富鐵水稻快速篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種富鐵水稻快速篩選方法，待測水稻為以標(biāo)準(zhǔn)品水稻為基礎(chǔ)進(jìn)行突變或改良所得的水稻，將待測水稻籽粒和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒分別進(jìn)行如下步驟1）~步驟4）；1）籽粒糊化；2）在步驟1）的所得物中加入鹽酸進(jìn)行中和；3）在步驟2）的所得物中加入氯化羥胺水溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、乳化劑OP水溶液等振蕩搖勻后靜止；4）在步驟3）的所得物中加入BPT染色液，振蕩搖勻后靜止；取位于上層的清液；?5）將步驟4）所得的待測水稻籽粒的反應(yīng)物和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物進(jìn)行顏色的比較；如果待測水稻籽粒的反應(yīng)物的顏色比標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物顏色深，則說明待測水稻籽粒的含鐵量高于標(biāo)準(zhǔn)品水稻。
【專利說明】富鐵水稻快速篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻籽粒含鐵量的快速篩選方法，主要涉及領(lǐng)域為:農(nóng)學(xué)、育種、水稻。【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界第二大糧食作物，也是我國的主要糧食作物，其營養(yǎng)成分直接關(guān)系到人們的身體健康。鐵元素是人體生長發(fā)育所必需的微量元素，在人體分布很廣，缺鐵會降低嬰兒的心智發(fā)育，降低免疫力，增加母嬰的死亡率，還會增加人體疲勞感，使工作效率低下。WHO (2004)報道缺鐵是世界普遍存在的營養(yǎng)問題。世界上約有40-50億人(占世界人口的6610% )均存在鐵缺乏，其中20億的貧血癥患者是由于鐵缺乏所引起的，發(fā)展中國家的情況尤為嚴(yán)重。因此，研究稻米的礦質(zhì)營養(yǎng)、充分發(fā)掘富含鐵元素的水稻種質(zhì)及培育新品種有利于解決這一營養(yǎng)危機(jī)。稻米中微量元素含量的研究難度之一是如何快速和準(zhǔn)確地測定其微量元素含量水平。因此，微量營養(yǎng)成分的測定方法應(yīng)實現(xiàn)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，并與國際測定方法保持一致，對品種區(qū)域試驗和檢測技術(shù)、審(認(rèn))定標(biāo)準(zhǔn)、指標(biāo)以及品種推廣利用途徑等進(jìn)行深入、系統(tǒng)研究極為必要。目前稻米中礦物質(zhì)含量的測定方法一般都需要高昂的儀器并且需要繁瑣的樣品前處理程序，其中的樣品灰化過程一般需要24-36h的時間，而且常規(guī)的灰化爐一次只能放36-48個樣品，灰化樣品少、灰化時間長，接下來用元素測定儀或ICP-MS等方法測定成本高且耗時長，不能快速、高效地測定出稻米的礦物質(zhì)含量，因而不能及時有效地為育種工作服務(wù)。在育種實踐過程中并不需要極其精確地得到水稻籽粒的鐵含量水平，而只要相對準(zhǔn)確地對富鐵水稻材料加以快速篩選就可以達(dá)到育種要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為富鐵水稻的育種工作提供一種快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的富鐵水稻快速篩選方法。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種富鐵水稻快速篩選方法，待測水稻為以標(biāo)準(zhǔn)品水稻為基礎(chǔ)進(jìn)行突變或改良所得的水稻，將待測水稻籽粒和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒分別進(jìn)行如下步驟I)-步驟4):
[0005]I)、籽粒糊化:
[0006]在4粒水稻籽粒中加入質(zhì)量濃度為4%的NaOH溶液0.8-1.2 mL,在恒溫培養(yǎng)箱中于34.5-35.5°C糊化5.5-6.5h，取出后于振蕩器上震蕩1.5-2.5min，振蕩頻率為30(T350r/min ；
