同時(shí)測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了同時(shí)測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法，包括有以下步驟：1）配制流動(dòng)相、設(shè)置色譜條件；2）制備貯備液；3）專屬性考察；4）線性關(guān)系考察；5）精密度試驗(yàn)；6）穩(wěn)定性試驗(yàn)；7）樣品含量測(cè)定。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的能夠同時(shí)測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法，具有操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、測(cè)定時(shí)間方面限制較小的優(yōu)點(diǎn),同樣適用于其他激素類藥物。
【專利說(shuō)明】同時(shí)測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及肉類品質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及同時(shí)測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前，我國(guó)食品安全問(wèn)題因三鹿奶粉中“三聚氰胺”事件而受到更極大關(guān)注。除食品加工中惡意添加外，食品中污染的化學(xué)物質(zhì)更多的來(lái)自于喂養(yǎng)畜禽所使用的動(dòng)物飼料、治病所用獸藥殘留及催熟植物所用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等。激素類藥物在牛羊產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用可表現(xiàn)在提高樣的繁殖性能，免疫去勢(shì)，高飼料報(bào)酬、促進(jìn)生長(zhǎng)，改善牛羊肉品質(zhì)，促進(jìn)泌乳牛羊的產(chǎn)奶量等。我們所食用的牛羊肉也不可避免的會(huì)有雌激素殘留，而這些激素就會(huì)通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)積累，可誘發(fā)癌變，對(duì)生殖與神經(jīng)等系統(tǒng)帶來(lái)影響，還造成嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。還能增加?jì)D女得子宮癌的可能，使生殖道產(chǎn)生炎癥，使女性提前發(fā)育，使男性生殖器官發(fā)生異常與病變及女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位發(fā)生率上升，因此，對(duì)牛羊肉的監(jiān)測(cè)也是保證安全的措施之一。但是目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中只有己烯雌酚的檢測(cè)方法，而其余的沒(méi)有明確的測(cè)定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種可測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:同時(shí)測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法，包括有以下步驟:
1)配制流動(dòng)相、設(shè)置色譜條件:
按體積比甲醇:磷酸氫二鈉為80:20配制流動(dòng)相，色譜條件設(shè)置為檢測(cè)波長(zhǎng)210-400nm，流速為 1.0ml/min，進(jìn)樣量為 10 μ I ；
2)貯備液的制備:
①準(zhǔn)確稱取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)品各50mg，在50ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，制成1.0 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，備用；
②取批號(hào)不同的牛羊肉樣品，用甲醇超聲萃取、離心，取兩次離心后的上清液蒸干后加甲醇，制成供試品貯備液，備用；
3)專屬性考察:
在步驟I)所述的色譜條件下，對(duì)牛羊肉樣品中的苯甲酸雌二醇進(jìn)行HPLC分離檢測(cè)；
4)線性關(guān)系考察:
分別精密量取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，在50ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，過(guò)濾、進(jìn)樣并檢測(cè)，以4種混標(biāo)的峰面積比與其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析；
5)精密度試驗(yàn):取同一批號(hào)的牛羊肉供試品貯備液，加混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液后，過(guò)濾進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積測(cè)定4種雌激素的含量；
6)穩(wěn)定性試驗(yàn):
取另一批號(hào)的牛羊肉樣品溶液于室溫避光放置0-72h后，分別進(jìn)樣測(cè)定，每份樣品10μ I ；
7)樣品含量測(cè)定:
將步驟2)中所述的混合標(biāo)準(zhǔn)供試品貯備液，加標(biāo)準(zhǔn)品貯備液后，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的含量。
[0005]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的能夠同時(shí)測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法，具有操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、測(cè)定時(shí)間方面限制較小的優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于其他激素類藥物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0006]圖1為4種雌激素標(biāo)準(zhǔn)樣品圖。
[0007]圖2為蘭州市羊肉樣品四種雌激素檢出圖譜。
[0008]圖3為臨夏州羊肉樣品四種雌激素檢出圖譜。
[0009]圖4為蘭州市牛 肉樣品四種雌激素檢出圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1:
1、材料和方法:
1.1、材料:
1.1.1試劑:
甲醇，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海；
磷酸二氫鈉(NaH2O4.2Η20):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海；
