本發(fā)明屬于細(xì)胞檢測(cè)裝置開(kāi)發(fā)，具體涉及一種用于細(xì)胞代謝產(chǎn)物n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、動(dòng)物體在劇烈運(yùn)動(dòng)后，細(xì)胞代謝產(chǎn)生n-l-乳酰-l-苯丙氨酸，且濃度與乳酸濃度呈正相關(guān)，并在運(yùn)動(dòng)結(jié)束后恢復(fù)，這表明n-l-乳酰-l-苯丙氨酸可作為運(yùn)動(dòng)后的標(biāo)志物對(duì)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和效果，因此越來(lái)越多的研究關(guān)注于細(xì)胞層面的n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的代謝水平，但是現(xiàn)存的檢測(cè)方法主要是通過(guò)液相色譜和液相質(zhì)譜，難以做到便攜且存在較為復(fù)雜的樣品前處理步驟。因此開(kāi)發(fā)出一種用于細(xì)胞代謝產(chǎn)物n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的快速檢測(cè)方法，將有助于進(jìn)行細(xì)胞樣品的快速檢測(cè)。

2、電化學(xué)檢測(cè)方法為一種近年來(lái)越來(lái)越被重視的檢測(cè)手段，因其靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，同時(shí)檢測(cè)成本和設(shè)備的運(yùn)行成本也低于傳統(tǒng)的液相、質(zhì)譜和光譜等檢測(cè)方法。伴隨著近年來(lái)對(duì)快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求增加，電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展受到了極大的重視。晶體管(transistor)是一種固體半導(dǎo)體器件，主要功能有檢波、整流、放大、開(kāi)關(guān)、穩(wěn)壓和信號(hào)調(diào)制等，由于具備體積小，無(wú)需預(yù)熱且結(jié)實(shí)可靠的特點(diǎn)，在電子信息領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。場(chǎng)效應(yīng)晶體管(filled?effect?transistor，fet)是晶體管中的一類(lèi)，主要由源極、漏極和柵極等結(jié)構(gòu)組成。fet傳感器已經(jīng)發(fā)展出了更多的類(lèi)型，極大的擴(kuò)展了生物傳感器的應(yīng)用范圍。相較于傳統(tǒng)的fet傳感器，電解質(zhì)柵控石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管(sggt)使用石墨烯覆蓋溝道，并使用電解質(zhì)溶液替代傳統(tǒng)fet傳感器中的絕緣層，讓三個(gè)電極同時(shí)處在電解質(zhì)環(huán)境中，使得柵極/電解質(zhì)和電解質(zhì)/溝道界面形成兩個(gè)雙電子層，相當(dāng)于兩個(gè)電容器。因此在整個(gè)體系的使用過(guò)程中，即使是微小的柵極電壓變化也可以產(chǎn)生一個(gè)較大的溝道電流改變。此外，sggt相較于fet可以通過(guò)修飾柵極實(shí)現(xiàn)針對(duì)不同靶標(biāo)的檢測(cè)。目前已有的研究中，sggt傳感器已應(yīng)用于對(duì)液體中的部分離子的檢測(cè)，以及對(duì)生物體中組胺、凝血酶、dna等靶標(biāo)的檢測(cè)。在這些實(shí)驗(yàn)中，sggt都表現(xiàn)出了快速、實(shí)時(shí)、高靈敏度和高通量等優(yōu)勢(shì)。

3、傳統(tǒng)生物分子監(jiān)測(cè)采用抗原抗體特異性結(jié)合的方式，但抗體存在易失活且制備時(shí)間較長(zhǎng)的缺陷。相比之下核酸適配體具有自生穩(wěn)定性較好，制備合成相對(duì)簡(jiǎn)單且應(yīng)用靈活，十分適合用于生物檢測(cè)、診斷和藥學(xué)研究等方面。到目前為止，也已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種用于分析檢測(cè)的電化學(xué)適體傳感器。例如一種由亞甲藍(lán)修飾的探針和無(wú)標(biāo)記的捕獲探針組成，當(dāng)目標(biāo)dna與未標(biāo)記的捕獲探針雜交時(shí)，標(biāo)記的信號(hào)探針將被釋放。因此適配體可通過(guò)au-s鍵將dna固定在sggt的柵極表面，通過(guò)au-s鍵實(shí)現(xiàn)不同適配體的修飾，檢測(cè)不同靶標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、要解決的技術(shù)問(wèn)題：針對(duì)上述的技術(shù)問(wèn)題，本研究計(jì)劃通過(guò)設(shè)計(jì)和制備基于sggt的n-l-乳酰-l-苯丙氨酸電化學(xué)傳感器，建立對(duì)l-乳酸(lac)、l-苯丙氨酸(phe)和n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的檢測(cè)方法與體外濃度關(guān)系模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物中的n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的快速檢測(cè)。

2、技術(shù)方案：一種用于細(xì)胞代謝產(chǎn)物n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的快速檢測(cè)方法，包括以下步驟：

