專利名稱：血清中3,5,3’-三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血清中3，5，3’-三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法，屬于臨床血液免疫檢測方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸(T3)是甲狀腺分泌的一種重要的甲狀腺激素。血液循環(huán)中的T3除小部分由甲狀腺組織直接釋放外，大部分由甲狀腺素(T4)脫碘轉(zhuǎn)化而來。T3與T4同受下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調(diào)節(jié)，并協(xié)同維持甲狀腺功能，對機體的生長、發(fā)育、代謝及全身激素的平衡起重要的調(diào)節(jié)作用。血清中總T3量只有T4的1/60，但其生物學(xué)活性比T4大5倍。T3是診斷甲亢最靈敏的指標(biāo)之一，它可以特異性地反映甲狀腺的功能狀態(tài)，對判斷甲狀腺功能紊亂(如甲亢或甲減)有較高的應(yīng)用價值。長期以來，臨床醫(yī)生是根據(jù)酶免疫分析或放射免疫分析檢測結(jié)果來判斷甲亢或甲減患者的病情。但是這兩種方法分別有其缺點，如放射免疫分析操作復(fù)雜，時間長，有放射性污染問題，而酶免疫分析靈敏度低，檢測范圍窄等；由于夾心法成本較高，穩(wěn)定性不好，且目前國內(nèi)外沒有配對的抗體，故不能使用夾心法進行檢測；而化學(xué)發(fā)光方法能夠提高檢測的靈敏度，但是由于傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光底物液是由A液(氧化劑)和B液(發(fā)光劑)二部分組成，A液和B液分開保存，使用時將A液和B液等體積混合，而且要在10分鐘之內(nèi)用完，否則其穩(wěn)定性就會變差，所以也會導(dǎo)致測試信號值急劇下降、檢測范圍明顯變窄，穩(wěn)定性變差，不便于臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種血清中3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法，使得檢測 靈敏度和檢測范圍得到大幅度提高，提高了檢測穩(wěn)定性，為產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用帶來更大的方便性和靈活性。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
一種血清中3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法，包括以下流程:
步驟一、T3標(biāo)準(zhǔn)品制備
取I 2mg的T3原料溶解于Iml 二甲基甲酰胺中，然后以去激素血清，將T3原料稀釋成 0、0.75、1.5、3、6、12nmol/L—系列濃度；
步驟二、酶標(biāo)記物的制備
取HRP (辣根過氧化物酶)3 4mg溶于Iml蒸懼水中，加入過碘酸鈉0.1 0.5mg,混勻后室溫放置30分鐘，然后加入200微升的乙二醇，4°C放置30分鐘；將lmgT3抗體(抗體用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS稀釋至lmg/mL)加入到上述溶液中，混勻后裝入透析袋用PH 9.16的CB (碳酸鹽緩沖液)緩沖液于4°C透析過夜；取出透析袋中的液體，加入200ng的硼氫化鈉，用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS透析，中間換1-2次水；透析完成后，取出液體置于離心管中，并加入同等于標(biāo)記物量的丙三醇和BSA備用；步驟三、酶標(biāo)記物稀釋液的制備
以0.lmol/L pH7.0 8.0的Tris-HCl緩沖液為稀釋液，加入1%甘油、2%甘露醇、0.5%酪蛋白和1%BSA以及的0.2%阻斷劑(ANS)；
步驟四、包被抗原成為預(yù)包被反應(yīng)板
將T3抗原以0.3μ g/ml置于設(shè)定的包被液(NaHCO3)中，加到微孔板(100 150 μ L/孔)，蓋好封板膜，置于37°C溫育6小時；取出恢復(fù)至室溫后，甩掉微孔板內(nèi)液體，拍干微孔板；然后加封閉液(PBS) (15(^17孔)，41:封閉過夜，真空包裝后于41:保存；
五、發(fā)光底物液的制備
發(fā)光底物液:4_輕基聯(lián)苯0.3mmol/L, 4-碘代苯基硼酸0.05 mmol/L,魯米諾10 mmol/L，0.2mol/L硼酸液緩沖液pH8.7，過氧化脲0.lg/L，二甲基甲酰胺(DMF) 5ml/L，聚乙二醇600 (PEG-600) 1.5g/L，硫酸慶大霉素40萬單位/L ；
