專利名稱：黃瓜粗線期染色體的制片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了黃瓜粗線期染色體的制片方法，專用于制備黃瓜的粗線期染色體，有利于開展黃瓜的細(xì)胞學(xué)研究，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumis sativus L., 2n = 14)是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓生草本植物,起源于喜馬拉雅山南麓的熱帶雨林地區(qū)，在我國已有2000多年的栽培歷史。黃瓜食用方便，富含維生素C以及多種有益礦物質(zhì)，是我國的主栽蔬菜作物之一，對提高人民生活水平、滿足蔬菜周年供應(yīng)發(fā)揮了巨大作用。我國是世界上最大的黃瓜生產(chǎn)和消費(fèi)國，據(jù)統(tǒng)計，我國黃瓜(包括腌潰用小黃瓜)的栽培面積和產(chǎn)量呈逐年增加的趨勢。利用黃瓜的粗線期染色體進(jìn)行制片，是近年來細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域的一大重要進(jìn)展。然而，由于黃瓜的染色體小、細(xì)胞質(zhì)濃厚、染色能力弱、異染色質(zhì)少等因素的影響，很難獲得形態(tài)清晰的粗線期染色體分裂相。另外，現(xiàn)有技術(shù)壓片法以及凍片法制作黃瓜粗線期染色體，雖然能得到分散度高的染色體，但染色體的結(jié)構(gòu)不明顯，無法觀察到染色體上的異染色質(zhì)區(qū)和著絲粒等的位置，并且在壓片過程中易導(dǎo)致染色體的斷裂。目前，僅有少數(shù)的報道中是利用黃瓜粗線期染色體為靶DNA進(jìn)行熒光原位雜交。針對以往的利用黃瓜的粗線期染色體進(jìn)行制片時，其染色體纏繞嚴(yán)重，并且花藥的利用率低等不足，我們通過改進(jìn)制片過程，提出本技術(shù)，能獲得染色體分散良好、結(jié)構(gòu)清晰的粗線期制片，并且利用一個花藥能制備3-4張粗線期染色體形態(tài)良好的片子，提高了黃瓜花藥的利用效率。因?yàn)榇志€期在染色體減數(shù)分裂過程中占的時期極短，找到處于合適時期的花藥較費(fèi)時間，本技術(shù)在花藥利用率上的提高，改善了這方面的不足。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明黃瓜粗線期染色體的制片方法的目的，是針對以往黃瓜粗線期染色體制片時染色體纏嚴(yán)重，染色體形態(tài)不清晰等，黃瓜花藥利用率低等缺陷，發(fā)明能制備分散度高的黃瓜粗線期染色體，并且提高了黃瓜花藥的利用率，為制作高精密的黃瓜染色體的物理圖譜奠定了基礎(chǔ)，加快了黃瓜的細(xì)胞學(xué)研究進(jìn)展。技術(shù)方案本發(fā)明所提供的黃瓜粗線期染色體的制片，其特征在于:得到了分散度良好的粗線期染色體，提高了了黃瓜花藥的利用率。上述黃瓜粗線期染色體，是通過以下方法獲得的:在黃瓜植株盛花前期和盛花期取適當(dāng)大小的花蕾，放入體積比為3: I的E: G(乙醇:冰醋酸)固定液中固定備用。取出固定好的花蕾，剝出花藥，取其四分之一的花藥，用醋酸直接壓片法制片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察是否處于粗線期。
若其處于粗線期，則將同一花蕾其余所有花藥放入1.5ml的離心管中，加入(纖維素酶:果膠酶=4%: 2%)的混合酶液，37°C下酶解1.5小時。然后用冰冷的蒸餾水置換酶液，并在冰水中低滲后轉(zhuǎn)入固定液中固定24h以上。取出其中一個花藥，加入約IOOul的E: G固定液，吸打成花藥懸浮液，吸出約30ul的含粗線期染色體的液體，涂于載玻片上，再加上IOOul的E: G固定液，在酒精燈上燒片。由于采用了上述方案，一個黃瓜花藥能制作3-4張片子，大大提高了花藥的利用率，并且粗線期染色體分散度高，形態(tài)好。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果:I)黃瓜粗線期染色體(圖1)進(jìn)行制片，在靶信號的分辨率方面比黃瓜中期染色體(圖2和3)進(jìn)行制片要高得多。2)現(xiàn)有的技術(shù)壓片后凍片得到的黃瓜粗線期染色體互相纏繞，堆積在一起，并且無法分辨出染色體上的異染色質(zhì)區(qū)和著絲粒位點(diǎn)(圖4和5)。通過將花藥酶解后涂片再燒片干燥的方法，使粗線期染色體在載玻片上分散開來，便于分辨黃瓜的各條粗線期染色體。3)在材料準(zhǔn)備方面，可以直接在黃瓜植株上取花蕾，放入E: G固定液中固定備用即可，省去了在獲取中期染色體時取黃瓜根尖，并進(jìn)行預(yù)處理后再固定的一系列過程，節(jié)約了黃瓜種子，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。4)將酶解后的黃瓜單個花藥取出，放入另一離心管中搗碎后再吸出一部分含有黃瓜粗線期染色體的懸浮液進(jìn)行制片，與現(xiàn)有的壓片法相比，一方面，使染色體在載玻片上分布均勻，避免了一張載玻片上雜質(zhì)或間期核過多；另一方面，大大的提高了花藥的利用率，也減少了利用花蕾撥出花藥的時間，從而在一定程度上加快了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度。
