檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙及其制備方法，屬于人類艾滋病病毒抗體的檢測試劑領域。它包括依次連接的樣品墊、硝酸纖維膜和吸水墊，所述樣品墊含有超順磁性復合粒子標記重組蛋白A；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有人類艾滋病病毒重組抗原，所述質控線含有能與所述重組蛋白A特異結合的抗重組蛋白A抗體；所述人類艾滋病病毒為人類艾滋病病毒1+2型。本發(fā)明的有益效果是：靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定。
【專利說明】檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于人類艾滋病病毒抗體的檢測【技術領域】，具體涉及一種檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙及其制備方法。
【背景技術】
[0002]艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)，其病原為人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，亦稱艾滋病病毒，該病毒破壞人體的免疫能力，導致免疫系統(tǒng)失去抵抗力，而導致各種疾病及癌癥得以在人體內生存，最后罹患艾滋病。目前，艾滋病不僅已成為嚴重威脅我國人民健康的公共衛(wèi)生問題，且已影響到經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定。人類免疫缺陷病毒(HIV)l+2型抗體的檢測對于艾滋病的診斷和鑒別、流行病學的調查、獻血員的篩選、預后判斷及治療效果的考察和藥物的篩選具有重要的意義。
[0003]超順磁性復合粒子具有良好的磁學特性，由于其受背景干擾小，特別適宜于不含磁性物質的生物樣品的檢測。膠體金和熒光標記分子用于測流免疫層析檢測時，只可在其檢測區(qū)膜表面觀測到約10%的信號分子強度，而用超順磁性復合粒子作為標記材料，則可檢測到檢測區(qū)膜三維立體結構中的所有磁信號分子，可極大提高靈敏度，并可用對應的磁信號檢測儀達到定量測定。因此，超順磁性復合粒子是近年來在LFIAs中受到關注的材料。
[0004]然而，目前報道的生物檢測用磁性納米復合粒子多采用化學法如共沉淀法先制備得到有機相的磁性納米粒子后，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明膠等高分子材料對其表面進行穩(wěn)定化包覆修飾，以得到穩(wěn)定的、水溶性的磁性標記材料。但這些制備修飾方法往往較為繁瑣復雜，得到的超順磁性復合粒子在尺寸大小、生物相容性、飽和磁強度、外磁場響應速度、穩(wěn)定性和標記效率等方面不能同時滿足LFIAs的要求:其尺寸多大于300nm,由于磁珠顆粒偏大，在試紙上的泳動時間較慢，顯色時間較長；而太小的粒子又無法提供足夠的磁共振信號；另外還有生物相容性不穩(wěn)定、磁珠容易聚合等問題；這些不足限制了超順磁性復合粒子在LFIAs中的應用。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供上述免疫層析試紙的制備方法。
[0007]本發(fā)明所采取的技術方案是檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，包括依次連接的樣品墊、硝酸纖維膜和吸水墊，所述樣品墊含有超順磁性復合粒子標記重組蛋白A ；所述硝酸纖維膜包被有相互分離的檢測線和質控線，所述檢測線含有人類艾滋病病毒重組抗原，所述質控線含有能與所述重組蛋白A特異結合的抗重組蛋白A抗體；所述人類艾滋病病毒為人類艾滋病病毒1+2型。其中，吸水墊為樣品在試紙上層析提供動力。
[0008]作為優(yōu)選，所述超順磁性復合粒子標記重組蛋白A是將重組蛋白A和超順磁性復合粒子以肽鍵共價結合形成聚合體。[0009]作為優(yōu)選，所述超順磁性復合粒子標記重組蛋白A的制備方法包括以下步驟:
[0010]a、活化磁性粒子的制備:按重量份數(shù)比，稱取超順磁性復合粒子2?3份、EDC0.5?1.5份和NHSl?3份，混勻，在35°C?40°C下反應20?40分鐘，隨后用緩沖液洗滌，得活化磁性粒子；
[0011]b、含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液制備:按重量份數(shù)比，稱取所述活化磁性粒子2?3份、重組蛋白A0.1?0.2份和硼砂緩沖液0.5?I份，混勻，在35°C?40°C下反應
3?4小時，得含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液；
[0012]C、取所述含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液，加入占整個所述反應液體積0.5%?
