液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)柑橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)，尤其涉及一種液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)柑橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法。該發(fā)明采用QuEChERS凈化技術(shù)-超高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)，優(yōu)化分析程序和參數(shù)，對(duì)常用于柑橘保鮮的多種保鮮劑殘留檢測(cè)進(jìn)行定性和定量方法研究，分別是多菌靈、噻菌靈、咪酰胺、抑霉唑、甲基硫菌靈、咪酰胺和2,4-D。從而建立高靈敏度、準(zhǔn)確、快速、能同時(shí)檢測(cè)多種防腐保鮮劑殘留的檢測(cè)技術(shù)。
【專利說(shuō)明】液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)柏橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)，尤其涉及一種液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)巧橘中多種防腐保 鮮劑殘留的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)巧橘種植面積和產(chǎn)量分別約占世界巧橘總面積和總產(chǎn)量的39%和31. 6%， 位列世界第一。巧橘富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和獨(dú)特的生理活性物質(zhì)，深受人們的喜愛(ài)。巧橘除 用于鮮食外，也可加工成多種副產(chǎn)品。巧橘是我國(guó)南方地區(qū)栽培面積最大、經(jīng)濟(jì)地位最重要 的果樹(shù)之一，浙江省是我國(guó)重要的巧橘生產(chǎn)基地。近年來(lái)，隨著巧橘產(chǎn)量的激增，巧橘供求 關(guān)系發(fā)生了根本的變化，由賣方市場(chǎng)轉(zhuǎn)向了買(mǎi)方市場(chǎng)，由數(shù)量型消費(fèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)量型消費(fèi)。巧 橘產(chǎn)量的連年增長(zhǎng)，使得巧橘的國(guó)內(nèi)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)越來(lái)越激烈，因此，擴(kuò)大巧橘出口量是增加巧 橘銷售的重要途徑。浙江省巧橘W出口鮮果和橘子罐頭為主，W歐美、俄羅斯、日本和東南 亞為主要市場(chǎng)。
[0003] 然而，我國(guó)出口的一些農(nóng)產(chǎn)品往往由于有毒有害物質(zhì)殘留量超過(guò)外方的限制標(biāo) 準(zhǔn)，被拒收、扣留、退貨、索賠和終止合同的現(xiàn)象屢屢發(fā)生，部分傳統(tǒng)大宗出口創(chuàng)匯商品被迫 退出國(guó)際市場(chǎng)。我國(guó)是第一水果生產(chǎn)大國(guó)，但在世界水果出口貿(mào)易中我國(guó)水果所占份額很 小，而且售價(jià)低，有毒有害物質(zhì)含量超標(biāo)是造成該一局面的原因之一。發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)設(shè)立嚴(yán) 格限量標(biāo)準(zhǔn)，一方面保證本國(guó)公民的身體健康，一方面為阻礙包括水果在內(nèi)的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)入 國(guó)際市場(chǎng)制造技術(shù)貿(mào)易壁壘。