六、濃縮洗液的制備在0.5M pH7.4 8.0的IOOOml磷酸鹽緩沖液中加15 20ml的吐溫_20、40g氯化鈉、4g氯化鉀、IOg蔗糖和10 15ml PC300，然后攪拌均勻；使用時40倍稀釋；
具體檢測步驟:
A、向預(yù)包被反應(yīng)板的微孔中，加入樣品和濃度分別為0、0.75,1.5、3、6、12nmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μ I ;然后在上述孔內(nèi)再加入50 μ I的檢測Τ3的酶標(biāo)記物，于37°C恒溫溫育30分鐘，之后再用稀釋了 40倍的濃縮洗液洗孔5次，最后甩干；
B、在上述孔中均加入發(fā)光底物液50μ 1，混勻后放置10分鐘；
C、采用化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)軟件測定包被板上述孔中的RLU值，對其分析，得到Τ3檢測結(jié)果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明血清中3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法在酶免疫分析基礎(chǔ)上結(jié)合了化學(xué)發(fā)光技術(shù)使得檢測靈敏度和檢測范圍得到大幅度提高，同時也改變了傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光底物液的局限性，不再把兩種發(fā)光底物液進行混合后使用，而只使用一種發(fā)光底物液，使操作變的更簡單，為產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用帶來更大的方便性和靈活性。
具體實施例方式本發(fā)明血清中3，5，3’ -三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法，采用競爭法測定，包括以下流程:
一、Τ3標(biāo)準(zhǔn)品制備
取I 2mg的T3原料溶解于Iml 二甲基甲酰胺中，然后以去激素血清，將T3原料稀釋成 0、0.75、1.5、3、6、12nmol/L 一系列濃度。二、酶標(biāo)記物的制備
取HRP (辣根過氧化物酶)3 4mg溶于Iml蒸懼水中，加入過碘酸鈉0.1 0.5mg,混勻后室溫放置30分鐘，然后加入200微升的乙二醇，4°C放置30分鐘；將lmgT3抗體(抗體用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS稀釋至lmg/mL)加入到上述溶液中，混勻后裝入透析袋用PH 9.16的CB (碳酸鹽緩沖液)緩沖液于4°C透析過夜；取出透析袋中的液體，加入200ng的硼氫化鈉，用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS透析，中間換1-2次水；透析完成后，取出液體置于離心管中，并加入同等于標(biāo)記物量的丙三醇和BSA備用。三、酶標(biāo)記物稀釋液的制備
以0.lmol/L pH7.0 8.0的Tris-HCl緩沖液為稀釋液，加入1%甘油、2%甘露醇、0.5%酪蛋白和1%BSA以及的0.2%阻斷劑(ANS)。四、包被抗原成為預(yù)包被反應(yīng)板
將T3抗原以0.3μ g/ml置于設(shè)定的包被液(NaHCO3)中，加到微孔板(100 150 μ L/孔)，蓋好封板膜，置于37°C溫育6小時。取出恢復(fù)至室溫后，甩掉微孔板內(nèi)液體，拍干微孔板；然后加封閉液(PB S) (15(^17孔)，41:封閉過夜，真空包裝后于41:保存。五、發(fā)光底物液的制備
發(fā)光底物液:4_輕基聯(lián)苯0.3mmol/L, 4-碘代苯基硼酸0.05 mmol/L,魯米諾10 mmol/L，0.2mol/L硼酸液緩沖液pH8.7，過氧化脲0.lg/L，二甲基甲酰胺(DMF) 5ml/L，聚乙二醇600 (PEG-600) 1.5g/L，硫酸慶大霉素40萬單位/L。六、濃縮洗液的制備
在0.5M pH7.4 8.0的IOOOml磷酸鹽緩沖液中加15 20ml的吐溫_20、40g氯化鈉、4g氯化鉀、IOg蔗糖和10 15ml PC300，然后攪拌均勻；使用時40倍稀釋。具體檢測步驟:
1、向預(yù)包被反應(yīng)板的微孔中，加入樣品和濃度分別為0、0.75,1.5、3、6、12nmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μ I ;然后在上述孔內(nèi)再加入50 μ I的檢測Τ3的酶標(biāo)記物，于37°C恒溫溫育30分鐘，之后再用稀釋了 40倍的濃縮洗液洗孔5次，最后甩干；
2、在上述孔中均加入發(fā)光底物液50μ 1，混勻后放置10分鐘；