1.5%的BSA溶液，混勻，在35°C?40°C下反應20?40分鐘，隨后將反應得到的封閉后磁性粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復合粒子標記重組蛋白A成品。
[0013]進一步地，所述超順磁性復合粒子為超順磁性Fe3O4納米粒子。
[0014]由于超順磁性復合粒子要由免疫層析試紙的樣品墊泳動至硝酸纖維膜的測試區(qū)，實現(xiàn)抗原-抗體的特異結合和標記反應，其粒徑> 300nm時,在免疫層析試紙上的泳動時間較長，顯色時間慢；在偶聯(lián)時較容易發(fā)生聚集，并容易產(chǎn)生非特異反應。若粒徑太小，則磁強度又往往不夠，泳動不了。因此所述超順磁性復合粒子的粒徑為60nm?300nm。優(yōu)選的，所述超順磁性復合粒子的粒徑為80nm?200nm。特別優(yōu)選的，所述超順磁性復合粒子的粒徑為80nm。其所述超順磁性復合粒子粒徑的偏差在10%?30%之間。優(yōu)選的，所述超順磁性復合粒子粒徑的偏差在10%?20%之間。特別優(yōu)選的，所述超順磁性復合粒子粒徑的偏差為 15%。
[0015]超順磁性復合粒子的磁飽和強度及其外磁場響應速度直接決定了檢測靈敏度及其精確性的高低，傳統(tǒng)方法制備的超順磁性復合粒子的磁飽和強度通常都小于30emu/g，對應的外磁場響應速度超過100秒。為提高本發(fā)明免疫層析試紙的靈敏度及其精確性，所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度為30emu/g?80emu/g,對應的外磁場響應速度為20秒?100秒。優(yōu)選的,所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度為35emu/g?70emu/g,對應的外磁場響應速度為20秒?50秒。特別優(yōu)選的，所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度為40emu/g，對應的外磁場響應速度為20秒。
[0016]為用于提高人類艾滋病病毒1+2型抗體的檢測性能，在將所述重組蛋白A和超順磁性復合粒子以肽鍵共價結合形成聚合體前，可將該超順磁性復合粒子進行活化，使超順磁性復合粒子表面帶有易于與重組蛋白A偶聯(lián)的官能團。作為優(yōu)選，所述官能團為羧基或氨基中的一種；所述官能團的含量為50?500ymol/g。優(yōu)選的，官能團為羧基，羧基的含量為50?300 μ mol/g。特別優(yōu)選的，羧基的含量為80 μ mol/g。
[0017]進一步地，在所述檢測線中含有人類艾滋病病毒重組抗原的濃度為0.5?2mg/ml ;在所述質控線中含有抗重組蛋白A抗體的濃度為0.5?2mg/ml。
[0018]進一步地，所述人類艾滋病病毒重組抗原為人類艾滋病病毒1+2型基因工程重組抗原；所述人類艾滋病病毒1+2型基因工程重組抗原為gp36、gp41或gpl20中的一種。
[0019]一種檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙的制備方法，包括以下步驟:將樣品墊、硝酸纖維膜和吸水墊依次連接，將含有人類艾滋病病毒重組抗原和含有能與所述重組蛋白A特異結合的抗重組蛋白A抗體分別噴涂于硝酸纖維膜兩端的不同區(qū)域，對應形成檢測線和質控線，得成品。[0020]樣品墊的制備方法如下:將玻璃纖維紙置于37°C的緩沖液中浸泡I小時，然后取出晾干，備用。再將超順磁性復合粒子標記重組蛋白A采用稀釋液稀釋50倍，然后噴到備用的玻璃纖維紙上，得樣品墊成品。該制備方法中的緩沖液和稀釋液為同一種溶液，由每2mlTritonXlOO中，添加IOg BSA、50g蔗糖和950ml濃度為0.02M、pH為7.4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調PH到7.4，并定容到IOOOml制得。
[0021]在制備免疫層析試紙時，在將樣品墊、硝酸纖維膜和吸水墊依次連接前，可將樣品墊和包被有檢測線和質控線的硝酸纖維膜進行干燥。
