專利名稱：生物熒光顯微檢測儀器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及顯微檢測儀器設計及制造領域，尤其是涉及ー種生物熒光顯微檢測儀器。
背景技術：
全內(nèi)反射顯微成像技術和共聚焦顯微成像技術各有優(yōu)缺點全內(nèi)反射顯微成像具有很高的軸向分辨率，但其橫向分辨率較低；共聚焦顯微成像具有很高的橫向分辨率，但其軸向分辨率較差。如何在一臺顯微鏡中同時利用全內(nèi)反射顯微成像高的軸向分辨率和共聚焦顯微成像高的橫向分辨率尤為重要。發(fā)明專利申請CN201080024155.9中提出了將全內(nèi)反射熒光圖像和共焦圖像簡單且正確地重合的圖像處理裝置、程序和顯微鏡，該發(fā)明中包含了兩套顯微鏡，一套是全內(nèi)反射顯微鏡，另ー套是共聚焦顯微鏡，但兩套顯微鏡是分開工作的，通過光路切換的方法先獲得一套顯微鏡的圖像，再獲得另一套顯微鏡的圖像，最后計算機再利用兩套圖像中的基準點將兩套圖像進行了重合。該方法雖然生成了全內(nèi)反射熒光圖像和共焦圖像的重合圖像，由于兩種顯微鏡是先后工作的，在物理上并不能同時得到三維高分辨率圖像；另外該發(fā)明要先后操作兩個顯微鏡拍攝圖像，并要對圖像進行重合，顯微鏡結構比較復雜，控制系統(tǒng)的構成也比較復雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種集成全內(nèi)反射顯微成像技術和共聚焦顯微成像技術的生物熒光顯微檢測儀器，該生物熒光顯微檢測儀器在橫向及軸向上具有很高的分辨率。本發(fā)明的技術方案是生物熒光顯微檢測儀器包括激發(fā)光照明単元、激發(fā)光和熒光隔離單元、反射單元、顯微成像單元、突光探測單元及控制單元；所述激發(fā)光照明単元包括激光光源、第一擴束鏡、第二擴束鏡；所述第一擴束鏡及第二擴束鏡之間設有照明針孔，且所述照明針孔位于所述第一擴束鏡的焦點處；所述激發(fā)光和熒光隔離單元包括激發(fā)光濾色片、二色鏡、熒光濾色片；所述反射單元為平面反射鏡；所述顯微成像単元包括中繼透鏡、筒鏡、環(huán)形光束整形組件、顯微物鏡，所述環(huán)形光束整形組件包括設于所述筒鏡及顯微物鏡之間的環(huán)形濾光片，所述環(huán)形濾光片具有將激光截止的內(nèi)環(huán)區(qū)域和透射激光的環(huán)帶區(qū)域，該內(nèi)環(huán)區(qū)域和環(huán)帶區(qū)域均可透射熒光；所述內(nèi)環(huán)區(qū)域的半徑不小于剛好能發(fā)生全內(nèi)反射時所述顯微物鏡入瞳位置的臨界半徑；所述熒光探測單元包括成像鏡頭、光電倍增管，該成像鏡頭與所述光電倍増管之間設有成像探測針孔，所述成像探測針孔位于所述成像鏡頭的焦點處；待觀察對象與所述照明針孔和成像探測針孔處于共軛位置上；所述光電倍増管可探測熒光，并將所述熒光轉換成電信號；所述第一擴束鏡、照明針孔、第二擴束鏡、激發(fā)光濾色片、二色鏡、反射単元、中繼透鏡、筒鏡、環(huán)形濾光片及顯微物鏡依次沿始于所述激光光源的光軸線設置，且所述顯微物鏡、環(huán)形濾光片、筒鏡、中繼透鏡、反射単元、二色鏡、熒光濾色片、成像鏡頭、成像探測針孔及光電倍增管依次沿始于由待觀察對象激發(fā)的熒光光軸線設置；所述控制単元，與所述光電倍増管電性連接，用于采集所述電信號并生成待觀察物質(zhì)中ー個點圖像。下面對上述技術方案進ー步解釋所述環(huán)帶區(qū)域的寬度可調(diào)節(jié)。所述顯微物鏡為無窮遠消像差型大數(shù)值孔徑的浸油物鏡。所述控制單元還與所述激光光源電性連接，用于控制激光的波長和功率。本發(fā)明的優(yōu)點是I.本發(fā)明提供的生物熒光顯微檢測儀器在第一擴束鏡及第ニ擴束鏡之間且位于 第一擴束鏡的焦點處設有照明針孔，在成像鏡頭和光電倍增管之間且位于成像鏡頭的焦點處設有成像探測針孔，有效提高了該儀器的橫向分辨率；同時，在筒鏡及顯微物鏡之間設置環(huán)形濾光片，提高了該生物熒光顯微檢測儀器在軸向的分辨率。2.本發(fā)明提供的生物熒光顯微檢測儀器由于入射激光光束經(jīng)顯微成像單元聚焦在區(qū)域面積約為艾利斑大小的點狀區(qū)域內(nèi)，即只有一個面積很小厚度很薄區(qū)域內(nèi)的熒光物質(zhì)能夠被激發(fā)，而其它區(qū)域內(nèi)的熒光物質(zhì)不會被激發(fā)，即從源頭上消除了雜散光的來源，因而具有很高的成像信噪比。