[0007]2)、在步驟I)的所得物中加入0.4-0.6 mL濃度為2M的鹽酸進(jìn)行中和；
[0008]3)、在步驟2)的所得物中加入質(zhì)量濃度為10%的氯化羥胺水溶液0.2-0.3mL、乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5) 0.7-0.8 mL、質(zhì)量濃度為20%的乳化劑OP水溶液0.9-1.1mL ；然后用濃度為5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為4.0-5.0，振蕩搖勻后靜止8-12min ；
[0009]備注說明:乳化劑OP具體可選用乳化劑0P-10 ；
[0010]4)、在步驟3)的所得物中加入0.2-0.3mL的4，7_ 二苯基1，10-鄰菲羅啉(BPT)染色液，振蕩搖勻后靜止8?12min ;取位于上層的清液(備注說明:靜止后會出現(xiàn)分層，未溶解的部分沉淀下來，本發(fā)明對上層的清液進(jìn)行顏色比較)；從而分別獲得待測水稻籽粒的反應(yīng)物和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物；
[0011 ] 所述BPT染色液為BPT的質(zhì)量濃度為0.1%的乙醇溶液；
[0012]5)、將步驟4)所得的待測水稻籽粒的反應(yīng)物和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物進(jìn)行顏色的比較；
[0013]如果待測水稻籽粒的反應(yīng)物的顏色比標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物顏色深，則說明待測水稻籽粒的含鐵量高于標(biāo)準(zhǔn)品水稻，即，待測水稻為富鐵水稻。
[0014]備注說明:濃度M即mol/L的意思。
[0015]作為本發(fā)明的水稻籽粒含鐵量的快速篩選方法的改進(jìn):
[0016]所述步驟I)中=NaOH溶液的用量為lmL，在恒溫培養(yǎng)箱中于35°C糊化6h，取出后于振蕩器上震蕩2min ；
[0017]所述步驟2)中鹽酸的用量為0.5 mL ;
[0018]所述步驟3)中氯化羥胺水溶液的用量為0.25mL,乙酸-乙酸鈉緩沖液的用量為0.75 mL,乳化劑OP水溶液的用量為ImL ；
[0019]所述步驟4)中BPT染色液的用量為0.25mL。
[0020]在本發(fā)明中，
[0021]水稻籽粒選擇大小基本一致的成熟籽粒(經(jīng)常規(guī)的脫殼處理)；
[0022]質(zhì)量濃度為10%的氯化羥胺水溶液，臨用前配制。
[0023]BPT染色液，需4 °C避光保存。
[0024]振蕩頻率一般均指30(T350r/min。
[0025]本發(fā)明的富鐵水稻快速篩選方法，4個步驟總計時間僅約為6.5小時。
[0026]備注說明:
[0027]1、以原始水稻為基礎(chǔ)進(jìn)行突變或改良所得的水稻的籽粒與原始水稻籽粒的大小基本一致，即，重量的差別微乎其微。
[0028]2、待測水稻籽粒的反應(yīng)物與標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物的顏色深度的對比,通過簡單的目測即能獲得；當(dāng)然，為了便于用文字進(jìn)行記錄，也可與“標(biāo)準(zhǔn)色卡”進(jìn)行比對，從而獲得一個相應(yīng)的顏色值。
[0029]本發(fā)明主要用于富鐵水稻的定性篩選，且在試驗過程中發(fā)現(xiàn)未發(fā)生突變的水稻樣品染色后色度相差不大，我們主要挑選染色色度“明顯”深于標(biāo)準(zhǔn)品的樣品(因為突變體篩選的試驗樣品量太大，主要通過視覺感官挑選，通過此方法挑選出的突變體概率不大于0.5%) ο
[0030]本發(fā)明提出的BPT染色法水稻籽粒不用磨粉，只需籽粒就可以定性地篩選出鐵含量較高的水稻品系，一天內(nèi)可以完成大量樣品的篩選過程。與傳統(tǒng)的測定方法相比較，本發(fā)明給育種工作者提供一個更加簡單、快速、較準(zhǔn)確以及低成本的富鐵水稻種質(zhì)資源的篩選方法。
