本發(fā)明屬于光學(xué)顯微成像領(lǐng)域，尤其涉及一種二次諧波高分辨率成像方法及系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

近年隨著激光技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，利用二次諧波(second harmonic generation,SHG)進(jìn)行生物組織的三維成像成為生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域中的熱門課題，引起了廣泛關(guān)注。二次諧波成像是一種三維光學(xué)成像技術(shù)，具有非線性光學(xué)成像所特有的高空間分辨率和高成像深度。

SHG的激發(fā)效率與激發(fā)光的平方成正比，因此僅在焦點(diǎn)附近才有足夠的光子能量來激發(fā)，非線性效應(yīng)的強(qiáng)局域性減少了成像時(shí)非焦點(diǎn)處發(fā)光產(chǎn)生的背景干擾，提高了信噪比和三維空間分辨率。同時(shí)使得非焦平面上的光漂白和光毒性大大降低，因此能長(zhǎng)時(shí)間對(duì)樣品進(jìn)行成像而不影響其活性。由于二次諧波顯微成像使用近紅外的激發(fā)光，組織吸收和散射效應(yīng)較小，激發(fā)光能深入組織內(nèi)部，相比傳統(tǒng)的顯微鏡，如激光掃描共焦顯微鏡，可以做更深層的成像。此外，二次諧波成像技術(shù)的發(fā)射與激發(fā)波長(zhǎng)相距較遠(yuǎn)，因此信號(hào)易于有效分離。對(duì)活體生物樣品，SHG還具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。SHG一般為非共振過程，光子在生物樣品中只發(fā)生非線性散射，不被吸收，因此不產(chǎn)生伴隨的光化學(xué)過程，可減小對(duì)生物樣品的損傷。另外，在許多情況下，組織的病變過程中的線性光學(xué)特性變化很小，傳統(tǒng)的線性光學(xué)成像技術(shù)較難檢測(cè)。生物組織發(fā)生病變時(shí)一般都會(huì)伴隨著組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及分子結(jié)構(gòu)的變化，SHG對(duì)組織微觀結(jié)構(gòu)變化高度敏感，所以有望將該方法用于某些疾病(如糖尿病、動(dòng)脈硬化和一些視網(wǎng)膜疾病等)的早期檢測(cè)和診斷。二次諧波顯微成像技術(shù)不需進(jìn)行樣品染色，因此對(duì)某些不能進(jìn)行熒光標(biāo)記的非中心對(duì)稱樣品，采用二次諧波顯微成像技術(shù)檢測(cè)有效。

然而，目前二次諧波顯微成像的空間分辨率還受到物鏡數(shù)值孔徑等條件的限制，無法滿足所需要的更高的空間分辨率成像要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種二次諧波高分辨成像方法及系統(tǒng)，旨在提高二次諧波顯微成像的空間分辨率，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

本發(fā)明提供了一種二次諧波高分辨率成像方法，包括以下步驟：

產(chǎn)生激發(fā)光；

對(duì)所述激發(fā)光進(jìn)行調(diào)制，形成條紋激發(fā)光斑；

移動(dòng)所述條紋激發(fā)光斑，并且在每移動(dòng)一次之后，將所述條紋激發(fā)光斑在樣品上進(jìn)行時(shí)間空間聚焦，以在樣品上激發(fā)出二次諧波；

逐次探測(cè)激發(fā)出的所述二次諧波；

根據(jù)探測(cè)到的所有二次諧波進(jìn)行頻譜分析，獲得圖像。

進(jìn)一步地，所述對(duì)所述激發(fā)光進(jìn)行調(diào)制，形成條紋激發(fā)光斑，包括：

先將所述激發(fā)光準(zhǔn)直，再將準(zhǔn)直后的激發(fā)光轉(zhuǎn)換為線偏振光，再利用空間光調(diào)制器對(duì)所述線偏振光進(jìn)行相位調(diào)制，產(chǎn)生條紋激發(fā)光斑。