四

圖1:利用本發(fā)明制作得到的黃瓜粗線期染色體，染色體的分散度高，能清晰的分辨出每條染色體，也能直接觀察到染色體上染色較深的異染色質(zhì)區(qū)。圖2:多個黃瓜四號染色體上的靶信號在中期染色體上的分布，由于染色體粗短，無法分辨出多個信號的具體位置和排列順序。圖3:多個黃瓜四號染色體上的靶信號在粗線期染色體上的分布，能清晰的分辨出目標(biāo)信號在染色體上的分布，也可以觀察出探針在染色體上的排列順序。圖4:現(xiàn)有技術(shù)壓片后凍片制得的黃瓜粗線期染色體，染色體易斷裂，且無法分辨染色體上的異染色質(zhì)區(qū)及著絲粒位點(diǎn)。圖5:現(xiàn)有技術(shù)壓片后凍片制得的黃瓜粗線期染色體，染色體纏繞堆積在一起。
五具體實(shí)施例方式本發(fā)明黃瓜粗線期染色體制片的實(shí)施程序包括:(I)材料準(zhǔn)備:在黃瓜植株盛花前期和盛花期取適當(dāng)大小的花蕾，放入體積比為
3: I的E: G(乙醇:冰醋酸)固定液中固定至少24小時，超過一周的話可將花蕾換到70%的乙醇中，備用。
(2)挑選處于粗線期時期的花藥:取出一個固定好的花蕾，在顯微鏡下分離出花藥，取其四分之一的花藥放在干凈的載玻片上，加幾滴45%的醋酸進(jìn)行軟化，用鑷子輕輕敲碎花藥，蓋上蓋玻片，輕輕的壓片，然后在普通光學(xué)相差顯微鏡下進(jìn)行觀察，若觀察到其染色體處于粗線期，則將剩下的花藥放入1.5ml的離心管中，加入少量E: G固定液，4°C保存?zhèn)溆谩?3)花藥酶解:固定好的粗線期的花藥，用蒸餾水洗2篇，然后加入混合酶液(纖維素酶:果膠酶=4%: 2% )，37°C下酶解1.5小時。小心地吸出酶液，加入約Iml的蒸餾水水，冰上放置5-10min，吸出蒸餾水，加入約Iml的E: G固定液，冰上放置lOmin。(4)制片:取出酶解好的其中的一個花藥，放入另一新的1.5ml離心管中，加入約IOOul的E: G固定液，將花藥搗碎，吸出約30ul的含粗線期染色體的液體，涂于載玻片上，再加上IOOul的E: G固定液，在酒精燈上燒片干燥制片。
權(quán)利要求
1.利用黃瓜粗線期染色體進(jìn)行制片，其特征在于: 得到了分散度很高、且染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特征明顯的粗線期染色體，提高了黃瓜花藥的利用率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的得到的分散度高和形態(tài)結(jié)構(gòu)特征明顯的黃瓜粗線期染色體，是通過以下方法獲得的: 1)在黃瓜植株處于盛花期或盛花前期時，采摘花蕾，用E: G(乙醇:冰醋酸體積比=3: I)固定液固定24小時以上； 2)從固定好的花蕾中分離出花藥，45%醋酸壓片，臨時片在OlympusBX41相差顯微鏡下觀察，選擇處于粗線期的花蕾，將剩余的花藥取出用于下一步酶解； 3)用含有4%的纖維素酶和2%的果膠酶的混合酶液酶解處于粗線期狀態(tài)的黃瓜花藥，將酶解好的花藥在冰水中后低滲30分鐘，然后在E: G固定液中固定24h以上； 4)取酶解好的花藥，加入適量固定液制成懸濁液涂片，再利用火焰干燥法制片，鏡檢，挑選染色體分散度高的載玻片備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高了黃瓜花藥的利用率，是由于將黃瓜酶解好的一個花藥在適量E: G(乙醇:冰醋酸)固定液中搗碎后吸取一定量的懸浮液進(jìn)行涂片，通過這種方法，一個花藥可以制作3-4張染色體載玻片，與以往的一個花藥制作一張染色體載玻片相t匕，大大提高了黃瓜花藥的利用率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃瓜減數(shù)分裂粗線期染色體制片的方法，它是取黃瓜盛花期植株上的花蕾，放入體積比為3∶1的E∶G(乙醇∶冰醋酸)固定液中固定，剝開花蕾，取處于減數(shù)分裂粗線期的花藥用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行酶解，取酶解好的一個花藥在適量E∶G固定液中搗碎，吸取懸浮液涂片，然后用火焰干燥法制片。本發(fā)明采用涂片后再火焰干燥的方法，不僅可以制得分散度高，形態(tài)好的粗線期染色體，而且提高了黃瓜花藥的利用率；更重要的是，其所得的粗線期染色體制片可直接用于熒光原位雜交，為黃瓜的細(xì)胞學(xué)研究提供了可靠的保證。
文檔編號G01N1/28GK103115811SQ20131008100
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者婁群峰, 何玉華, 陳勁楓, 賈利, 李季 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)