3、采用化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)軟件測定包被板上述孔中的RLU值，對其分析，得到Τ3檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種血清中3，5，3’-三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法，其特征在于所述測定方法包括以下流程: 步驟一、T3標(biāo)準(zhǔn)品制備 取I 2mg的T3原料溶解于Iml 二甲基甲酰胺中，然后以去激素血清，將T3原料稀釋成 0、0.75、1.5、3、6、12nmol/L—系列濃度； 步驟二、酶標(biāo)記物的制備 取HRP (辣根過氧化物酶)3 4mg溶于Iml蒸懼水中，加入過碘酸鈉0.1 0.5mg,混勻后室溫放置30分鐘，然后加入200微升的乙二醇，4°C放置30分鐘；將lmgT3抗體(抗體用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS稀釋至lmg/mL)加入到上述溶液中，混勻后裝入透析袋用PH 9.16 的CB (碳酸鹽緩沖液)緩沖液于4°C透析過夜；取出透析袋中的液體，加入200ng的硼氫化鈉，用pH 7.0 8.0的0.01 0.02mol/L PBS透析，中間換1-2次水；透析完成后，取出液體置于離心管中，并加入同等于標(biāo)記物量的丙三醇和BSA備用； 步驟三、酶標(biāo)記物稀釋液的制備 以0.lmol/L pH7.0 8.0的Tris-HCl緩沖液為稀釋液，加入1%甘油、2%甘露醇、0.5%酪蛋白和1%BSA以及的0.2%阻斷劑(ANS)； 步驟四、包被抗原成為預(yù)包被反應(yīng)板 將T3抗原以0.3μ g/ml置于設(shè)定的包被液(NaHCO3)中，加到微孔板(100 150 μ L/孔)，蓋好封板膜，置于37°C溫育6小時；取出恢復(fù)至室溫后，甩掉微孔板內(nèi)液體，拍干微孔板；然后加封閉液(PBS) (15(^17孔)，41:封閉過夜，真空包裝后于41:保存； 步驟五、發(fā)光底物液的制備 發(fā)光底物液:4_輕基聯(lián)苯0.3mmol/L, 4-碘代苯基硼酸0.05 mmol/L,魯米諾10 mmol/L，0.2mol/L硼酸液緩沖液pH8.7，過氧化脲0.lg/L，二甲基甲酰胺(DMF) 5ml/L，聚乙二醇.600(PEG-600) 1.5g/L，硫酸慶大霉素40萬單位/L ； 步驟六、濃縮洗液的制備 在0.5M pH7.4 8.0的IOOOml磷酸鹽緩沖液中加15 20ml的吐溫_20、40g氯化鈉、4g氯化鉀、IOg蔗糖和10 15ml PC300，然后攪拌均勻；使用時40倍稀釋； 具體檢測步驟: A、向預(yù)包被反應(yīng)板的微孔中，加入樣品和濃度分別為0、0.75,1.5、3、6、12nmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品各50 μ I ;然后在上述孔內(nèi)再加入50 μ I的檢測Τ3的酶標(biāo)記物，于37°C恒溫溫育30分鐘，之后再用稀釋了 40倍的濃縮洗液洗孔5次，最后甩干； B、在上述孔中均加入發(fā)光底物液50μ 1，混勻后放置10分鐘； C、采用化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)軟件測定包被板上述孔中的RLU值，對其分析，得到Τ3檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血清中3,5,3’-三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法，包括T3標(biāo)準(zhǔn)品制備、酶標(biāo)記物的制備和稀釋、包被抗原成為預(yù)包被反應(yīng)板、發(fā)光底物液的制備和濃縮洗液的制備等步驟。本發(fā)明血清中3,5,3’-三碘甲腺原氨酸的化學(xué)發(fā)光免疫測定方法在酶免疫分析基礎(chǔ)上結(jié)合了化學(xué)發(fā)光技術(shù)使得檢測靈敏度和檢測范圍得到大幅度提高，同時也改變了傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光底物液的局限性，不再把兩種發(fā)光底物液進行混合后使用，而只使用一種發(fā)光底物液，使操作變的更簡單，為產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用帶來更大的方便性和靈活性。
文檔編號G01N33/78GK103217414SQ20131015129
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者奚偉紅, 王布強, 王京, 高淑舫 申請人:江蘇創(chuàng)生生物技術(shù)有限公司