進(jìn)一步地，所述將所述條紋激發(fā)光斑在樣品上進(jìn)行時(shí)間空間聚焦，包括：

對(duì)所述條紋激發(fā)光斑進(jìn)行時(shí)間聚焦，同時(shí)使時(shí)間焦點(diǎn)與所述樣品的物平面重合。

進(jìn)一步地，所述逐次探測(cè)激發(fā)出的所述二次諧波，包括：

在每次探測(cè)時(shí)，利用前向和/或背向二次諧波效應(yīng)對(duì)所述激發(fā)出的二次諧波進(jìn)行探測(cè)。

本發(fā)明還提供了一種二次諧波高分辨率成像系統(tǒng)，包括：

激發(fā)光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光；

空間光調(diào)制器，用于調(diào)制激發(fā)光，以產(chǎn)生條紋激光光斑；

移動(dòng)控制單元，用于控制所述空間光調(diào)制器所產(chǎn)生的條紋激光光斑進(jìn)行移動(dòng)；

光柵，用于使每次移動(dòng)后的所述條紋激光光斑在樣品上進(jìn)行時(shí)間聚焦，且使時(shí)間焦點(diǎn)與所述樣品的物平面重合，以在樣品上激發(fā)出二次諧波；

物鏡，用于收集產(chǎn)生的二次諧波；

探測(cè)器，用于記錄二次諧波。

進(jìn)一步地，所述激發(fā)光源與所述空間光調(diào)制器之間還設(shè)有：

擴(kuò)束準(zhǔn)直裝置，用于調(diào)整所述激發(fā)光的尺寸并進(jìn)行準(zhǔn)直；

半波片，用于將準(zhǔn)直之后的激發(fā)光變成線偏振光。

進(jìn)一步地，所述空間光調(diào)制器與所述光柵之間還設(shè)有：

4f系統(tǒng)，用于將所述激發(fā)光中的0級(jí)衍射光截止。

進(jìn)一步地，所述4f系統(tǒng)包括第一透鏡、第二透鏡以及一個(gè)孔徑光闌，所述孔徑光闌置于第一透鏡的后焦面上，且第一透鏡的后焦面與第二透鏡的前焦面重合。

進(jìn)一步地，所述物鏡與所述探測(cè)器之間還設(shè)有：

濾光片，用于篩選所需的二次諧波。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于：本發(fā)明提供的二次諧波高分辨成像方法，先對(duì)激發(fā)光進(jìn)行調(diào)制，形成條紋激發(fā)光斑；然后通過移動(dòng)所述條紋激發(fā)光斑，并且在每移動(dòng)一次之后，將所述條紋激發(fā)光斑在樣品上進(jìn)行時(shí)間空間聚焦，以在樣品上激發(fā)出二次諧波；最后逐次探測(cè)激發(fā)出的所述二次諧波，并根據(jù)探測(cè)到的所有二次諧波進(jìn)行頻譜分析，獲得高空間分辨率的圖像。

本發(fā)明提供的二次諧波高分辨成像系統(tǒng)，利用空間光調(diào)制器在顯微物鏡的物面形成條紋光斑對(duì)物體激發(fā)，并控制空間光調(diào)制器移動(dòng)條紋，利用探測(cè)器記錄激發(fā)產(chǎn)生的二次諧波，記錄的二次諧波包含了超過衍射極限的高頻信息。由于激發(fā)光條紋與物體結(jié)構(gòu)信息疊加，使得系統(tǒng)探測(cè)到更高頻率的物體信息，從而提高成像橫向分辨率。同時(shí)利用光柵對(duì)激光進(jìn)行時(shí)間聚焦，只在時(shí)間焦點(diǎn)處才有二次諧波產(chǎn)生，從而又提高了成像的軸向分辨率，并且可以進(jìn)行層析成像。

本發(fā)明提供的二次諧波高分辨成像系統(tǒng)，結(jié)合所發(fā)明的成像方法對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了設(shè)置，不僅結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，而且成像效果顯著。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的二次諧波高分辨成像方法的實(shí)現(xiàn)流程示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的二次諧波高分辨成像系統(tǒng)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面介紹一種二次諧波高分辨成像方法，請(qǐng)參閱圖1，本發(fā)明實(shí)施例提供的二次諧波高分辨成像方法，包括：

S101、產(chǎn)生激發(fā)光；

具體地，通過激發(fā)光源產(chǎn)生激發(fā)光，可以為激光器。

S102、對(duì)激發(fā)光進(jìn)行調(diào)制，形成條紋激發(fā)光斑；

具體地，先將激光進(jìn)行準(zhǔn)直調(diào)整之后，變成線偏振光，然后通過空間光調(diào)制器和透鏡對(duì)激發(fā)光進(jìn)行調(diào)整，形成條紋激發(fā)光斑。