0.043mol/L磷酸二氫鈉溶液:3.4g磷酸二氫鈉(NaH2O4.2H20)溶于水并定容在500mL容量瓶中得到；
1.1.2標(biāo)準(zhǔn)品:
雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品:SIGMA-AL0RICH, product of Germany ；
己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品:SIGMA-AL0RICH，product of USA ；
苯甲酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品:中國(guó)藥品生物制品檢定所 戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品:中國(guó)藥品生物制品檢定所。
[0011]雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備方法:
精密稱取50mg雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇定容在50mL容量瓶中，即得到每個(gè)單標(biāo)的儲(chǔ)備液為！!!^/!!!!^然后分別吸取〗；mL雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合，再將混合儲(chǔ)備液用甲醇分別稀釋至
0.4mg/mL、0.5 mg/mL> 1.0 mg/mL,存放在冰箱中備用。
[0012]1.2、方法:
1.2.1前處理方法:分別在甘肅省蘭州市、靖遠(yuǎn)縣、臨夏州、張掖地區(qū)采集羊肉樣品20份，張掖地區(qū)牛肉樣品20份。稱取粉碎樣品5.0g，放入20mL帶蓋離心管中，加甲醇10.01^，超聲萃取201^11，離心10 min (10000轉(zhuǎn)/min,移出上清液。殘禮:中再加10.0mL甲醇,再超聲萃取20 min，離心10 min (10000轉(zhuǎn)/min)，合并上清液于80°C水浴蒸干。用24mL甲醇溶解殘?jiān)?，?jīng)
0.22 μ m 一次性有機(jī)濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)備上機(jī)。
[0013]1.2.2儀器及條件:
Waters e2695高效液相色譜儀，配有2998 PAD檢測(cè)器；超聲波清洗器；色譜柱:C18，(^5 4 111，15(^4臟；流動(dòng)相:甲醇:磷酸氫二鈉=80:20 ;流速:1.0mL/min ;柱溫:40°C ;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。分別取雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及0.4mg/mL、0.5 mg /mL、L0 mg /mL的混合標(biāo)樣經(jīng)0.45 μ m的有機(jī)濾膜過(guò)濾,取10 μ L依次注入HPLC中，先用標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間定性，再用混合標(biāo)樣做定量標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0014]1.2.3計(jì)算公式:
X=V1CAiV2 ；
式中:
X:樣品中某一種雌激素的含量(mg /Kg)；
C:在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出來(lái)的某一種雌激素的濃度(ng)； V1:樣品的最終溶解體積(mL)；
V2:進(jìn)樣體積(μ L); m:樣品質(zhì)量(g)。
[0015]2、結(jié)果顯示:
如圖1所示為4種雌激素標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)結(jié)果。
[0016]表1為本發(fā)明方法的線性范圍、相關(guān)性及檢出限；
表2為4種組份峰面積(Area)測(cè)定的精密度結(jié)果；
表3為本發(fā)明樣品加標(biāo)回收率結(jié)果；
表4為多個(gè)地區(qū)樣品測(cè)定結(jié)果。
[0017]其中，“一”表示未檢出，檢出量單位為mg/Kg，所測(cè)樣品均為加標(biāo)樣品。
[0018]表1
【權(quán)利要求】
1.同時(shí)測(cè)定牛羊肉中四種雌激素殘留量的方法，其特征在于，包括有以下步驟: 1)配制流動(dòng)相、設(shè)置色譜條件: 按體積比甲醇:磷酸氫二鈉為80:20配制流動(dòng)相，色譜條件設(shè)置為檢測(cè)波長(zhǎng)210-400nm，流速為 1.0ml/min，進(jìn)樣量為 10 μ I ； 2)貯備液的制備: ①準(zhǔn)確稱取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)品各50mg，在50ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，制成1.0 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，備用； ②取批號(hào)不同的牛羊肉樣品，用甲醇超聲萃取、離心，取兩次離心后的上清液蒸干后加甲醇，制成供試品貯備液，備用； 3)專屬性考察: 在步驟I)所述的色譜條件下，對(duì)牛羊肉樣品中的苯甲酸雌二醇進(jìn)行HPLC分離檢測(cè)； 4)線性關(guān)系考察: 分別精密量取己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，在50ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，過(guò)濾、進(jìn)樣并檢測(cè)，以4種混標(biāo)的峰面積比與其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析； 5)精密度試驗(yàn): 取同一批號(hào)的牛羊肉供試品貯備液，加混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液后，過(guò)濾進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積測(cè)定4種雌激素的含量； 6)穩(wěn)定性試驗(yàn): 取另一批號(hào)的牛羊肉樣品溶液于室溫避光放置0-72h后，分別進(jìn)樣測(cè)定，每份樣品10μ I ； 7)樣品含量測(cè)定: 將步驟2)中所述的混合標(biāo)準(zhǔn)供試品貯備液，加標(biāo)準(zhǔn)品貯備液后，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中己烯雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103983708SQ201410187686
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】李維紅, 高雅琴, 熊琳, 杜天慶, 牛春娥, 梁麗娜, 楊曉玲, 郭天芬 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所