專利名稱：一種蟲草菌粉水分含量快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蟲草菌粉成分檢測領域，尤其涉及一種蟲草菌粉水分含量快速檢測方法。
背景技術：
由于天然蟲草產(chǎn)區(qū)具有局限性，產(chǎn)量稀少，加上長期以來亂采濫挖造成生態(tài)破壞嚴重，野生蟲草遠遠不能滿足日益增長的市場需求。發(fā)酵蟲草菌粉是分離自蟲草寄生真菌經(jīng)過生物技術發(fā)酵生產(chǎn)的中藥保護品種，同時也是一種重要的功能保健食品，富含腺苷、D-甘露醇、多種氨基酸等活性物質，具有抗腫瘤、抗疲勞和提高免疫力等重要生物學功能(Pan B S, Lin C Y, Huang B M. Evid Based Complement Alternat Med,2011,2011 750468. ；ffang Z-M,Peng X,Lee K-L D，et al. Food Chemistry,2011,125(2) :637-643.)。冬蟲夏草屬于子囊菌綱、麥角科、蟲草屬，為蟲草中的一種，是我國特有的名貴強壯滋補中藥材。發(fā)酵冬蟲夏草菌粉為從新鮮冬蟲夏草中分離得到的真菌無性世代菌種經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)所得菌絲體的干燥粉末。目前，主要采用干燥失重 法對發(fā)酵蟲草菌粉(包括發(fā)酵冬蟲夏草菌粉)的水分含量進行定量檢測，雖然不破壞樣本，但測定過程很費時，僅能進行抽樣檢測，無法實現(xiàn)企業(yè)要求對產(chǎn)品質量信息進行大規(guī)模的獲取的要求。進入21世紀以來，國外利用近紅外光譜(Near Infrared Spectroscopy, NIRS)分析技術對食品、農(nóng)副產(chǎn)品、石油等中各種成分的檢測以及產(chǎn)品質量影響因素的研究日益增多，國內(nèi)研究者也逐漸使用NIRS分析技術對發(fā)酵蟲草菌粉、蛹蟲草發(fā)酵菌粉的主要成分甘露醇，氨基酸以及多糖進行定量檢測以及用于發(fā)酵條件的優(yōu)化的探索研究(WANG Di7ZHANGYuan-li,MENG Qin-fan. Acta Optica Sinica,2009 (10) :2795-2799. ；YANG Nan-Iin,CHENYi-yu. analytical chemistry(analytical chemistry),2003 (06) :664-668. ；ZHA0 Chen,QU Hai-bin, CHEN Yi-yu. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2004 (01) :50-53.)。但是這些研究都僅僅使用NIRS對活性成分進行簡單定量，而關于發(fā)酵蟲草菌粉中水分的NIRS定量檢測尚未有人涉及，且還沒有人進一步進行波長選擇等分析。公開號CN101413885A的發(fā)明專利申請公開了一種快速定量蜂蜜品質的近紅外光譜方法，包括收集蜂蜜樣品；用常規(guī)化學方法獲得蜂蜜樣品的水分、葡萄糖、果糖含量和淀粉酶值；采集蜂蜜樣品的近紅外光譜圖；對所述近紅外光譜圖進行預處理，消除干擾因素，選擇波長范圍；分別建立蜂蜜樣品的水分、葡萄糖、果糖含量和淀粉酶值和近紅外光譜之間的校正模型并檢驗；采集待測樣品的近紅外光譜；用所建模型預測待測樣品的水分、葡萄糖、果糖含量和淀粉酶值。該方法能同時預測蜂蜜中的水分、葡萄糖、果糖含量和淀粉酶值，但由于采用的是全波段掃描，對水分的預測效果仍不理想。發(fā)酵蟲草菌粉中的水分含量如果超標往往會影響其品質，造成變質失效。如能解決快速準確定量檢測的問題，對大批量生產(chǎn)過程中的質量控制具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，用于蟲草菌粉中水分含量的快速、無損、準確檢測，解決了現(xiàn)有檢測方法操作繁瑣、耗時、耗力、成本高、污染環(huán)境等問題。一種蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，包括(I)取蟲草菌粉樣本，測定水分含量；(2)采集蟲草菌粉樣本的近紅外光譜并進行預處理，采用偏最小二乘法建立蟲草菌粉樣本中水分含量與預處理后的近紅外光譜之間的校正模型；(3)采集待測樣本的近紅外光譜并進行預處理，通過校正模型計算得到待測樣本的水分含量；其中，采集近紅外光譜的光譜掃描波段為4277. 63-4316. 20cm1,4887. 06-4941. 07cm_1,5056. 78-5172. 50cm_1 和 5218. 78399-5303. 