圖I為本發(fā)明實施例提供的生物熒光顯微檢測儀器結構示意圖。圖2為本發(fā)明實施例提供的環(huán)形濾光片的結構示意圖。圖3為本發(fā)明實施例提供的環(huán)形光束通過顯微物鏡的光路傳播示意圖。其中激發(fā)光照明単元110、激光光源111、第一擴束鏡112、第二擴束鏡113、照明針孔114、激發(fā)光和熒光隔離單元120、激發(fā)光濾色片121、二色鏡122、熒光濾色片123、反射単元130、顯微成像単元140、中繼透鏡141、筒鏡142、環(huán)形光束整形組件143、顯微物鏡144、環(huán)形濾光片1432、熒光探測單元150、成像鏡頭151、光電倍增管152、成像探測針孔153、控制單元160。
具體實施例方式請參考圖I至圖3。圖I中標有單向箭頭的光路為激光傳播光路；標有雙向箭頭的光路表不為突光傳播光路。實施例生物熒光顯微檢測儀器100包括激發(fā)光照明単元110、激發(fā)光和熒光隔離單元120、反射單元130、顯微成像單元140、突光探測單元150及控制單元160。激發(fā)光照明單元110包括激光光源111、第一擴束鏡112、第二擴束鏡113。在第一擴束鏡112和第二擴束鏡113之間且位于第一擴束鏡112的焦點處設有照明針孔114。激發(fā)光和熒光隔離單元120包括激發(fā)光濾色片121、二色鏡122、熒光濾色片123。激發(fā)光濾色121片用于接收激光，濾除激光中偏離中心波長的光束，并透射激光中中心波長處的光束。二色鏡122接收并反射經(jīng)激發(fā)光濾色片121透射的激光，并透射熒光。熒光濾色片123接收并透射經(jīng)二色鏡122透射的熒光，并截止激光。反射単元130為平面反射鏡，用于反射激光和熒光。
顯微成像單元140包括中繼透鏡141、筒鏡142、環(huán)形光束整形組件143、顯微物鏡144。環(huán)形光束整形組件143包括環(huán)形濾光片1432。該環(huán)形濾光片1432設置于筒鏡142及顯微物鏡144之間，具有將激光截止的內(nèi)環(huán)區(qū)域A和透射激光的環(huán)帶區(qū)域B。內(nèi)環(huán)區(qū)域A和環(huán)帶區(qū)域B均可透射熒光。熒光探測單元150包括成像鏡頭151、光電倍增管152。在成像鏡頭151與光電倍增管152之間且位于成像鏡頭151的焦點處設有成像探測針孔153。待觀察對象與照明針孔114和成像探測針孔153處于共軛位置上。光電倍增管152可探測熒光，并將熒光轉換成電信號。其中，第一擴束鏡112、照明針孔114、第二擴束鏡113、激發(fā)光濾色片121、二色鏡
122、反射單元130、中繼透鏡141、筒鏡142、環(huán)形濾光片1432、顯微物鏡144依次沿始于激光光源111的光軸線設置；顯微物鏡144、環(huán)形濾光片1432、筒鏡142、中繼透鏡141、反射單元130、二色鏡122、熒光濾色片123、成像鏡頭151、成像探測針孔153、光電倍增管152依次沿始于由待觀察對象激發(fā)的熒光光軸線設置。 激光光源111發(fā)射的準直激光依次經(jīng)第一擴束鏡112、照明針孔114、第二擴束鏡113擴束后形成平行的激光束；該平行激光束依次經(jīng)激發(fā)光濾色片121、二色鏡122、反射單元130、中繼透鏡141、筒鏡142后經(jīng)環(huán)形光束整形組件143整形為環(huán)形光束，該環(huán)形光束經(jīng)顯微物鏡144聚集于待觀察對象處，并激發(fā)待觀察對象產(chǎn)生熒光；該熒光光束依次經(jīng)顯微物鏡144、環(huán)形濾光片1432、筒鏡142、中繼透鏡141、反射單元130、二色鏡122、熒光濾色片