[0022]本發(fā)明涉及免疫層析試紙在制備人類艾滋病病毒1+2型抗體檢測試紙中的應用。待檢測的樣品具體可為血清、血漿等。
[0023]本發(fā)明的技術原理為:
[0024]HIV1+2型抗體檢測試劑與超順磁性復合粒子標記的免疫層析檢測技術相關，是采用超順磁性復合粒子作為標記材料，進行快速免疫層析測定的一類方法，該技術整合了磁性納米材料化學合成、標記技術、測流免疫層析技術等相關領域的研究。
[0025]本發(fā)明免疫層析試紙之所以能檢測人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體，在于采用了一種基于超順磁性復合粒子標記的測流免疫層析檢測的方法，即將人類艾滋病病毒(HIV)l+2型重組抗原和抗重組蛋白A抗體分別噴涂于檢測線和質控線處，樣品墊上噴涂超順磁性復合粒子標記的重組蛋白A?；跍y流免疫層析的原理，加入待測樣品后，樣品中的人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體與磁標記的重組蛋白A結合后層析到檢測線處噴涂的人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型重組抗原，在檢測線處形成包被抗原-抗體-磁標記重組蛋白A免疫復合物，多余的磁標重組蛋白A則在質控線處與抗重組蛋白A抗體形成磁標免疫復合物。用磁性試紙判讀儀測定檢測線處超順磁性微球的磁強強度，通過與設定的閾值比對而確定其陽性或陰性結果，質控線測定結果則作為該測定方法的質控內標。
[0026]其具體的技術步驟包括:
[0027](一)超順磁性復合粒子標記重組蛋白A的制備
[0028]采用適合的納米超順磁性復合粒子，活化其表面的羧基后，采用化學偶聯(lián)的方式將重組蛋白A定向連接到該超順磁性復合粒子表面。
[0029](二)測試區(qū)檢測線和質控線處抗原/抗體的包被
[0030]采用專門的噴膜儀器，于測試區(qū)的檢測線處噴涂人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型重組抗原，于質控線處噴涂抗重組蛋白A抗體。
[0031](三)樣品墊處標記探針的包被
[0032]采用噴涂儀器，于樣品墊特定位置處噴涂超順磁性微球標記的重組蛋白A。
[0033](四)免疫層析試紙的組裝成型
[0034]按照免疫層析試紙的結構示意圖(見圖1)要求，于塑料支撐背板中間粘貼作為測試區(qū)的硝酸纖維素(NC)膜，于NC膜的檢測線端粘貼樣品墊，質控線端粘貼吸水墊。在其上面粘貼透明保護膜。采用專門的試紙分切機，將整塊免疫層析試紙分切為一定寬帶的紙條，用裝有干燥劑的專門的鋁箔袋進行包裝。
[0035](五)抗原-抗體磁標免疫復合物的形成
[0036]于上述組裝成型的免疫層析試紙的加樣孔處加入待測樣品，樣品中的人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體與磁標記的重組蛋白A結合后層析到檢測線處噴涂的人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型重組抗原，在檢測線處形成包被抗原-抗體-磁標記重組蛋白A免疫復合物，多余的磁標重組蛋白A則在質控線處與抗重組蛋白A抗體形成的磁標免疫復合物。
[0037](六)磁標免疫復合物磁場強度檢測
[0038]用磁性試紙判讀儀測定檢測線處超順磁性微球的磁場強度，通過與設定的閾值比對而確定其陽性或陰性結果，質控線測定結果則作為該測定方法的質控內標。
[0039]本發(fā)明采用的超順磁性復合粒子是購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為MP-2 (聚馬來酸十六醇酯(PMAH)修飾的水溶性納米晶TEM照片見圖2)，所采用的制備方法是將用化學法制得的油溶性Fe3O4溶解在有機試劑中得到溶液A，將雙親性齊聚物溶于3次蒸懼水中并調節(jié)pH為8?10得溶液B,常溫下將溶液B注入溶液A中，混合液進行充分攪拌并使有機溶劑揮發(fā)，進行離心分離，將離心分離的產(chǎn)物干燥后即可得水溶性的超順磁性復合粒子。用該法制備獲得的磁性復合粒子飽和磁強度高、磁響應快、磁珠尺寸均勻、單分散性好、穩(wěn)定性強、涌動時間快，可很好地滿足LFIAs的檢測要求。
