敏度更高，檢測(cè)范圍更寬的結(jié)果。但采用常規(guī)化學(xué)發(fā)光法制得的κ游離輕鏈檢測(cè)試劑，與膠乳比濁法的試劑相比，檢測(cè)范圍和靈敏度只有小范圍改變，沒(méi)有達(dá)到數(shù)量級(jí)的提升，傳統(tǒng)方式的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈仍然受樣本中結(jié)合輕鏈和λ游離輕鏈的干擾影響，造成靈敏度和檢測(cè)范圍無(wú)法提高，準(zhǔn)確度不滿足要求的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈時(shí)靈敏度和檢測(cè)范圍無(wú)法提高的缺陷，提供了一種基于磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈的試劑盒及其制備和檢測(cè)方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)以上目的及其他目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、首先，本發(fā)明提供了一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈的試劑盒，包括κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠，發(fā)光物標(biāo)記的κ游離輕鏈抗體2以及反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液包括抗干擾劑1、抗干擾劑2以及λ游離輕鏈抗體。

4、在一實(shí)施例中，所述抗干擾劑1為protein?a蛋白。

5、在臨床樣本中，免疫球蛋白根據(jù)重鏈定義類型(iga、igg、igm、igd、ige)，重鏈與κ或λ型輕鏈相結(jié)合，樣本中大多數(shù)輕鏈為結(jié)合型，成為完整的免疫球蛋白，只有少數(shù)的游離輕鏈，大量存在的結(jié)合型輕鏈會(huì)直接影響游離輕鏈的檢測(cè)，protein?a蛋白是金黃色葡萄球菌表面的蛋白，可與樣本中igg、iga、igm和ige等免疫球蛋白分子結(jié)合，封閉結(jié)合型輕鏈的位點(diǎn)，造成空間位阻，從而降低干擾。

6、在一實(shí)施例中，所述抗干擾劑2為protein?g蛋白。

7、免疫球蛋白中igg是最常見(jiàn)的類型，igg分為igg1、igg2、igg3、igg4四種亞型，所述protein?g蛋白是g族鏈球菌的細(xì)胞表面蛋白，所述protein?g蛋白可以更廣泛、更強(qiáng)地、與4種亞型的igg結(jié)合，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)免疫球蛋白的封閉，降低對(duì)檢測(cè)游離輕所述protein?g蛋白鏈的干擾。

8、在一實(shí)施例中，所述λ游離輕鏈抗體為λ游離輕鏈多克隆抗體。

9、臨床樣本中除κ游離輕鏈還存在λ游離輕鏈，兩者為結(jié)構(gòu)類似物，大部分片段基本一致，而特異性的κ游離輕鏈單克隆抗體捕獲抗原時(shí)，依然會(huì)不同程度地受到λ游離輕鏈的干擾，造成背景值升高，異常跳值的問(wèn)題，λ游離輕鏈多克隆抗體能結(jié)合抗原表面更多的位點(diǎn)，對(duì)λ游離輕鏈全方位包裹，直接減小干擾。

10、在一實(shí)施例中，所述λ游離輕鏈多克隆抗體來(lái)源于小鼠(mouse)、大鼠(rat)、兔、羊或山羊，優(yōu)選地為大鼠(rat)。

11、在一實(shí)施例中，所述抗干擾劑1、抗干擾劑2和λ游離輕鏈抗體的質(zhì)量比為(1～10)：

12、(1～4)：1。

13、在一實(shí)施例中，所述反應(yīng)緩沖液還包括1.2g/l磷酸二氫鈉，7.2g/l十二水合磷酸氫二鈉，9.0g/l氯化鈉，5.0g/l牛血清白蛋白，10.0g/l蔗糖，1ml吐溫20，500μl曲拉通x-100，1ml防腐劑proclin300。所述反應(yīng)緩沖液的ph值為6～8。

14、在一實(shí)施例中，所述κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠濃度為0.1～0.3mg/ml，優(yōu)選為0.2mg/ml；所述κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠包括κ游離輕鏈抗體1、磁珠、活化劑、封閉劑和組分保存液，所述κ游離輕鏈抗體1與磁珠的偶聯(lián)比例為10～30μg/mg，優(yōu)選為20μg/mg。

15、進(jìn)一步的，所述κ游離輕鏈抗體1為κ游離輕鏈單克隆抗體，所述κ游離輕鏈單克隆抗體來(lái)源于小鼠(mouse)、大鼠(rat)、兔、羊或山羊，優(yōu)選為大鼠(rat)。

16、進(jìn)一步的，所述磁珠為羧基磁珠、鏈霉親和素磁珠、甲苯磺?；胖椋瑑?yōu)選為羧基磁珠；所述羧基磁珠粒徑為1～3μm，優(yōu)選為2.8μm。

17、進(jìn)一步的，所述活化劑為1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)和n-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-nhs)，優(yōu)選為edc和sulfo-nhs。