123、成像鏡頭151后聚焦于成像探測針孔153處，光電倍增管152探測該熒光束并將其轉換成電信號?？刂茊卧?60將光電倍増管152輸出的微弱電信號進行放大，并對放大后的電信號進行實時采樣。由于任意時刻，光電倍增管152只能收集ー個點位置熒光物質(zhì)的光信息，并將光信號轉換成電信號，控制單元160將采集到的電信號生成ー個定點位置的待觀察對象圖像?？刂茊卧?60還電性連接于激光光源111，用于控制入射激光波長選取和功率設置。在該生物熒光顯微檢測儀器100中，顯微物鏡144為無窮遠消像差型大數(shù)值孔徑的浸油物鏡，由于環(huán)形光束的內(nèi)環(huán)半徑(圖2中A區(qū)域的半徑)不小于顯微物鏡144剛好能發(fā)生全內(nèi)反射時入瞳位置處光束的臨界半徑，且蓋玻片200和油300的折射率大致相同，這樣進入顯微物鏡144的環(huán)形光束在蓋玻片200和待觀察對象所在的組織溶液400的交界處發(fā)生全反射，不能透過蓋玻片200進行傳播，但會在蓋玻片200和組織溶液400的交界處形成隱失場(圖3中C區(qū))，隱失波能夠激發(fā)界面附近的熒光分子，產(chǎn)生熒光。調(diào)整環(huán)形濾光片1432環(huán)帶區(qū)域B的寬度可以改變穿出蓋玻片200的隱失場的分布深度，從而可以改變熒光物質(zhì)在Z軸方向的激發(fā)深度，可以實現(xiàn)Z軸方向不同分辨率的調(diào)節(jié)。隱失波的頻率與入射光頻率相同，其強度(単位面積和單位時間的能量)隨離開界面的垂直距離呈指數(shù)衰減I (z) = I (O) e_z/d可以看出，透射電磁場的振幅隨進入樣品的深度z減小得非?？欤@種電磁場只存在于界面附近ー薄層內(nèi)。d是理論滲透深度，等于從界面處到隱失波強度衰減到界面處數(shù)值Ι/e的距離，d可表示為
d = ( λ 0/4 3i) Cn12Sin2 θ -η22)d與入射角(θ )、波長λ ^以及組織溶液400折射率(η2)和蓋玻片200的折射率(Ii1)有夫。d隨入射角増大而減小，大小與入射光波長為同一數(shù)量級或更小。由于隱失場的獨特特性，使熒光激發(fā)的區(qū)域非?？拷纸缑?約IOOnm)。這樣不會激發(fā)距分界面更遠區(qū)域的熒光，從而可實現(xiàn)背景噪聲極小的熒光成像，使得生物熒光顯微檢測儀器100在軸向具有很高的分辨率。在該生物熒光顯微檢測儀器100中，通過照明針孔114及成像探測針孔153的聯(lián)合使用，實現(xiàn)點對點的照明和點對點的成像。當不考慮噪聲的情況下，光學上常用點擴散函數(shù)描述系統(tǒng)成像分辨率，對于激光掃描共焦系統(tǒng)來說，系統(tǒng)最終的點擴散函數(shù)由下式描述PSFtot (x, y, z) = PSFill (x, y, z) · PSFdet (x, y, z)
其中PSFill對應照明激光點在物方的點擴散函數(shù)，PSFdet對應成像探測光路的點擴散函數(shù)。由于照明針孔114的作用，入射激光光束通過各單元后在蓋玻片200與待觀察對象交界處形成一個很小的點狀照明區(qū)域(照明方點擴散函數(shù))，成像探測針孔153的使用對成像探測方點擴散函數(shù)進ー步整形，使得整個生物熒光顯微檢測儀器100的成像點擴散函數(shù)由照明方點擴散函數(shù)和探測方點擴散函數(shù)的乘積組成，由于乘積后的成像點擴散函數(shù)強度分布范圍變窄，因而系統(tǒng)具有很高的橫向分辨率。