[0040]本發(fā)明中，磁標免疫復合物是指加入檢測樣品后，經(jīng)免疫結合，在檢測線處形成的人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型包被抗原-抗體-磁標重組蛋白A免疫復合物，以及在質控線處形成的抗重組蛋白A抗體-磁標重組蛋白A免疫復合物。
[0041]本發(fā)明中，磁標免疫復合物的磁場強度，是指在檢測線和質控線處分別滯留下的結合磁珠的數(shù)量用美國Quantum Dot的超順磁共振檢測儀MAR測定后所得到的數(shù)值。通過免疫層析反應研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大量測定不同人血清、血漿等的正常樣本，可確定出各不同正常樣本的測定均值，以此作為臨界值(cutoff)來確定檢測線檢測樣本的陽性或陰性結果。質控線測定結果則作為該測定方法的質控內標。
[0042]本發(fā)明的實驗證明，通過對超順磁性復合粒子、人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體和人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型重組抗原分子特性的研究，通過對多種超順磁性復合粒子制備、包覆及表面修飾條件的優(yōu)化，選擇適合的超順磁性復合粒子與特異性的抗體進行定向共價化學偶聯(lián)，獲得功能性的磁性標記探針，并通過優(yōu)化免疫層析反應的各種條件，達到對人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體的客觀檢測，實現(xiàn)了對人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體的快速和高靈敏測定。
[0043]本發(fā)明中，BSA為牛血清白蛋白；EDC為1_乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺；NHS為N-羥基丁二酰亞胺。
[0044]本發(fā)明中，重組蛋白A和能與重組蛋白A特異結合的抗重組蛋白A抗體均為市售的通用試劑。
[0045]本發(fā)明的有益效果在于:靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的其中一個實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0047]圖1為本發(fā)明免疫層析試紙的結構示意圖；
[0048]圖2為超順磁性復合粒子電鏡圖。[0049]圖中:1-樣品墊，2-硝酸纖維膜，3-吸水墊，4-檢測線，5-質控線，6-背板。【具體實施方式】
[0050]為使本領域技術人員詳細了解本發(fā)明的生產(chǎn)工藝和技術效果，下面以具體的生產(chǎn)實例來進一步介紹本發(fā)明的應用和技術效果。
[0051]實施例一:
[0052](一)超順磁性復合粒子標記重組蛋白A的制備
[0053]采用粒徑為lOOnm、粒徑偏差為15%、磁飽和強度為40emu/g，對應的外磁場響應速度為20秒、表面羧基含量為80 μ mol/g的超順磁性Fe3O4納米粒子。
[0054]具體方法是:取2.5mg的上述超順磁性Fe3O4納米粒子用濃度為0.1moUpH為4.7的MES緩沖液洗滌，并用0.4T的磁架分離富集后，用I毫升上述MES緩沖液重懸，然后加入0.96mg的EDC和2.17mg的NHS，混勻，在反應溫度為37°C的條件下反應0.5小時，隨后用濃度為50mmol、pH為8.5的硼砂緩沖液洗滌，得2.5mg活化磁性粒子。