[0031]本發(fā)明例如可用于浙農(nóng)7號水稻品種高鐵突變體(2009M6)、93-11的種皮顏色突變體2009-223 (黑米)的檢測?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0032]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0033]圖1為浙農(nóng)7號高鐵突變體與對照浙農(nóng)7號品種的染色比較圖。
[0034]圖2緩沖液用量對吸光度的影響(ρΗ=4.5)。
[0035]圖3鹽酸羥胺溶液對吸光度的影響圖。
【具體實施方式】
[0036]備注說明:
[0037]以下實施例中用到的浙農(nóng)7號水稻品種高鐵突變體(2009Μ6)在 KeMinWang,Jian Guo ffu, Guan Li, Da Peng Zhang, Zhong Wei Yang, Chun Hai Sh1.Distributionof phytic acid and mineral elements in three indica rice (Oryza sativa L.)cultivars.Journal of Cereal Science , 2011, 54: 116-121 中有明確告知。
[0038]以下實施例中用到的2009-223 (黑米)在 Jiang SL, Wu JG, Thang NB, et alGenotypic variation of mineral elements contents in rice (Oryza sativa L.).EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY, 2008, 228 (I): 115-122 中有明確告知。
[0039]實施例1、富鐵水稻快速篩選方法，以浙農(nóng)7號水稻品種高鐵突變體(2009M6，保存于浙江大學(xué)農(nóng)學(xué)系水稻育種室)為待測水稻，以常規(guī)的浙農(nóng)7號品種作為標(biāo)準(zhǔn)品；將待測水稻和標(biāo)準(zhǔn)品水稻經(jīng)脫殼處理后，分別獲得待測水稻成熟籽粒(簡稱待測水稻籽粒)和標(biāo)準(zhǔn)品水稻成熟籽粒(簡稱標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒)；取大小基本一致的待測水稻籽粒和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒分別進(jìn)行如下操作:
[0040]I )、將4粒水稻籽粒裝入IOmL玻璃試管中，然后加入質(zhì)量濃度為4%的NaOH溶液lmL，在恒溫培養(yǎng)箱中于35°C糊化6h，取出后于振蕩器上震蕩2min，振蕩頻率為30(T350r/min ；
[0041]2)、在步驟I)的所得物中加入0.5mL濃度為2M的鹽酸進(jìn)行中和；
[0042]3)、在步驟2)的所得物中加入質(zhì)量濃度為10%的氯化羥胺水溶液0.25mL、乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)0.75 mL、質(zhì)量濃度為20%的乳化劑0P-10水溶液ImL ;然后用濃度為5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為4.5，振蕩搖勻后靜止IOmin ；
[0043]4)、在步驟3)的所得物中加入0.25mL的4，7_ 二苯基1，10-鄰菲羅啉(BPT)染色液，振蕩搖勻后靜止IOmin ;取位于上層的清液；從而分別獲得待測水稻籽粒的反應(yīng)物和作為標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物；
[0044]備注說明:靜止后會出現(xiàn)分層，未溶解的部分沉淀下來，本發(fā)明對上層的清液進(jìn)行顏色比較；
[0045]BPT染色液為BPT的質(zhì)量濃度為0.1%的乙醇溶液；
[0046]5)、將步驟4)所得的待測水稻籽粒的反應(yīng)物和作為標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物進(jìn)行顏色的比較；
[0047]待測水稻籽粒的反應(yīng)物的顏色明顯比標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物顏色深，如圖1所