S103、移動(dòng)所述條紋激發(fā)光斑，并且在每移動(dòng)一次之后，對(duì)將所述條紋激發(fā)光斑在樣品上進(jìn)行時(shí)間空間聚焦，以在樣品上激發(fā)出二次諧波；

具體地，先利用光柵將條紋激光光斑形成頻率連續(xù)分布的各組分光，然后與管鏡、物鏡等配合使用，將被光柵分開的連續(xù)頻率組分的光重新重疊，通過時(shí)間空間聚焦作用在樣品上激發(fā)出SHG(二次諧波)信號(hào)。

S104、逐次探測(cè)激發(fā)出的所述二次諧波；

具體地，探測(cè)二次諧波的光路為背向探測(cè)和/或前向探測(cè)，探測(cè)到的二次諧波會(huì)被相應(yīng)連接的探測(cè)器接收。移動(dòng)所述條紋光斑，使樣品上激發(fā)出新的二次諧波，探測(cè)新的二次諧波；

具體地，對(duì)于已形成的條紋激發(fā)光斑，讓條紋在某一個(gè)方向進(jìn)行移動(dòng)，每移動(dòng)條紋一次，探測(cè)器對(duì)物成像一次。

S105、根據(jù)探測(cè)到的所有二次諧波進(jìn)行頻譜分析，獲得圖像。

具體地，利用這些移動(dòng)條紋對(duì)樣本所成的像進(jìn)行頻譜分析，可以獲得系統(tǒng)截止頻率以外的高頻分量，即可提高該方向的分辨率。轉(zhuǎn)動(dòng)條紋，再重復(fù)上述過程，即移動(dòng)條紋成像，就可提高該方向的分辨率。依次類推，就可以提高該平面內(nèi)各個(gè)方向的成像分辨率。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種二次諧波高分辨率成像系統(tǒng)，包括：

激發(fā)光源，用于產(chǎn)生激發(fā)光；

空間光調(diào)制器，用于調(diào)制激發(fā)光，以產(chǎn)生條紋激光光斑；

移動(dòng)控制單元，用于控制所述空間光調(diào)制器所產(chǎn)生的條紋激光光斑進(jìn)行移動(dòng)；

光柵，用于使每次移動(dòng)后的所述條紋激光光斑在樣品上進(jìn)行時(shí)間聚焦，且使時(shí)間焦點(diǎn)與所述樣品的物平面重合，以在樣品上激發(fā)出二次諧波；

物鏡，用于收集產(chǎn)生的二次諧波；

探測(cè)器，用于記錄二次諧波。

如圖2所示，為本發(fā)明的二次諧波高分辨成像系統(tǒng)的一較佳實(shí)施例。其中所述系統(tǒng)包括激發(fā)光源1，空間光調(diào)制器5，光柵11，物鏡15以及探測(cè)器19和23。

具體地，激發(fā)光源1采用鈦寶石飛秒激光器，產(chǎn)生的激光為飛秒激光，該激光可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的二次諧波激發(fā)。激發(fā)光源1和空間光調(diào)制器5之間設(shè)有第一擴(kuò)束準(zhǔn)直透鏡2和第二擴(kuò)束準(zhǔn)直透鏡3構(gòu)成的擴(kuò)束準(zhǔn)直裝置、半波片4。激發(fā)光源1產(chǎn)生的激光經(jīng)由擴(kuò)束準(zhǔn)直透鏡2和擴(kuò)束準(zhǔn)直透鏡3構(gòu)成的擴(kuò)束準(zhǔn)直裝置，變成所需尺寸的準(zhǔn)直光，準(zhǔn)直之后的激光經(jīng)半波片4變成線偏振光。

具體地，在本實(shí)例中，空間光調(diào)制器5采用的是全反射純相位型空間光調(diào)制器，利用SLM實(shí)現(xiàn)對(duì)入射光的相位調(diào)制，產(chǎn)生我們所需的激發(fā)條紋光斑。

具體地，空間光調(diào)制器5與光柵11之間設(shè)有4f系統(tǒng)，所述4f系統(tǒng)由一對(duì)透鏡——第一透鏡6和第二透鏡8，以及一個(gè)孔徑光闌7組成?？讖焦怅@7擺在第一透鏡6的后焦面上，第一透鏡6的后焦面和第二透鏡8的前焦面重合。該4f系統(tǒng)將激光中不需要的0級(jí)衍射光截止，即進(jìn)行空間濾波。