[0055]取1.5mg重組蛋白A和上述所得活化磁性粒子，置于濃度為50mmol、pH為8.5的硼砂緩沖液中充分混勻，在37°C下反應3.5小時，讓蛋白和磁性粒子形成穩(wěn)定的肽鍵共價結合，得含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液。加入占整個該反應液體積1%的終濃度為5%(重量百分比)的BSA溶液，混勻，對剩余活性氨基位點進行封閉，在37°C下反應0.5小時。反應完成后，用濃度為0.02摩爾、pH為7.4的PBS緩沖液洗滌封閉后得到的磁性粒子，懸浮，得超順磁性復合粒子標記重組蛋白A成品，置于4°C保存待用。
[0056]其中，硼砂緩沖液的制備為:稱取1.9g Na2B4O7.IOH2O溶于IOOml純水，調pH至8.5，即得。PBS 緩沖液的制備為:稱取 2.3 克 Na2HP04、0.524 克 NaH2PO4.H20,8.77 克 NaCl溶于IL純水中，調pH至7.4，即得。
[0057](二)免疫層析試紙的制備
[0058]結合圖1所示，取濃度為4mg/ml的250ul抗重組蛋白A抗體加入到750ul濃度為0.02mol、pH為7.4的PB緩沖液中，混勻，即得濃度為lmg/ml抗重組蛋白A抗體。再取濃度為4mg/ml的250ul gp36加入到750ul濃度為0.02mol、pH為7.4的PB緩沖液中，混勻，即得濃度為lmg/ml的gp36。選用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的BioJet噴頭將配制好后的抗重組蛋白A抗體噴至硝酸纖維素膜2上質控線5的位置，將配制好的gp36溶液噴至檢測線4的位置，于相對濕度為10%以下的干燥車間內進行抽濕4小時后干燥待用。
[0059]用含0.2%TritonX100、1%BSA、1% 蔗糖的 0.02mol PBS(pH=7.4)溶液浸泡玻璃纖維紙I小時，浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕條件進行抽濕4小時后，用上述浸泡玻璃纖維的緩沖液按50倍重量稀釋超順磁性復合粒子標記的重組蛋白A后，采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的AirJet噴頭將此稀釋磁標復合物噴涂至上述處理過的玻璃纖維素膜上制備形成樣品墊1，于同樣的抽濕條件進行干燥。在10萬級潔凈和干燥的車間中把上述干燥好的樣品墊1、硝酸纖維素膜2和吸水墊3依次通過背板6粘結起來，在樣品墊I上設置加樣孔后，再在樣品墊1、硝酸纖維素膜2和吸水墊3的表面粘貼保護膜，然后采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切為5mm/條的寬度，裝入檢測用夾片待用，得到檢測人類艾滋病病毒1+2型抗體的免疫層析試紙。
[0060]實施例二:[0061](一)超順磁性復合粒子標記重組蛋白A的制備
[0062]采用粒徑為60nm、粒徑偏差為10%、磁飽和強度為80emu/g，對應的外磁場響應速度為100秒、表面羧基含量為50 μ mol/g的超順磁性Fe3O4納米粒子。
[0063]具體方法是:取2.5mg的上述超順磁性Fe3O4納米粒子用濃度為0.1moUpH為4.7的MES緩沖液洗滌，并用0.4T的磁架分離富集后，用I毫升上述MES緩沖液重懸，然后加入
0.96mg的EDC和2.17mg的NHS，混勻，在反應溫度為35°C的條件下反應40分鐘，隨后用濃度為50mmol、pH為8.5的硼砂緩沖液洗滌，得2.5mg的活化磁性粒子。
[0064]取1.5mg重組蛋白A和上述所得活化磁性粒子，置于濃度為50mmol、pH為8.5的硼砂緩沖液中充分混勻，在40°C下反應3小時，讓蛋白和磁性粒子形成穩(wěn)定的肽鍵共價結合，得含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液。加入占整個該反應液體積1.5%的終濃度為5%(重量百分比)的BSA溶液，混勻，對剩余活性氨基位點進行封閉，在38°C下反應20分鐘。反應完成后，用濃度為0.02摩爾、pH為7.4的PBS緩沖液洗滌封閉后磁性粒子，懸浮，得超順磁性復合粒子標記重組蛋白A成品，置于4°C保存待用。
