專利名稱：用于組織保存的產(chǎn)品和方法
用于組織保存的產(chǎn)品和方法交叉引用
本申請(qǐng)要求于2010年4月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/323，185的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)通過引用整體并入本文。技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明總體上涉及例如在用于病理學(xué)分析或用于組織研究應(yīng)用的組織處理過程中穩(wěn)定大分子或保持組織完整性。本發(fā)明提供了一組用于組織保存的小分子或溶質(zhì)。
背景技術(shù)：
甲醛水溶液(福爾馬林)組織固定是目前醫(yī)學(xué)病理學(xué)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。在20世紀(jì)早期，福爾馬林固定技術(shù)經(jīng)高度優(yōu)化得以支持染料和金屬染色劑的使用。20世紀(jì)中期，由于大部分蛋白質(zhì)表位穩(wěn)定并且尺寸小，發(fā)現(xiàn)同樣的福爾馬林固定技術(shù)支持抗體在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用。
病理學(xué)中的固體組織固定(FFPE)標(biāo)準(zhǔn)是10%的磷酸鹽緩沖的福爾馬林，在25°C 下溫育8-24小時(shí)，然后在乙醇中脫水，將溶劑更換成二甲苯，然后用熔化溫度(Tm)約為 56°C的石蠟聚合物共混物包埋。該過程提供高度可重現(xiàn)的染料染色，但產(chǎn)生已斷裂的并且被化學(xué)損傷內(nèi)部修飾的DNA和RNA互補(bǔ)物。
在完全脫水、石蠟包埋的組織中，DNA和RNA在長(zhǎng)儲(chǔ)存期內(nèi)并不穩(wěn)定。數(shù)據(jù)讓人想起所有核酸在環(huán)境溫度下在諸如濾紙的基質(zhì)中干燥儲(chǔ)存時(shí)所見的情況。這種時(shí)間依賴性的核酸損傷可能是由于殘余水污染所造成的(緩慢)水解，或者甚至更可能地，是由于核酸與已經(jīng)滲透進(jìn)FFPE組織塊的分子氧的擴(kuò)散相互作用所造成的核酸堿基(尤其是G)的緩慢氧化。
在甲醛水溶液處理過程中導(dǎo)致的并發(fā)核酸損傷，由于核酸的不穩(wěn)定性和基因組測(cè)試所需要的大片段核酸靶標(biāo)-通常至少500個(gè)堿基，極大地限制了基因組學(xué)的應(yīng)用。已經(jīng)證明，如果通過使用有機(jī)溶劑混合物來完全取代福爾馬林進(jìn)行固定，能夠獲得高度穩(wěn)定的DNA 和RNA。然而，這些“非福爾馬林”方法尚未被病理學(xué)界接受，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生的組織形態(tài)學(xué)變化雖然少但非常顯著，并且基于溶劑的固定劑需要對(duì)一個(gè)世紀(jì)以來的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行顯著的改變。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供在樣品固定過程中使用降解抑制劑來增加/維持樣品內(nèi)容物(例如， 樣品核酸、蛋白質(zhì)等)的完整性。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，此處所述的組合物、方法和試劑盒可用于抑制蛋白質(zhì)的翻譯后磷酸化修飾(即磷_蛋白質(zhì))的完整性的損失。