具體地，光柵11與4f系統(tǒng)之間連接有半波片9和傅里葉透鏡10，其中光柵11為閃耀光柵。其中，半波片9的偏振方向和半波片4的偏振方向相同。閃耀光柵11面和傅里葉透鏡10的后焦面重合。經(jīng)過半波片9后的激光光斑經(jīng)過傅里葉透鏡10后，在閃耀光柵11面即傅里葉透鏡10的后焦面上形成我們所需要條紋形狀的激光光斑，然后以閃耀角入射閃耀光柵11。經(jīng)過閃耀光柵11后，形成按照光譜頻率連續(xù)分布的各組分光。

具體地，光柵11與物鏡15之間設(shè)有管鏡12、激發(fā)濾光片13、雙色鏡14。在本實(shí)例中，物鏡15的焦平面和時(shí)間聚焦面重合。不同頻率連續(xù)分布的激光經(jīng)過管鏡12、激發(fā)濾光片13、雙色鏡14，并通過物鏡15的聚焦作用，在物鏡15的焦平面即時(shí)間聚焦面上被光柵分開的連續(xù)頻率組分的光將重新重疊。通過時(shí)間空間聚焦作用在物平面16上的激發(fā)出SHG信號(hào)。

以下對(duì)本實(shí)施例中的探測(cè)光路的結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明實(shí)例探測(cè)光路分為兩部分——背向探測(cè)和前向探測(cè)。需要說明的是，兩部分可以分開使用也可以結(jié)合起來使用。

具體地，背向探測(cè)光路包括雙色鏡14，濾光片17，管鏡18以及被探測(cè)器19。在實(shí)施例中，背向探測(cè)光路中雙色鏡14對(duì)中心波長(zhǎng)為810nm的脈沖激光高透，對(duì)波長(zhǎng)為405nm的SHG信號(hào)高反，雙色鏡14與入射光束之間的夾角為45°或135°。物平面16產(chǎn)生的背向SHG被足夠大數(shù)值孔徑的物鏡115接收，經(jīng)雙色鏡114反射后，在傳導(dǎo)光路上依次經(jīng)過接收濾光片17、管鏡18并被探測(cè)器19接收。

具體地，前向探測(cè)光路包括物鏡20，濾光片21，管鏡22以及探測(cè)器23。物平面16產(chǎn)生的前向SHG向前傳播，被數(shù)值孔徑足夠大的物鏡20收集之后經(jīng)過接收濾光片21、管鏡22并被探測(cè)器23接收。

在本實(shí)例中，濾光片17、21采樣窄帶濾光片，僅讓SHG通過，并進(jìn)入后續(xù)系統(tǒng)。管鏡18和22將信號(hào)收集在探測(cè)器上19、23上。探測(cè)器19和23采用面探測(cè)器，優(yōu)選為CCD相機(jī)或CMOS相機(jī)。

本發(fā)明實(shí)施例實(shí)現(xiàn)二次諧波高分辨率成像的理論公式包括：

激發(fā)二次諧波的激發(fā)條紋光為：

其中代表不同相位，m＝1,2,…,M。

經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)之后探測(cè)器接收到的光強(qiáng)：

其中h_2p(x)是有效雙光子點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，h_em(x)該系統(tǒng)發(fā)射點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，s(x)是樣本函數(shù)。

傅里葉變換之后：

具體地：

可將各個(gè)頻率分量進(jìn)行分離，復(fù)位并相加，并轉(zhuǎn)換到時(shí)域，即可得到該方向超分辨的圖像。

在本實(shí)例中，移動(dòng)控制單元可使用計(jì)算機(jī)?？臻g光調(diào)制器5和探測(cè)器19、23與如計(jì)算機(jī)連接。通過計(jì)算機(jī)控制空間光調(diào)制器5可以形成條紋光斑，并可讓條紋在某一個(gè)方向進(jìn)行移動(dòng)，每移動(dòng)條紋一次，探測(cè)器對(duì)物成像一次，并存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。利用這些移動(dòng)條紋對(duì)樣本所成的像進(jìn)行頻譜分析，可以獲得系統(tǒng)截止頻率以外的高頻分量，即可提高該方向的分辨率。轉(zhuǎn)動(dòng)條紋，再重復(fù)上述過程，即移動(dòng)條紋成像，就可提高該方向的分辨率。依次類推，就可以提高該平面內(nèi)各個(gè)方向的成像分辨率。

本實(shí)施例中通過時(shí)間空間聚焦作用，可以進(jìn)行層析成像，提高軸向分辨率。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。