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[0048]將篩選出來的高鐵突變體和對照水稻樣品，經(jīng)ICP-MS方法進(jìn)行定量測定，浙農(nóng)7號水稻品種高鐵突變體一-2009M6的含鐵量明顯高于對照浙農(nóng)7號的含鐵量，兩者的含鐵量分別為 25.8±0.2 mg/kg 和 22.7±0.3 mg/kg。
[0049]對比例1-1、將實施例1中的糊化時間由6小時改成10小時，其余同實施例1。
[0050]最終結(jié)果為:
[0051]待測水稻籽粒的反應(yīng)物的顏色與比標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物顏色非常接近，從而無法進(jìn)行有效區(qū)別。
[0052]對比例1-2、將實施例1中的糊化時間由6小時改成2小時，其余同實施例1。
[0053]最終結(jié)果為:
[0054]待測水稻籽粒的反應(yīng)物的顏色與比標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物顏色非常接近，從而無法進(jìn)行有效區(qū)別。
[0055]對比例2-1、將實施例1的步驟3)中的氯化羥胺水溶液的用量由0.25ml改成0.4ml ;其余同實施例1。
[0056]最終結(jié)果為:通過肉眼觀察顏色非常接近，從而無法進(jìn)行有效區(qū)別。
[0057]對比例2-2、將實施例1的步驟3)中的氯化羥胺水溶液的用量由0.25ml改成0.1ml ;其余同實施例1。
[0058]最終結(jié)果為:通過肉眼觀察顏色非常接近，從而無法進(jìn)行有效區(qū)別。
[0059]實施例2、以93 — 11高鐵含量突變體的篩選
[0060]利用BPT染色法在1428份93_11水稻M2中初步篩選出31份高鐵突變體材料，占總材料的2.2%，在其隨后3個世代的進(jìn)一步篩選，突變材料占總材料的比率呈上升趨勢，比率分別為29.3%,46.7%和75.4% ;在1132份經(jīng)過誘變的浙農(nóng)7號材料中初篩出21份高鐵突變體材料，占總材料的1.9%，對其后4個世代進(jìn)一步篩選，突變體占總材料的比率逐漸升高；在1556份雜交材料的F3中篩選出107份高鐵突變體，占總材料的6.9%，相對于上述兩個誘變材料突變率較高，原因可能是雜交育種材料的兩個對照材料嘉育293和舟優(yōu)903籽粒中的鐵含量較低。與上述兩個突變體材料一樣，對育種材料FfF7等世代進(jìn)行篩選，突變體占總材料的比率也逐漸升高。對25個雜交組合育種材料籽粒中鐵含量的定性篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在中佳早 05-1/ 浙農(nóng) 38、EH05-6/Z00-29、EH05-6/ 浙農(nóng) 40、浙輻 05-06/Z00-29、浙輻05-06/ 浙農(nóng) 40、臺早 677/Z00-29、臺早 677/ 浙農(nóng) 40、浙農(nóng) 40/Z00-29、浙農(nóng) 37/JS01-24、EH05-6/碧玉早糯等10個雜交組合材料，可以篩選出比其他組合更多的高鐵水稻材料。
[0061]實施例3、以2009-223 (黑米)品種(為93_11的種皮顏色突變體)為待測水稻，以常規(guī)的93-11作為標(biāo)準(zhǔn)品，如同實施例1進(jìn)行檢測。
[0062]結(jié)果如下:待測水稻籽粒的反應(yīng)物的顏色明顯比標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物顏色深。
[0063]驗證試驗:
[0064]具體實驗過程如下:
[0065](I)實驗儀器與試劑
[0066]鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(阿拉丁試劑公司)；4%的氫氧化鈉溶液；4，7- 二苯基1，10-鄰菲羅啉(BPT)染色液:0.1%的乙醇溶液；乳化劑OP(OP-1O)溶液:20%水溶液；乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5):稱取無水乙酸鈉50g溶于適量水中，加冰乙酸47.5 mL，稀釋至1L，得到pH為4.5緩沖液；氯化羥胺溶液:10%水溶液(臨用前配制)；紫外分光光度計(日本島津)；0.45μπι濾膜；過濾器；10 mL注射器。以上所用玻璃儀器在使用前用IM的HCl溶液中浸泡過夜。[0067](2)樣品前處理