3、(1)sggt電極修飾：將l-乳酸核酸適配體和l-苯丙氨酸核酸適配體分別修飾于柵極表面，得到基于sggt的n-l-乳酰-l-苯丙氨酸傳感器；

4、(2)l-乳酸和l-苯丙氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定：將l-乳酸和l-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品分別用培養(yǎng)基稀釋至不同濃度，并將其滴加到n-l-乳酰-l-苯丙氨酸傳感器上，根據(jù)傳感器轉(zhuǎn)移曲線判斷傳感器的檢測(cè)范圍，通過(guò)狄拉克點(diǎn)處的柵壓變化值與濃度對(duì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合；

5、(3)l-乳酸和l-苯丙氨酸在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度檢測(cè)：向檢測(cè)體系中加入混合l-乳酸和l-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)步驟(2)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，并使用液相和試劑盒測(cè)定回收率；

6、(4)細(xì)胞培養(yǎng)基中n-l-乳酰-l-苯丙氨酸濃度模型的構(gòu)建：通過(guò)對(duì)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中l(wèi)-乳酸、l-苯丙氨酸和n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的濃度進(jìn)行定量，擬合構(gòu)建濃度關(guān)系模型；

7、(5)實(shí)際樣品檢測(cè)：向檢測(cè)體系中加入培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)實(shí)際測(cè)定結(jié)果計(jì)算檢測(cè)回收率，并帶入濃度關(guān)系模型得到n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的濃度。

8、進(jìn)一步的，所述步驟(1)具體為：室溫條件下，將1-5μl?5-15mm三(2-羧乙基)膦與1-5μl0.5-5mm適配體混合，靜置活化1-6h后，滴加于電解質(zhì)柵控石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管器件的柵極表面，4-20℃修飾0.5-10h；洗凈柵極后，用100-300μl?5-30mm巰基乙醇進(jìn)行表面活性位點(diǎn)封閉6-18h；再用去離子水進(jìn)行沖洗，制得基于sggt的n-l-乳酰-l-苯丙氨酸傳感器。

9、進(jìn)一步的，所述適配體為l-乳酸核酸適配體和l-苯丙氨酸核酸適配體。

10、進(jìn)一步的，所述l-乳酸適配體序列為

11、gacgacgagtagcgcgtatgaatgcttttctatggagtcgtc；所述l-苯丙氨酸適配體序列為cgacgaggctggatgcatccggatgttcgatgtcg。

12、進(jìn)一步的，所述步驟(2)中不同濃度為：l-乳酸的濃度為0、300pm、1nm、3nm、10nm、30nm、100nm和300nm；所述l-苯丙氨酸的濃度為0、3nm、10nm、30nm、100nm、300nm和1000nm。

13、進(jìn)一步的，所述步驟(4)中建立濃度關(guān)系模型的步驟為：將raw?264.7細(xì)胞于含有10％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在24h進(jìn)行取樣，進(jìn)行樣品前處理后，利用乳酸試劑盒測(cè)定樣品中l(wèi)-乳酸的含量，并建立液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)l-苯丙氨酸與n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的含量；分析l-乳酸、l-苯丙氨酸和n-l-乳酰-l-苯丙氨酸濃度的關(guān)系，建立濃度關(guān)系模型。進(jìn)一步的，所述濃度關(guān)系模型為[lac-phe]＝1.73e-4[lac][phe]+4.17，[lac-phe]為lac-phe濃度，[lac]和[phe]分別為lac濃度和phe濃度。

14、進(jìn)一步的，所述步驟(5)中的細(xì)胞培養(yǎng)基為在培養(yǎng)raw264.7細(xì)胞24h之后的細(xì)胞培養(yǎng)基。

15、有益效果：

16、1.本發(fā)明中傳感器解決了電化學(xué)柵控石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管存在的選擇性弱的劣勢(shì)，使用l-乳酸適配體和l-苯丙氨酸適配體同時(shí)對(duì)sggt的柵極進(jìn)行修飾，傳感器可以通過(guò)柵極的拆分與組合用于細(xì)胞培養(yǎng)基樣品中的l-乳酸、l-苯丙氨酸或n-l-乳酰-l-苯丙氨酸中一種或多種物質(zhì)的快速檢測(cè)；

17、2.本發(fā)明制備的傳感器所使用的l-乳酸適配體與l-苯丙氨酸適配體具有手性選擇性，可以避免不同手性的乳酸和苯丙氨酸產(chǎn)生的干擾作用；且傳感器檢測(cè)的乳酸和苯丙氨酸僅為l構(gòu)型，因此通過(guò)建立細(xì)胞濃度模型也可以避免不同構(gòu)型的乳酸苯丙氨酸可能造成的信號(hào)干擾；

18、3.本發(fā)明制備的傳感器可以使用培養(yǎng)基樣品直接進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理，操作簡(jiǎn)單；

19、4.本發(fā)明中制備的n-l-乳酰-l-苯丙氨酸傳感器適用于細(xì)胞中n-l-乳酰-l-苯丙氨酸的檢測(cè)，有助于快速分析細(xì)胞中n-l-乳酰-l-苯丙氨酸代謝水平，具有一定實(shí)用價(jià)值。