64cm_10電磁波波長800_2500nm范圍內(nèi) 為物質分子振動光譜的倍頻和組合頻譜帶，因而包含了物質組分和分子結構的豐富信息，可用于成分含量的定量測定。含氫基團(O-H)對光波有很強的吸收，通過掃描樣品的近紅外光譜，可以得到樣品中水分子基團的特征信息，用于水分的定量。步驟(I)中，所述的蟲草菌粉可以為人工發(fā)酵蟲草菌絲體(包括不同來源菌種如cordyceps sinensis (Berk)sacc, Paecilomyces hepiali Chen & Dai, Cephalosporiunsinensis. Chen. Sp. nov, Mortierella SP,蟲甬蟲草種[Cordyceps militaris (L. Fr) Link])經(jīng)干燥、粉碎后得到的粉末；也可以為天然蟲草經(jīng)干燥、粉碎后得到的粉末。天然蟲草是不同蟲草菌屬真菌通過各種方式感染蝙蝠蛾(鱗翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾屬昆蟲)的幼蟲，以其體內(nèi)的有機物質作為營養(yǎng)能量來源進行寄生生活，最終菌絲體扭結并形成子座伸出寄主外殼，形成的一種特殊的蟲菌共生的生物體。采用人工發(fā)酵方法時，所述的蟲草菌粉為發(fā)酵蟲草菌粉，可以通過如下方法制備將經(jīng)活化的蟲草菌株接種到液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)后分離得到菌絲體，菌絲體經(jīng)干燥、粉碎后得到發(fā)酵蟲草菌粉；也可以為市售產(chǎn)品，包括發(fā)酵蟲草菌絲體粉原料、膠囊制劑內(nèi)容物、蛹蟲草菌絲體粉等。冬蟲夏草為蟲草中的一種，所述的發(fā)酵蟲草菌粉優(yōu)選為發(fā)酵冬蟲夏草菌粉；更優(yōu)選為杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌粉，該產(chǎn)品為從新鮮冬蟲夏草中分離得到的真菌無性世代菌種經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)所得菌絲體的干燥粉末，是通過特殊的發(fā)酵、干燥工藝制備獲得的，菌絲體與發(fā)酵液分離地較徹底，活性成分含量較高且質量穩(wěn)定，水分
含量差異較小。所述的蟲草菌粉的粒徑優(yōu)選為80-100目，構建的校正模型預測效果較好。樣本量越大，所構建模型的可靠性越高；但樣本量過大會增加工作強度。所述的蟲草菌粉樣本的數(shù)量優(yōu)選為162個以上。為了構建校正模型并進行預測，可以均勻抽取總樣本的2/3作為校正集，其余剩下的1/3作為預測集，并確保預測集濃度分布均勻，且范圍不超過校正集。杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)的發(fā)酵冬蟲夏草菌粉質量穩(wěn)定，樣本間水分含量差異較小，即樣本梯度較窄，不利于模型構建。但采用本發(fā)明的方法，能獲得預測效果較好的模型。所述的蟲草菌粉樣本水分含量的最大值與最小值之間的差值可以在I. 5%以上。測定水分含量的方法可以為干燥失重法，依照《中華人民共和國藥典》2000年版(二部)中的記載。步驟⑵中，采集近紅外光譜時采 用傅立葉變換近紅外光譜儀；優(yōu)選地，采用MP A型多功能傅立葉變換近紅外光譜儀，光譜范圍液體透射、光纖探頭、積分球(12800-40000^1)，固體透漫射(12800-5700^^1)，分辨率2cm_1 (O. 3nm 在 l，250nm 處)，波數(shù)準確度優(yōu)于O. 05CHT1，波數(shù)精度優(yōu)于O. lcnT1，透光率精度優(yōu)于O. 1% T。采用該近紅外光譜儀，可以米集2203個波長信息,利于建模。為了減少光譜數(shù)據(jù)受采集時裝樣差異、樣本不均勻等因素帶來的影響，所述的預處理可以采用Savitzky-Golay卷積平滑(S-G平滑)處理、歸一化(normalization)處理、多元散射校正(MSC)、基線校正(baseline)和標準正態(tài)變量變換(SNV)中的一種或多種。通過預處理可以簡化、強化模型，其中，S-G平滑處理實質上是一種加權平均法，是消除噪聲最常用的一種方法；歸一化常被用來校正由微小光程差異引起的光譜變化。MSC主要用于消除顆粒分布不均勻及顆粒大小產(chǎn)生的散射影響；基線校正主要用于扣除儀器背景或漂移對信號的影響；SNV與MSC的目的基本相同，主要是用來消除固體顆粒大小、表面散射及光程變化對光譜的影響。優(yōu)選地,所述的預處理采用Savitzky-Golay卷積平滑處理。試驗證明，采用該預處理方法，校正模型對樣本中水分含量的預測效果最好。