[0065]其中，硼砂緩沖液的制備為:稱取1.9g Na2B4O7.IOH2O溶于IOOml純水，調pH至8.5，即得。PBS 緩沖液的制備為:稱取 2.3 克 Na2HP04、0.524 克 NaH2PO4.H20,8.77 克 NaCl溶于IL純水中，調pH至7.4，即得。
[0066](二)免疫層析試紙的制備
[0067]結合圖1所示，采用濃度為0.02mol、pH=7.4的PB緩沖液，將抗重組蛋白A抗體配制為濃度1.5mg/ml (配制方式如實施例一);將gp41的濃度配制為濃度1.5mg/ml (配制方式如實施例一)；選用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的BioJet噴頭將配制好后的抗重組蛋白A抗體噴至硝酸纖維素膜2上質控線5的位置，將配制好的gp41噴至檢測線4的位置，于相對濕度為10%以下的干燥車間內進行抽濕4小時后干燥待用。用含0.2%TritonX100、1%BSA、1%蔗糖的0.02mol、pH=7.4的PBS溶液浸泡玻璃纖維紙I小時，浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕條件進行抽濕4小時后，用上述玻璃纖維處理的緩沖液按50倍稀釋超順磁性復合粒子標記的重組蛋白A后，采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的AirJet噴頭將此稀釋磁標復合物噴涂至上述處理過的玻璃纖維素膜上制備形成樣品墊1，于同樣的抽濕條件進行干燥。在10萬級潔凈和干燥的車間中把上述干燥好的樣品墊1、硝酸纖維素膜2和吸水墊3依次通過背板6粘結起來，可在樣品墊1、硝酸纖維素膜2和吸水墊3的表面粘貼保護膜，然后采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切為5mm/條的寬度，裝入檢測用夾片待用，得到檢測人類艾滋病病毒1+2型抗體的免疫層析試紙。
[0068]實施例三:
[0069](一)超順磁性復合粒子標記重組蛋白A的制備
[0070]采用粒徑為300nm、粒徑偏差為20%、磁飽和強度為30emu/g，對應的外磁場響應速度為100秒、表面羧基含量為300 μ mol/g的超順磁性Fe3O4納米粒子。
[0071]具體方法是:取2.5mg的上述超順磁性Fe3O4納米粒子用濃度為0.1moUpH為4.7的MES緩沖液洗滌，并用0.4T的磁架分離富集后，用I毫升上述MES緩沖液重懸，然后加入
0.96mg的EDC和2.17mg的NHS，混勻，在反應溫度為37°C的條件下反應20分鐘，隨后用濃度為50mmol、pH為8.5的硼砂緩沖液洗滌，得2.5mg的活化磁性粒子。
[0072]取1.5mg重組蛋白A和上述所得活化磁性粒子，置于濃度為50mmol、pH為8.5的硼砂緩沖液中充分混勻，在35°C下反應4小時，讓蛋白和磁性粒子形成穩(wěn)定的肽鍵共價結合，得含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液。加入占整個該反應液體積0.5%的終濃度為5%(重量百分比)的BSA溶液，混勻，對剩余活性氨基位點進行封閉，在36°C下反應20分鐘。反應完成后，用濃度為0.02摩爾、pH為7.4的PBS緩沖液洗滌封閉后磁性粒子，懸浮，得超順磁性復合粒子標記重組蛋白A成品，置于4°C保存待用。
[0073]其中，硼砂緩沖液的制備為:稱取1.9g Na2B4O7.IOH2O溶于100ml純水，調pH至
8.5，即得。PBS 緩沖液的制備為:稱取 2.3 克 Na2HP04、0.524 克 NaH2PO4.H20,8.77 克 NaCl溶于IL純水中，調pH至7.4，即得。
[0074](二)免疫層析試紙的制備