[0004] 近年來(lái)，巧橘中的化學(xué)防腐保鮮劑對(duì)人體的危害越來(lái)越受到人們的關(guān)注。由于巧 橘在采摘后的膽藏中由于自身生理活動(dòng)和有害生物危害等原因，會(huì)造成損失。目前我國(guó)普 遍使用防腐保鮮劑來(lái)降低因病原微生物浸染而導(dǎo)致巧橘在膽藏期的損失，其中化學(xué)防腐劑 因其效果好、成本低、使用方便等優(yōu)勢(shì)占據(jù)了市場(chǎng)主導(dǎo)地位?；瘜W(xué)防腐保鮮劑雖然具有良好 的防腐保鮮的作用，但大多化學(xué)防腐保鮮劑有不同程度的毒性，巧橘中的保鮮劑殘留會(huì)對(duì) 人體健康產(chǎn)生不利影響，甚至出現(xiàn)致癌、致崎、致突變等情況，化學(xué)防腐保鮮劑在巧橘膽藏 中的應(yīng)用造成的高毒高殘留問(wèn)題因此也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。一些發(fā)達(dá)國(guó)家修訂的水果 或巧橘中化學(xué)防腐保鮮劑限量要求日趨嚴(yán)格。例如我國(guó)巧橘中咪鮮胺限量為5mg/kg，而加 拿大對(duì)其的限量為0. Img/kg。日本2006年實(shí)行的農(nóng)藥、獸藥及相關(guān)化學(xué)物質(zhì)"肯定列表制 度"規(guī)定水果中苯菌靈，硫菌靈，甲基硫菌靈和多菌靈總量最低限量不超過(guò)2mg/kg等。該些 都有可能成為國(guó)外限制我國(guó)巧橘出口的技術(shù)壁壘，影響我國(guó)橘農(nóng)增收。因此，為幫助出口企 業(yè)降低風(fēng)險(xiǎn)，有效規(guī)避發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)我國(guó)出口巧橘的技術(shù)壁壘，發(fā)展快速、可靠、靈敏的防腐 保鮮劑殘留檢測(cè)技術(shù)無(wú)疑是控制有毒有害物質(zhì)殘留、保障進(jìn)出口食品安全、避免國(guó)際間有 關(guān)貿(mào)易爭(zhēng)端的基礎(chǔ)。本研究具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
[0005] 我國(guó)發(fā)布實(shí)施的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量KGB2763-2014)規(guī)定了水果 中殺菌劑的最大殘留限量，其中，多數(shù)殺菌劑可用作食品保鮮劑。多菌靈、喔菌靈、咪醜胺、 抑霉哇、甲基硫菌靈、咪醜胺、2, 4-D等都是常用的化學(xué)防腐保鮮劑，廣泛應(yīng)用于水果等多種 作物生長(zhǎng)期和儲(chǔ)存期真菌性病害的防治，若使用不當(dāng)，會(huì)在水果及由水果制成的果汁中殘 留。
[0006] 目前，雖然已有涂膜、減壓處理、高壓處理、天然保鮮劑、生物保鮮劑等巧橘保鮮新 技術(shù)的研究與報(bào)道，但受到技術(shù)、成本等因素影響，我國(guó)對(duì)于巧橘防腐保鮮處理普遍使用的 仍是化學(xué)防腐保鮮劑。針對(duì)防腐保鮮劑的檢測(cè)分析方法，已報(bào)道的主要有高效液相色譜、氣 相色譜、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用及酶聯(lián)免疫法等。氣相色譜法或液相色譜法易受雜質(zhì)干擾，且 靈敏度低；酶聯(lián)免疫方法操作過(guò)程繁瑣，且條件要求苛刻；而液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法溶劑 消耗量大、耗時(shí)長(zhǎng)。
[0007] 由于防腐保鮮劑混配使用具有協(xié)同作用，我國(guó)巧橘主產(chǎn)區(qū)大多采用混配藥劑來(lái)提 高巧橘的防腐保鮮效果。隨著混配防腐保鮮劑的廣泛應(yīng)用，單個(gè)防腐保鮮劑檢測(cè)方法已不 能滿足現(xiàn)實(shí)需要，迫切需要能夠快速、可靠的高通量檢測(cè)方法，該對(duì)于保障消費(fèi)者健康，避 免和減少不必要的農(nóng)業(yè)損失和國(guó)際貿(mào)易爭(zhēng)端具有重要的理論和實(shí)踐意義。
[0008] QuEQiERS 凈化技術(shù)為如cik, Easy, Qieap, Effective, Rugged, Safe 首字母的 縮寫(xiě)，中文解釋為快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效、安全的分析前處理方法，2003年由美國(guó)農(nóng)業(yè)部 MAnastassiades等共同研發(fā)，后經(jīng)過(guò)多方面的驗(yàn)證和改進(jìn)，正式提出了如E化ERS方法?，F(xiàn) 在如E化邸S已經(jīng)成為了全球檢測(cè)水果、蔬菜中農(nóng)殘時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)樣品處理方法。除此W外，其 應(yīng)用也涉及到越來(lái)越多的不同領(lǐng)域，比如肉類、血液樣品、酒、甚至±壤中抗生素、藥物、濫 用藥、還有其他污染物的檢測(cè)。