在另一個(gè)實(shí)施方式中，此處所述的組合物、方法和試劑盒可用于抑制以下材料的降解或維持其完整性 純化或未純化的多核苷酸，包括例如DNA (dsDNA和ssDNA)、甲基化DNA、線粒體DNA、葉綠體 DNA、DNA-RNA雜合體、RNA、mRNA、rRNA或其混合物，例如微生物如細(xì)菌、酵母、病毒、類病毒、霉菌、真菌、植物、動(dòng)物、人類的生物材料的基因、染色體、質(zhì)粒和基因組及其片段。因此，降解抑制劑可以是多核苷酸降解抑制劑或蛋白質(zhì)降解抑制劑。
可以進(jìn)一步分析此處所述的樣品以用于體外診斷應(yīng)用或研究應(yīng)用。在一些實(shí)例中，采用核酸分析法分析此處所述的樣品。
可以在根據(jù)本發(fā)明的方法固定后對(duì)樣品核酸進(jìn)行的核酸分析的例子包括但不限于擴(kuò)增，如單鏈擴(kuò)增、指數(shù)式擴(kuò)增、PCR、數(shù)字PCR、定量PCR、實(shí)時(shí)PCR，測(cè)序，包括焦磷酸測(cè)序、單鏈延伸測(cè)序、單分子測(cè)序、連接測(cè)序、雜交測(cè)序，RFLP, SNP分析,微陣列分析等。
可以進(jìn)一步分析此處固定的樣品以檢測(cè)或診斷病癥，包括但不限于癌癥、胎兒異常、自身免疫病和其他遺傳性疾病。
核酸降解抑制劑的例子包括，例如核酸酶抑制劑。優(yōu)選地，本發(fā)明使用的核酸降解抑制劑是具有透過細(xì)胞或組織的能力的小分子。與不存在抑制劑的條件下的降解相比，核酸降解抑制劑優(yōu)選地抑制多核苷酸降解達(dá)至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或 99.5%。所用的抑制劑的濃度可以變化。在一些實(shí)例中，可以加入此處所述的抑制劑以達(dá)到< O. 05、O. lmM、0. 5mM、或IOmM的單獨(dú)或最終集合濃度。
在一些實(shí)例中，核酸降解抑制劑是DNA酶抑制劑或RNA酶抑制劑。
在一些實(shí)例中，在“固定”過程中將多種組織滲透性的、廣譜核酸酶抑制劑加入固定劑(如福爾馬林)中。固定步驟中廣譜核酸酶抑制劑的加入導(dǎo)致更好的DNA和/或RNA 完整性。例如，采用本發(fā)明的方法，DNA可以保持大于約I. 0,5. O或IOkb的長(zhǎng)度超過一周、 一個(gè)月、一年或十年。同樣地，采用本發(fā)明的方法，RNA可以保持大于約O. 1、0.5、1.0或IOkb 的長(zhǎng)度超過一周、一個(gè)月、一年或十年。
表I在此描述了示例性的核酸酶抑制劑。
表2描述了示例性的ROS清除劑。
在一些實(shí)施方式中，降解抑制劑是磷酰基轉(zhuǎn)移酶超家族的抑制劑。
在一些實(shí)施方式中，降解抑制劑是小分子。然而，它也可以是酶或抗體或其他化合物。優(yōu)選地，抑制劑具有高組織滲透性。例如，本發(fā)明的抑制劑可以以> lmm/hr、5mm/hr、 10mm/hr>20mm/hr> 100mm/hr的速率滲透組織。在一些實(shí)例中，本發(fā)明的降解抑制劑以50% 的抑制劑在4小時(shí)、3小時(shí)、2小時(shí)、I小時(shí)、30分鐘、20分鐘、10分鐘或I分鐘內(nèi)滲透組織的速率滲透組織。
在一些實(shí)例中，降解抑制劑包含螯合劑。螯合劑可以是Mg2+螯合劑，或更優(yōu)選 EDTA。在一些方面，螯合劑與RNA酶抑制劑或DNA酶抑制劑聯(lián)合使用。
優(yōu)選地，降解抑制劑小到足以容易地?cái)U(kuò)散到直徑小于40nm的孔內(nèi)。