[0075]結合圖1所示，采用濃度為0.02M、pH=7.4的PB緩沖液，將抗重組蛋白A抗體配制為濃度2mg/ml (配制方式如實施例一)^#gpl20的濃度配制為濃度2mg/ml (配制方式如實施例一)；選用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的BioJet噴頭將配制好后的抗重組蛋白A抗體噴至硝酸纖維素膜2上質控線5的位置，將配制好的gpl20噴至檢測線4的位置，于相對濕度為10%以下的干燥車間內進行抽濕4小時后干燥待用。用含0.2%TritonX100、1%BSA、1%蔗糖的0.02M PBS (pH=7.4)溶液浸泡玻璃纖維紙I小時，浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕條件進行抽濕4小時后，用上述玻璃纖維處理的緩沖液按50倍稀釋超順磁性復合粒子標記的重組蛋白A后，采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的AirJet噴頭將此稀釋磁標復合物噴涂至上述處理過的玻璃纖維素膜上制備形成樣品墊1，于同樣的抽濕條件進行干燥。在10萬級潔凈和干燥的車間中把上述干燥好的樣品墊1、硝酸纖維素膜2和吸水墊3依次通過背板6粘結起來，可在樣品墊1、硝酸纖維素膜2和吸水墊3的表面粘貼保護膜，然后采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切為5mm/條的寬度，裝入檢測用夾片待用，得到檢測人類艾滋病病毒1`+2型抗體的免疫層析試紙。
[0076]為驗證本發(fā)明免疫層析試紙的效果，特對該免疫層析試紙的性能進行分析。試驗如下:
[0077]1、主要材料:
[0078]1.1人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體免疫層析試紙由實施例一獲得；
[0079]1.2人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體國家參考品(ELISA):由中國藥品生物制品檢定所提供；
[0080]1.3臨床血清:共選擇臨床樣品1064例，其中HIV抗體陽性的HIV-1感染者樣品390份(中檢所保存的樣品包括187份HIV-1抗體和核酸均為陽性，1份核酸陽性但HIV抗體為陰性的HIV-1感染窗口期樣品，其中153份樣品成功完成基因分型，B亞型占33.33%、BC重組型占57.52%、AE重組型占9.15%)，HIV抗體陰性的HIV-1感染窗口期樣品1份，來自中國藥品生物制品檢定所和解放軍艾滋病檢測確認實驗室；HIV陰性樣品673份，其中HBV和HCV感染者樣品各100份來自解放軍302醫(yī)院，473份HIV陰性樣品來自中國藥品生物制品檢定所和解放軍艾滋病檢測確認實驗室。
[0081]2、檢測方法:檢測前先將待檢測樣品恢復室溫。將人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體免疫層析試紙取出并使加樣孔朝外平放在實驗臺面上。使用精確移液器取待檢測樣品50μ I垂直緩慢滴入試紙條的加液口前端小孔，隨即沿加液口后端小孔垂直緩慢滴入100 μ I沖洗液。在室溫孵育20分鐘后用磁性試紙分析儀進行測試判定結果。其沖洗液為含 2mlTween20 的 0.02M、pH 為 7.4PBS 緩沖液。
[0082]3、檢測結果:
[0083]3.1人類艾滋病病毒(HIV) 1+2型抗體國家參考品(ELISA)檢測:對國家參考品血清盤進行檢測，結果與預期一致，通過國家標準規(guī)定(見表1)。
[0084]表1:HIVl+2型抗體國家參考品(ELISA)檢測結果
[0085]
【權利要求】
1.檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，其特征在于:包括依次連接的樣品墊(I)、硝酸纖維膜(2)和吸水墊(3)，所述樣品墊(I)含有超順磁性復合粒子標記重組蛋白A ；所述硝酸纖維膜(2)包被有相互分離的檢測線(4)和質控線(5)，所述檢測線(4)含有人類艾滋病病毒重組抗原，所述質控線(5 )含有能與所述重組蛋白A特異結合的抗重組蛋白A抗體；所述人類艾滋病病毒為人類艾滋病病毒1+2型。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，其特征在于:所述超順磁性復合粒子標記重組蛋白A是將重組蛋白A和超順磁性復合粒子以肽鍵共價結合形成聚合體。