[0009] 在HPLC基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的超高效液相色譜扣化C)技術(shù)采用了 3.5 ym，甚至 1. 7 y m細(xì)顆粒固定化比起傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)，UPLC提供了更大的色譜峰容量、更高的分辨 率和靈敏度W及更快的分析速度。由于巧橘中防腐保鮮劑有些化學(xué)結(jié)構(gòu)，性質(zhì)類似，很難在 短時(shí)間內(nèi)同時(shí)分離，因此本研究采用快速高效液相扣PLC)能有效的縮短分析時(shí)間、提高色 譜分辨率和分析通量。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法是近幾年興起的新技術(shù)，由于液質(zhì)聯(lián)用 技術(shù)具有極高的靈敏度，適合進(jìn)行痕量分析，同時(shí)可提供的分子量和碎片質(zhì)量等結(jié)構(gòu)信息， 可靠性較高，可同時(shí)測(cè)定多種物質(zhì)，歐盟、美國(guó)等均將液質(zhì)聯(lián)用方法列為確證方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)巧橘中 多種防腐保鮮劑殘留的方法，該方法具有高靈敏度、準(zhǔn)確、快速、能同時(shí)檢測(cè)多種防腐保鮮 劑殘留的特點(diǎn)。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了W下的技術(shù)方案：
[0012] 液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)巧橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法，所述的多種防腐保鮮劑 為多菌靈、喔菌靈、咪醜胺、抑霉哇、甲基硫菌靈、咪醜胺和2, 4-滴，該方法包括W下的步 驟：
[0013] 1)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制
[0014] 用十萬(wàn)分之一天平準(zhǔn)確稱取7種保鮮劑標(biāo)準(zhǔn)品IOmg于燒杯中，精確至0. Img,加己 膳溶解并定容至IOmL容量瓶中，其中喔菌靈用甲醇溶解，多菌靈用5%甲酸己膳溶解，混勻 配制成濃度為IOOOy g/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，在冰箱中TC?4C保存；
[001引。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液
[0016] 分別準(zhǔn)確移取ImL各單標(biāo)儲(chǔ)備液置于IOOmL蹤色容量瓶中，用己膳定容至刻度， 配成IOy g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用稀釋成化g/mL、 5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，所述的己膳-水溶液含 0. 15%甲酸，己膳-水的體積比為1:1，各種標(biāo)準(zhǔn)溶液密封保存于4C冰箱中；
[0017] 3)試樣制備
[0018] 取200g帶皮枯橘樣品經(jīng)四分法選取一定量的樣本，經(jīng)粉碎或組織搗碎機(jī)勻漿，裝 入樣品袋中，密封、標(biāo)記、rc?4C冰箱中冷藏待用；
[001引 4)樣品提取
[0020] 稱取試樣IOg于50血具塞離也管中，精確至0. Olg,加入20血5%甲酸-己膳溶液， 縱潤(rùn)混合2min，加入Ig氯化軸鹽析至少30min，然后W 600化/min離也5min待凈化； [00川 W樣品凈化
[002引稱取900mg無(wú)水硫酸鎮(zhèn)、150mg PSA、150mg C18于15血塑料離也管中，混勻作為凈 化試劑；準(zhǔn)確移取6血離也后的上清液于凈化管中，潤(rùn)旋混勻，W 3000r/min離也5min，取 1血凈化后上清液用蒸觸水稀釋一倍后過(guò)0. 22 y m濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定； [002引 6)色譜測(cè)定
[0024] a)色譜柱；Hypersil GOLD C18, 1. 9 y m, 2. ImmX 50mm，或相當(dāng)者；
[00巧]b)梯度洗脫條件：
[0026]