降解抑制劑可以單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。在一些實(shí)例中，在固定步驟中至少加入2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同的核酸降解抑制劑，例如通過加入到固定劑中或乙醇的醇清洗液中。例如，核酸酶抑制劑、ROS清除劑和/或磷酰基轉(zhuǎn)移酶超家族抑制劑的組合可以一起加入。
如上面所提供的，抑制劑可以加入到固定劑中?；蛘邆溥x地或額外地，它們也可以加入到醇清洗液(例如，在組織處理過程中使用的第一水_乙醇清洗液)中。
因此，在一些實(shí)例中，本發(fā)明涉及含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10種不同的降解抑制劑的組合物，這些降解抑制劑或者都在一個(gè)容器中或者在不同的容器中但在一個(gè)試劑盒中。在一些實(shí)例中，本發(fā)明涉及含有固定劑(如福爾馬林)的容器和在同一溶液或容器中或者在不同溶液或容器中但在同一試劑盒中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種不同的降解抑制劑。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有醇清洗液(如乙醇清洗液)的容器和在同一溶液或容器中或者在不同溶液或容器中但在同一試劑盒中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 種不同的降解抑制劑。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有福爾馬林和降解抑制劑的溶液。優(yōu)選地，降解抑制劑是分離的或合成的。優(yōu)選地，降解抑制劑是小分子。溶液可以進(jìn)一步含有樣品。在一些實(shí)施方式中，溶液由或基本由福爾馬林或其他固定劑和降解抑制劑組成。
降解抑制劑優(yōu)選地在37°C下一個(gè)月后在福爾馬林固定的組織中以下述水平保持不受損傷的DNA鏈長(zhǎng)度和不受損傷的RNA鏈長(zhǎng)度，其與完成固定后立即獲得的水平相當(dāng)或與該水平相差在 90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%,10%,5%,3%^； 1% 內(nèi)。
可在福爾馬林固定過程之前或期間加入核酸降解抑制劑。
因此，本發(fā)明提供包含以下成分、由以下成分組成或基本由以下成分組成的組合物(i) 一種或多種降解抑制劑，和(ii)福爾馬林或醇清洗液。
在本發(fā)明的任何實(shí)施方式中，福爾馬林可以是磷酸鹽緩沖的1-37質(zhì)量％的福爾馬林。
本發(fā)明的任何組合物可進(jìn)一步含有生物樣品。該生物樣品優(yōu)選地是組織樣品。該樣品優(yōu)選地來自哺乳動(dòng)物或人類。援引并入
所有在本說明書中提到的出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過引用并入本文，其程度等同于具體且單獨(dú)地指明每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)通過引用并入本文。
具體實(shí)施方式
本文所用的術(shù)語“樣品”或“生物樣品”是指組織樣品、器官樣品、個(gè)體細(xì)胞或以上任意一種的一部分。優(yōu)選的樣品的例子包括組織樣品，如用于檢測(cè)癌癥突變(如與獨(dú)特的預(yù)后或治療選擇有關(guān)的EGFR或HER2突變)或癌癥基因異常表達(dá)的活檢組織。樣品的其他例子包括含有頰內(nèi)細(xì)胞、口頰細(xì)胞、毛發(fā)樣品、血液樣品和粘液樣品的頰拭子。