建立校正模型時可以采用偏最小二乘法(PLS)、主成分分析法(PCR)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡法(ANN)中的一種。本發(fā)明采用所述的偏最小二乘法可以使用全譜或部分譜數(shù)據(jù)，且數(shù)據(jù)矩陣分解和回歸交互結合為一步，得到的特征值向量與被測組分或性質相關，而不是與數(shù)據(jù)矩陣中變化最大的變量相關，比較適用于小樣本多元數(shù)據(jù)分析，可以使用于復雜的分析體系。建立PLS校正模型過程中，通過留一法進行交互驗證，當驗證集均方根誤差(RMSEV)達到最小而r2最大值時所使用的主因子數(shù)目被認為是最優(yōu)。將它們作為輸入變量，建立PLS校正模型，進行預測。校正模型的建立可以采用Unscramber軟件進行。采集近紅外光譜數(shù)據(jù)時可以采用全波段掃描，光譜掃描波段可以為12493. 45-3999. 91cm—1 (儀器參數(shù)為4000-125000^1,是MPA儀器能采集到全譜范圍參數(shù))。為了有效選出包含有特征信息的波段，提高運算速度，可以采用相關系數(shù)和回歸系數(shù)結合法進行特征波段的選取，特征波長的選取會較大程度地影響待測成分的檢測效果。相關系數(shù)法是在多元校正中，通過將光譜陣中每個波長對應的反射率向量與待測濃度向量進行相關性計算，對應相關系數(shù)越大其信息相應越多。本發(fā)明中，根據(jù)全波段下的PLS回歸系數(shù)圖，對水分含量設定相關系數(shù)絕對值大于O. 2的波長為所需要的特征波長，選定的波段為 5303. 64-3999. WcnT1。回歸系數(shù)法是在回歸分析中度量因變量對自變量的相依程度的指標，它是在通過多項式或其它帶參數(shù)的函數(shù)對自變量和因變量達到最佳擬合程度時的多項式系數(shù)或函數(shù)的參數(shù)，可據(jù)此選出相依程度較高的波長。本發(fā)明中，根據(jù)全波段下的PLS回歸系數(shù)圖，對水分含量設定閾值為6 X 10_3，選定的波段分別為4277. 63-4316. 20cm^，4887. 07-4941. 07cm_1,5056. 78-5172. 50cm_1 和 5218. 78-5508. 07cm_1 四個波段。
選取這幾個光譜區(qū)間相交的部分作為建模時的特征波段，即采集近紅外光譜的光譜掃描波段為 4277. 63-4316. 20cm_1,4887. 06-4941. 07cm_1,5056. 78-5172. 50cm_1 和5218. 78399-5303. 64cm^0采用該特征波段，不僅能有效提高預測效果，而且能大大減少建模中的運算量，提高建模速度，并為檢測儀器的開發(fā)提供依據(jù)。模型性能的優(yōu)劣以對預測集樣本 的準確判別率為標準，可以采用預測相關系數(shù)(r)、預測均方根誤差(RMSEP)、剩余預測偏差(RPD)評價模型性能。r值越高，RMSEP值越小，說明模型性能越好；RPD值是化學值標準偏差與RMSEP的比值，其值在I. 5 2. O之間被認為是模型可以區(qū)分變量的高值和低值，在2. O 2. 5表明可以進行定量預測，超過2. 5則表明有良好的預測精度。所述的校正模型的因子數(shù)采用留一法交叉驗證，即建模的過程中每次取其中一個變量來作為驗證，剩下的建模。步驟(3)中，所述的近紅外光譜采集和預處理方法可以參照步驟(2)中的相關操作。本發(fā)明采用近紅外光譜分析結合化學計量學技術對蟲草菌粉中水分含量進行了定量分析，以Savitzky-Golay平滑處理對近紅外光譜進行預處理，并選取 4277.63-4316.20(311^,4887.06-4941.0701^,5056.78-5172.50(31^1 和5218. 78399-5303. 64cm^四個特征波段，建立了偏最小二乘法回歸模型。本發(fā)明方法適用于濃度梯度窄的樣本，通過所選取的特征波段進行建模，建模過程中運算量小，建模速度快；且所建立的偏最小二乘法回歸模型有效性好、可靠性高，對待測樣本中水分含量的預測效果好，可以實現(xiàn)對蟲草菌粉中水分含量的快速、準確、無損檢測。本發(fā)明方法通過與過程控制系統(tǒng)整合，可實現(xiàn)對分析數(shù)據(jù)的集成管理和生產(chǎn)過程的實時監(jiān)控；將光譜儀器通過光纖連接檢測探頭，結合本方法可用于發(fā)酵蟲草菌粉生產(chǎn)過程中樣品的實時檢測，為生產(chǎn)實踐中的近紅外在線檢測打下了基礎。


圖I為實施例I中全光譜樣本平均光譜曲線圖；圖2為實施例I中水分回歸系數(shù)和相關系數(shù)圖,其中，圖(a)為水分PLS回歸系數(shù)圖，圖(b)為水分的相關系數(shù)圖；圖3為實施例2中全光譜樣本平均光譜曲線圖。