【權(quán)利要求】
1.液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)柑橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法，所述的多種防腐保鮮劑為 多菌靈、噻菌靈、嘧霉胺、抑霉唑、咪酰胺、甲基硫菌靈和2, 4-滴，其特征在于該方法包括以 下的步驟： 1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 用十萬(wàn)分之一天平準(zhǔn)確稱取7種保鮮劑標(biāo)準(zhǔn)品IOmg于燒杯中，精確至0.lmg，加乙腈溶 解并定容至IOmL容量瓶中，其中噻菌靈用甲醇溶解，多菌靈用5%甲酸乙腈溶解，混勻配制 成濃度為ΙΟΟΟμg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，在冰箱中1°C?4°C保存； 2) 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 分別準(zhǔn)確移取ImL各單標(biāo)儲(chǔ)備液置于IOOmL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度,配成 10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用稀釋成2ng/mL、5ng/ mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,所述的乙腈-水溶液含0· 15% 甲酸，乙腈-水的體積比為1:1，各種標(biāo)準(zhǔn)溶液密封保存于4°C冰箱中； 3) 試樣制備 取200g帶皮柑橘樣品經(jīng)四分法選取一定量的樣本，經(jīng)粉碎或組織搗碎機(jī)勻漿，裝入樣 品袋中，S封、標(biāo)記、IC?4C冰箱中冷減待用； 4) 樣品提取 稱取試樣IOg于50mL具塞離心管中，精確至0. 01g，加入20mL5%甲酸-乙腈溶液，漩 潤(rùn)混合2min，加入Ig氯化鈉鹽析至少30min，然后以6000r/min離心5min待凈化； 5) 樣品凈化 稱取900mg無(wú)水硫酸鎂、150mgPSA、150mgC18于15mL塑料離心管中，混勻作為凈化 試劑；準(zhǔn)確移取6mL離心后的上清液于凈化管中，渦旋混勻，以3000r/min離心5min，取ImL 凈化后上清液用蒸餾水稀釋一倍后過(guò)0. 22μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定； 6) 色譜測(cè)定 a)色譜柱：Hypersil GOLD018，1.94111，2.1111111\5〇111111，或相當(dāng)者； b) 梯度洗脫條件:_
c) 柱溫：35°C d) 進(jìn)樣量：2yL; 7) 質(zhì)譜測(cè)定 a) 離子源：電噴霧離子源； b) 掃描方式：正負(fù)切換掃描； c) 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)； d) 毛細(xì)管溫度：350°C; e) 蒸發(fā)溫度：300°C; f) 電噴霧電壓：+3500(-3000)V; g) 鞘氣：30arb; h) 輔助氣：IOarb; i) 碰撞氣：氦氣； j) SRM監(jiān)測(cè)離子對(duì)、S-Lens電壓、碰撞電壓、掃描模式和保留時(shí)間如下：
8) 儀器測(cè)定 樣品進(jìn)樣的程序?yàn)椋涸噭┛瞻住?biāo)準(zhǔn)工作曲線、樣品空白、樣品添加與實(shí)際樣品，重復(fù)以 上步驟； 9) 定量方法 按步驟8)進(jìn)樣，用色譜工作站建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，樣品采用工作曲線定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液質(zhì)聯(lián)用儀同時(shí)檢測(cè)柑橘中多種防腐保鮮劑殘留的方法，其 特征在于所述的柑橘為蜜桔、櫳柑或胡柚。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104237414SQ201410486081
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】彭芳, 雷美康, 祝子銅, 吳曉勤, 徐佳文 申請(qǐng)人:衢州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心