本文所用的術(shù)語“抑制”和“抑制劑”也指活性降低或降低活性的化合物，例如，其中降低至少50%、40%、30%、20%的活性。進(jìn)旦冃月^
本發(fā)明提供用于在保存期間，例如，在用于病理學(xué)分析或用于組織研究應(yīng)用的組織處理期間，穩(wěn)定大分子的試劑、方法和試劑盒。特別地，本發(fā)明涉及向福爾馬林溶液中或向與福爾馬林溶液接觸之前的樣品中加入降解抑制劑，優(yōu)選核酸酶抑制劑，以提高樣品中生物分子(如DNA、RNA或蛋白質(zhì))的完整性。
甲醛是一種氣體，其在水中飽和時(shí)水合，形成在組織滲透過程中為活性劑的甲二醇(也稱作“福爾馬林”)。水合是緩慢可逆的，并且產(chǎn)生的游離coh2(在平衡狀態(tài)下可得到)造成所觀察到的蛋白質(zhì)和核酸的化學(xué)修飾。在水合的COH2和組織之間所期望的化學(xué)反應(yīng)是蛋白質(zhì)上非常緊密間隔排列的胺基團(tuán)的交聯(lián)，從而形成所謂的甲醛交聯(lián)或 (-R1-NH-CH2-NH-R2-)，其中，例如,R1和R2可以是在相鄰蛋白質(zhì)上或在同一蛋白質(zhì)內(nèi)緊密相間排列的賴氨酸或天冬酰胺側(cè)鏈。如果兩個(gè)反應(yīng)物在O. 1-0. 2nm內(nèi)，以平均時(shí)間算，這樣的交聯(lián)非常迅速地發(fā)生，而且與相對(duì)較小的、正的生成焓有關(guān)(即，甚至在低溫下該過程也能迅速進(jìn)行)。這些迅速形成的甲醛交聯(lián)是為顯微鏡檢查提供所期望的組織形態(tài)學(xué)穩(wěn)定性的化學(xué)連接。正如所預(yù)期的，所生成的雙_烷基-氨基交聯(lián)對(duì)于酸或堿中的水解是非常穩(wěn)定的。在沒有胺基因接近時(shí)，反應(yīng)停止于單氨基加成物(-R1-NH-CH2-OH)的形成，該加成物在低溫下也容易形成，但是在酸和堿中容易逆轉(zhuǎn)。不受理論的約束，本發(fā)明的一些實(shí)施方式阻止或限制多核苷酸的降解，同時(shí)對(duì)交聯(lián)沒有或只有有限的影響。
福爾馬林和核酸之間的相應(yīng)反應(yīng)純粹是組織副反應(yīng)，對(duì)于組織保存來說是不希望的。穩(wěn)定的反應(yīng)產(chǎn)物伴隨環(huán)外堿性胺，大致反應(yīng)性順序?yàn)锳>C>G。至于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)，將要形成的唯一穩(wěn)定的復(fù)合物為(-R1-NH-CH2-NH-R2-)，其中最常見地，R1是環(huán)外胺且R2是染色體蛋白質(zhì)(對(duì)于DNA)或RNP (對(duì)于RNA)。在不存在這種雙官能連接時(shí)，單官能 (-R1-NH-CH2-OH)加成物在接近中性時(shí)容易逆轉(zhuǎn)，尤其是在加熱至約70°C時(shí)。在單純的核酸溶液中，單官能產(chǎn)物或交聯(lián)產(chǎn)物都不會(huì)誘導(dǎo)DNA或RNA鏈斷裂。在染色質(zhì)免疫沉淀(Chip) 技術(shù)領(lǐng)域中，在大鼠肝臟模型中，Masuda等人針對(duì)RNA以及Tokuda等人針對(duì)DNA都已經(jīng)證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。因此，在固體組織的福爾馬林固定期間觀察到的核酸斷裂并不是由于甲醛化學(xué)。相反，這是組織浸泡在磷酸緩沖液中幾個(gè)小時(shí)期間內(nèi)源性組織核酸酶活性的結(jié)果。因此，不受理論的束縛，本發(fā)明的實(shí)施方式旨在在組織浸泡在磷酸緩沖液中幾個(gè)小時(shí)期間防止內(nèi)源性組織核酸酶活性。