具體實施例方式實施例I發(fā)酵冬蟲夏草菌粉中水分含量檢測I、樣品制備隨機收集162個發(fā)酵冬蟲夏草菌粉樣品用于建立整個數(shù)據(jù)集。為使采集的樣品更具代表性和多樣性，樣品分別來自杭州中美華東制藥有限公司提供的不同批次(20批次)發(fā)酵冬蟲夏草菌粉，使所建模型具有更好的適應性和魯棒性。樣品以(4±1°C )的溫度保存；每個樣品放在統(tǒng)一的塑料封裝袋中，整個實驗在室溫18-20°C下進行。2、采用化學方法測定水分含量
依照《中華人民共和國藥典》2000年版(二部)中描述的干燥失重法；測得值為100克樣品中的含量值(g)。測定結果見表I。按照水分測量值進行排序后均勻抽取總樣品的2/3 (總計108個)作為校正集，其余剩下的1/3作為預測集，確保預測集濃度分布均勻，且范圍不超過校正集。表I建模集和預測集的水分含量(g/100g)
權利要求
1.一種蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，包括 (1)取蟲草菌粉樣本，測定水分含量； (2)采集蟲草菌粉樣本的近紅外光譜并進行預處理，采用偏最小二乘法建立蟲草菌粉樣本中水分含量與預處理后的近紅外光譜之間的校正模型； (3)采集待測樣本的近紅外光譜并進行預處理，通過校正模型計算得到待測樣本的水分含量; 其中，采集近紅外光譜的光譜掃描波段為4277. 63-4316. 20cm—1，4887. 06-4941. 07cm_1,5056. 78-5172. 50cm_1 和 5218. 78399-5303. 64cm_10
2.根據(jù)權利要求I所述的蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，其特征在于，所述的蟲草菌粉為發(fā)酵蟲草菌粉。
3.根據(jù)權利要求2所述的蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，其特征在于，所述的蟲草菌粉為發(fā)酵冬蟲夏草菌粉。
4.根據(jù)權利要求I所述的蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，其特征在于，所述的蟲草菌粉的粒徑為80-100目。
5.根據(jù)權利要求I所述的蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，其特征在于，所述的蟲草菌粉樣本的數(shù)量為162個以上。
6.根據(jù)權利要求5所述的蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，其特征在于，所述的蟲草菌粉樣本水分含量的最大值與最小值之間的差值在I. 5%以上。
7.根據(jù)權利要求I所述的蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，其特征在于，步驟(I)中，測定水分含量的方法為干燥失重法。
8.根據(jù)權利要求I所述的蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，其特征在于，步驟(2)或(3)中，所述的預處理采用Savitzky-Golay卷積平滑處理、歸一化處理、多元散射校正、基線校正和標準正態(tài)變量變換中的一種或多種。
9.根據(jù)權利要求8所述的蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，其特征在于，所述的預處理采用Savitzky-Golay卷積平滑處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蟲草菌粉水分含量快速檢測方法，包括取蟲草菌粉樣本，測定水分含量；采集蟲草菌粉樣本的近紅外光譜并進行預處理，采用偏最小二乘法建立蟲草菌粉樣本中水分含量與預處理后的近紅外光譜之間的校正模型；采集待測樣本的近紅外光譜并進行預處理，通過校正模型計算得到待測樣本的水分含量；其中，采集近紅外光譜的光譜掃描波段為4277.63-4316.20cm-1，4887.06-4941.07cm-1，5056.78-5172.50cm-1和5218.78399-5303.64cm-1。本發(fā)明方法通過特征波段進行建模，運算量小，建模速度快；所建立的PLS回歸模型可靠性高、預測效果好，可以實現(xiàn)對蟲草菌粉中水分含量的快速、準確、無損檢測。
文檔編號G01N21/35GK102768195SQ20121022775
公開日2012年11月7日 申請日期2012年6月29日 優(yōu)先權日2012年6月29日
發(fā)明者何勇, 張昀, 徐寧, 魏萱 申請人:杭州中美華東制藥有限公司