18、進(jìn)一步的，所述封閉劑為牛血清白蛋白和db1130試劑。

19、進(jìn)一步的，所述組分保存液ph值為6～8，包括0.4g/l磷酸氫二鉀，2.4g/l十二水合磷酸氫二鈉，0.4g/l氯化鉀，9.0g/l氯化鈉，0.2g氯化鎂，0.1g氯化鈣，20g/l牛血清白蛋白，0.1％曲拉通x-100，0.1％?krovin360。

20、在一實(shí)施例中，所述發(fā)光物標(biāo)記的κ游離輕鏈抗體2包括κ游離輕鏈抗體2、發(fā)光標(biāo)記物、終止劑和組分保存液，所述發(fā)光物標(biāo)記的κ游離輕鏈抗體2的濃度為1～4μg/ml，優(yōu)選為2.5μg/ml；所述發(fā)光標(biāo)記物與κ游離輕鏈抗體2標(biāo)記比為1：(5～30)，優(yōu)選為1：20。

21、進(jìn)一步的，所述κ游離輕鏈抗體2為κ游離輕鏈單克隆抗體，所述κ游離輕鏈單克隆抗體來(lái)源于小鼠(mouse)、大鼠-(rat)、兔、羊或山羊，優(yōu)選地為大鼠(rat)。

22、進(jìn)一步的，所述發(fā)光標(biāo)記物為吖啶鹽、堿性磷酸酶或者過(guò)氧化氫酶，優(yōu)為吖啶鹽；所述吖啶鹽可以是nsp-dmae-nhs、dmae-nhs或者nsp-sa-nhs，優(yōu)選為nsp-dmae-nhs。

23、進(jìn)一步的，所述終止劑為tris，甘氨酸，賴氨酸，組氨酸，優(yōu)選為甘氨酸。

24、進(jìn)一步的，所述組分保存液為包括0.4g/l磷酸氫二鉀，2.4g/l十二水合磷酸氫二鈉，0.4g/l氯化鉀，9.0g/l氯化鈉，0.2g氯化鎂，0.1g氯化鈣，20g/l牛血清白蛋白，0.1％曲拉通x-100，0.1％?krovin360。

25、此外，所述基于磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈的試劑盒還可以包括κ游離輕鏈校準(zhǔn)品、清洗液、底物液a和底物液b。

26、在一實(shí)施例中，所述清洗液的ph值為9.5，包括：0.02m?tris-hcl、9.0g/l氯化鈉、0.2％吐溫20和0.1％?krovin950；所述底物液a包括0.05m硝酸和0.5％雙氧水；所述底物液b包括0.1m氫氧化鈉、0.5％十六烷基三甲基溴化銨和0.1％吐溫20。

27、其次，本發(fā)明還提供了一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈的試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

28、步驟s1，制備κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠：將純化后的κ游離輕鏈抗體1與活化后的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)，制備獲得κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠；

29、步驟s2，制備發(fā)光物標(biāo)記的κ游離輕鏈抗體2：用發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記純化后的κ游離輕鏈抗體2后，再進(jìn)行純化，制備獲得發(fā)光物標(biāo)記的κ游離輕鏈抗體2；

30、步驟s3，制備反應(yīng)緩沖液：取磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈉、牛血清白蛋白、蔗糖，加入純化攪拌溶解后加入吐溫20、曲拉通x-100以及防腐劑proclin300；調(diào)節(jié)ph后定容，加入λ游離輕鏈多克隆抗體、protein?a蛋白以及protein?g蛋白，制備獲得反應(yīng)緩沖液；

31、步驟s4，制備κ游離輕鏈校準(zhǔn)品、清洗液、底物液a以及底物液b。

32、最后，本發(fā)明提供了一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈的試劑盒的檢測(cè)方法，采用一步半法檢測(cè)，包括步驟：

33、采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀一步半法檢測(cè)，吸取待測(cè)臨床樣本或校準(zhǔn)品加入反應(yīng)管中，加入反應(yīng)緩沖液，混勻后溫育反應(yīng)，再依次加入κ游離輕鏈抗體1包被的磁珠和發(fā)光物標(biāo)記的κ游離輕鏈抗體2，混勻后繼續(xù)溫育反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后去除上清液和未參與反應(yīng)多余的發(fā)光標(biāo)記物，在反應(yīng)管中加入底物液a，混勻后加入底物液b，在加入的同時(shí)立即采集發(fā)光信號(hào)，采集2s后停止，計(jì)算得到相對(duì)發(fā)光值。

34、綜上所述，本發(fā)明提供的基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈的試劑盒通過(guò)反應(yīng)緩沖液的添加，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)κ游離輕鏈時(shí)，可以排除干擾影響，并且其檢測(cè)靈敏度、線性范圍、穩(wěn)定性以及準(zhǔn)確性等方面均顯著提高。