[0068]收獲的水稻材料用礱谷機(jī)(型號JLGJ4.5，浙江臺州糧儀廠)進(jìn)行脫殼處理后得到糙米，糙米進(jìn)一步用精米機(jī)(型號JNMJ3，浙江臺州糧儀廠)進(jìn)行碾磨得到精米，最后用手提式萬能粉碎機(jī)(型號DFT-50，溫嶺市林大機(jī)械有限公司)碾磨樣品，得到糙米粉和精米粉。把米粉樣品放入烘箱在103±2°C條件下放置2h，過60目篩后裝入封閉的塑封袋中，在干燥器中平衡水分。
[0069](3)定量測定
[0070]準(zhǔn)確稱取0.5g米粉，放入25 mL圓底塑料離心管中。用移液槍取10 mL的2 M的鹽酸溶液加入到離心管中，使米粉充分混入到鹽酸溶液中，蓋緊蓋子。然后放入旋轉(zhuǎn)恒溫振蕩器中在50°C下200r/min的條件下震蕩40分鐘，然后將離心管離心，離心速率為4000r/min。
[0071]用一次性注射器取上清液過0.45 μ m濾膜，準(zhǔn)確吸取4 mL濾液加入到干凈的比色管中；然后加入4 mL 2M的氫氧化鈉溶液充分混合；再加入2 mL氯化羥胺溶液，稍置片刻后沿瓶壁緩慢加入I mL乳化劑OP溶液和6 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5)，最后加2mL BPT染色液充分混勻，靜置10分鐘進(jìn)行充分染色，反應(yīng)體系最后定容至20 mL,同時做一空白對照(比色時調(diào)零用)。用可見分光光度計在波長537nm處測定吸光度。
[0072](4)含量計算
[0073]根據(jù)以下公式計算米粉樣品中的鐵含量:
[0074]
【權(quán)利要求】
1.富鐵水稻快速篩選方法，其特征是:待測水稻為以標(biāo)準(zhǔn)品水稻為基礎(chǔ)進(jìn)行突變或改良所得的水稻，將待測水稻籽粒和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒分別進(jìn)行如下步驟I)?步驟4); 1)、籽粒糊化: 在4粒水稻籽粒中加入質(zhì)量濃度為4%的NaOH溶液0.8-1.2 mL,在恒溫培養(yǎng)箱中于34.5?35.5°C糊化5.5?6.5h，取出后于振蕩器上震蕩1.5?2.5min，振蕩頻率為300?350"min ； 2)、在步驟I)的所得物中加入0.4-0.6 mL濃度為2M的鹽酸進(jìn)行中和； 3)、在步驟2)的所得物中加入質(zhì)量濃度為10%的氯化羥胺水溶液0.2-0.3mL、乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.5) 0.7?0.8 mL、質(zhì)量濃度為20%的乳化劑OP水溶液0.9?1.1mL ;然后用濃度為5M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為4.0-5.0，振蕩搖勻后靜止8?12min ； 4)、在步驟3)的所得物中加入0.2-0.3mL的BPT染色液，振蕩搖勻后靜止8?12min ;取位于上層的清液；從而分別獲得待測水稻籽粒的反應(yīng)物和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物； 所述BPT染色液為BPT的質(zhì)量濃度為0.1%的乙醇溶液；BPT為4，7- 二苯基1，10-鄰菲羅啉； 5)、將步驟4)所得的待測水稻籽粒的反應(yīng)物和標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物進(jìn)行顏色的比較； 如果待測水稻籽粒的反應(yīng)物的顏色比標(biāo)準(zhǔn)品水稻籽粒的反應(yīng)物顏色深，則說明待測水稻籽粒的含鐵量高于標(biāo)準(zhǔn)品水稻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻籽粒含鐵量的快速篩選方法，其特征是: 所述步驟I)中=NaOH溶液的用量為lmL，在恒溫培養(yǎng)箱中于35°C糊化6h，取出后于振蕩器上震蕩2min ； 所述步驟2)中鹽酸的用量為0.5 mL ; 所述步驟3)中氯化羥胺水溶液的用量為0.25mL,乙酸-乙酸鈉緩沖液的用量為0.75mL,乳化劑OP水溶液的用量為ImL ； 所述步驟4)中BPT染色液的用量為0.25mL。
【文檔編號】G01N21/78GK103439327SQ201310386023
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】石春海, 王克敏, 吳建國 申請人:浙江大學(xué)