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，其特征在于:所述超順磁性復合粒子標記重組蛋白A的制備方法包括以下步驟: a、活化磁性粒子的制備:按重量份數(shù)比，稱取超順磁性復合粒子2~3份、EDC0.5~1.5份和NHSl~3份，混勻，在35°C~40°C下反應20~40分鐘，隨后用緩沖液洗滌，得活化磁性粒子； b、含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液制備:按重量份數(shù)比，稱取所述活化磁性粒子2~3份、重組蛋白A0.1~0.2份和硼砂緩沖液0.5~1份，混勻，在35°C~40°C下反應3~4小時，得含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液； C、取所述含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液，加入占整個所述反應液體積0.5%~1.5%的BSA溶液，混勻，在35°C~40°C下反應20~40分鐘，隨后將反應得到的封閉后磁性粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復合粒子標記重組蛋白A成品。
4.根據(jù)權利要求3所述的檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，其特征在于:所述超順磁性復合粒子為超順磁性Fe3O4納米粒子；所述超順磁性復合粒子的粒徑為60nm~300nm，該粒徑的偏差在10%~30%之間；所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度為30emu/g~80emu/g,對應的外磁場響應速度為20秒~100秒。
5.根據(jù)權利要求2所述的檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，其特征在于:在將所述重組蛋白A和超順磁性復合粒子以肽鍵共價結合形成聚合體前，還包括將該超順磁性復合粒子進行活化，使超順磁性復合粒子表面帶有官能團。
6.根據(jù)權利要求5所述的檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，其特征在于:所述官能團為羧基或氨基中的一種；所述官能團的含量為50~SOOymol/g。
7.根據(jù)權利要求1所述的檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，其特征在于:在所述檢測線(4)中含有人類艾滋病病毒重組抗原的濃度為0.5~2mg/ml ;在所述質控線(5)中含有抗重組蛋白A抗體的濃度為0.5~2mg/ml。
8.根據(jù)權利要求1所述的檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙，其特征在于:所述人類艾滋病病毒重組抗原為人類艾滋病病毒1+2型基因工程重組抗原；所述人類艾滋病病毒1+2型基因工程重組抗原為gp36、gp41或gpl20中的一種。
9.一種基于權利要求1-8中任一項所述的檢測人類艾滋病病毒抗體的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于:包括以下步驟:將樣品墊(I)、硝酸纖維膜(2)和吸水墊(3)依次連接，將含有人類艾滋病病毒重組抗原和含有能與所述重組蛋白A特異結合的抗重組蛋白A抗體分別噴涂于硝酸纖維膜(2)兩端的不同區(qū)域，對應形成檢測線(4)和質控線(5)，得成品O
10.根據(jù)權利要 求1所述免疫層析試紙在制備人類艾滋病病毒1+2型抗體檢測試紙中的應用。
【文檔編號】G01N33/571GK103558381SQ201310547321
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權日:2013年11月6日
【發(fā)明者】馬嵐 申請人:昆明云大生物技術有限公司