在該生物熒光顯微檢測儀器100中由于入射激光光束經(jīng)顯微成像単元140聚焦在區(qū)域面積約為艾利斑大小的點狀區(qū)域內(nèi)，即只有一個面積很小厚度很薄區(qū)域內(nèi)的熒光物質(zhì)能夠被激發(fā)，而其它區(qū)域內(nèi)的熒光物質(zhì)不會被激發(fā)，即從源頭上消除了雜散光的來源，因而系統(tǒng)具有很高的成像信噪比。當然本發(fā)明的生物熒光顯微檢測儀器還可具有多種變換及改型，并不局限于上述實施方式的具體結構。總之，本發(fā)明的保護范圍應包括那些對于本領域普通技術人員來說顯而易見的變換或替代以及改型。
權利要求
1.一種生物熒光顯微檢測儀器，其特征在于，包括激發(fā)光照明單元、激發(fā)光和熒光隔離單元、反射單元、顯微成像單元、突光探測單元及控制單元； 所述激發(fā)光照明單元包括激光光源、第一擴束鏡、第二擴束鏡；所述第一擴束鏡及第二擴束鏡之間設有照明針孔，且所述照明針孔位于所述第一擴束鏡的焦點處；所述激發(fā)光和熒光隔離單元包括激發(fā)光濾色片、二色鏡、熒光濾色片；所述反射單元為平面反射鏡；所述顯微成像單元包括中繼透鏡、筒鏡、環(huán)形光束整形組件、顯微物鏡，所述環(huán)形光束整形組件包括設于所述筒鏡及顯微物鏡之間的環(huán)形濾光片，所述環(huán)形濾光片具有將激光截止的內(nèi)環(huán)區(qū)域和透射激光的環(huán)帶區(qū)域，該內(nèi)環(huán)區(qū)域和環(huán)帶區(qū)域均可透射熒光；所述內(nèi)環(huán)區(qū)域的半徑不小于剛好能發(fā)生全內(nèi)反射時所述顯微物鏡入瞳位置的臨界半徑；所述熒光探測單元包括成像鏡頭、光電倍增管，該成像鏡頭與所述光電倍增管之間設有成像探測針孔，所述成像探測針孔位于所述成像鏡頭的焦點處；待觀察對象與所述照明針孔和成像探測針孔處于共軛位置上；所述光電倍增管可探測熒光，并將所述熒光轉換成電信號； 所述第一擴束鏡、照明針孔、第二擴束鏡、激發(fā)光濾色片、二色鏡、反射單元、中繼透鏡、筒鏡、環(huán)形濾光片及顯微物鏡依次沿始于所述激光光源的光軸線設置，且所述顯微物鏡、環(huán)形濾光片、筒鏡、中繼透鏡、反射單元、二色鏡、熒光濾色片、成像鏡頭、成像探測針孔及光電倍增管依次沿始于由待觀察對象激發(fā)的熒光光軸線設置； 所述控制單元與所述光電倍增管電性連接，用于采集所述電信號并生成待觀察物質(zhì)中一個點圖像。
2.根據(jù)權利要求I所述的生物熒光顯微檢測儀器，其特征在于，所述環(huán)帶區(qū)域的寬度可調(diào)節(jié)。
3.根據(jù)權利要求I所述的生物熒光顯微檢測儀器，其特征在于，所述顯微物鏡為無窮遠消像差型大數(shù)值孔徑的浸油物鏡。
4.根據(jù)權利要求I所述的生物熒光顯微檢測儀器，其特征在于，所述控制單元還與所述激光光源電性連接，用于控制激光的波長和功率。
全文摘要
本發(fā)明提供的生物熒光顯微檢測儀器包括激發(fā)光照明單元、激發(fā)光和熒光隔離單元、反射單元、顯微成像單元、熒光探測單元及控制單元。激發(fā)光照明單元的第一擴束鏡及第二擴束鏡之間且位于第一擴束鏡的焦點處設有照明針孔，熒光探測單元的成像鏡頭和光電倍增管之間且位于成像鏡頭的焦點處設有成像探測針孔，有效提高了該儀器的橫向分辨率；同時，在顯微成像單元的筒鏡與顯微物鏡之間設置環(huán)形光束整形組件，提高了該生物熒光顯微檢測儀器在軸向的分辨率。
文檔編號G01N21/64GK102818794SQ20121025574
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權日2012年7月23日
發(fā)明者張運海, 朱磊, 唐志豪, 肖昀, 王真, 陳瑞濤 申請人:蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所