降解抑制劑及其應(yīng)用
本發(fā)明涉及減少樣品固定期間的多核苷酸降解和/或蛋白質(zhì)降解的方法。雖然通常采用福爾馬林進(jìn)行固定，但本發(fā)明考慮使用降解抑制劑加上任意固定劑。非福爾馬林固定劑的例子包括但不限于醛類、汞制劑、醇類、氧化劑、苦味酸鹽和醇固定劑。不受理論的束縛，內(nèi)源性組織核酸酶活性可能是由于樣品中水的存在引起的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于在初始固定步驟中消除水以便消除內(nèi)源性組織核酸酶活性的試劑和方法。例如，醇固定劑或用醇-氯仿或醇-PEG固定可以用來消除樣品中的水并產(chǎn)生高分子量組織補(bǔ)充物的保留。
無論使用哪種固定劑，本發(fā)明考慮向樣品和/或固定劑中加入一種或多種降解抑制劑。例如，降解抑制劑可以是多核苷酸降解抑制劑和/或蛋白質(zhì)降解抑制劑。優(yōu)選地，固定劑是福爾馬林且降解抑制劑不是福爾馬林。降解抑制劑可以是分離的、天然存在的試劑或非天然存在的試劑。
降解抑制劑可以包括任何減少或抑制核酸或蛋白質(zhì)降解或斷裂的化合物。因此， 術(shù)語“抑制”或“抑制劑”或“將...抑制”分別與“減少”、“減少劑”或“使...減少”同義。 涉及降解時(shí)，減少優(yōu)選地是在一段時(shí)間內(nèi)與不存在抑制劑時(shí)的降解相比，至少50%、60%、 70%、80%、90%、95%或99%的減少。然而，任何核酸降解的減少或完整性都被認(rèn)為是降解的抑制。
降解抑制劑包括但不限于磷?；D(zhuǎn)移酶超家族的抑制劑，如螯合劑、DNA酶抑制劑、RNA酶抑制劑，以及活性氧(ROS)的清除劑或抑制劑。在一些情況下，降解抑制劑是酶。 在一些情況下，降解抑制劑是小分子。優(yōu)選地，它是水溶性的。優(yōu)選地，它難溶于醇或二甲苯，因此在組織轉(zhuǎn)移至無水溶劑時(shí)，它永久性地嵌入脫水的組織塊基質(zhì)中。
螯合劑可用作磷?；D(zhuǎn)移酶超家族的抑制劑。螯合劑的非限制性例子包括: (2-羥丙基)-β -環(huán)糊精溶液；一水合2，3- 二巰基-I-丙磺酸鈉鹽；3_羥基-2- (5-羥基戊基)苯并吡喃-4-酮；(+)-(18-冠-6)-2，3，11，12-四甲酸；氨基己酸次氮基三乙酸；α -環(huán)糊精；氨基己酸次氮基三乙酸三叔丁酯；酒石酸二銨；ΒΑΡΤΑ-四甲酯；ΒΑΡΤΑ，游離酸；甲磺酸去鐵胺；丁二酮肟；DMSA(間-2，3- 二巰基琥珀酸);EDTA 二鈉鹽二水合物；EGTA ；EGTA/ AM;乙二胺四(亞甲基膦酸)；SC-300682;乙二胺四乙酸二銨鹽；乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液；FLUO 3，五銨鹽；HBED;七(6-0叔丁基二甲基甲硅烷基-2，3-二-O-乙?；?-β -環(huán)糊精；IND0 I五鉀鹽；鐵DOTA鈉鹽；MAPTAM ;N-(2，6-二異丙基苯基氨基甲?；谆?亞氨基二乙酸；N，N-二甲基癸胺N-氧化物；N，N-二甲基十二烷基胺N-氧化物；Ν4，Να，Να，Ν ε， N ε _[五(羧甲基)]-Ν4-(羧甲基)-2，6_ 二氨基_4_氮雜己酸酰肼；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；亞苯基乙烯三胺五乙酸；植酸六鋇鹽；吡哆醛異煙酰腙；檸檬酸二氫鉀；D_酒石酸二氫鉀；一水合草酸鉀；四水合酒石酸鈉鉀；二水合四草酸鉀；外消旋(溴乙酰氨基苯基甲基)乙二胺四酸；RH0D 2三銨鹽；RH0D2/AM ； [S-甲硫代磺酰基半胱胺基]乙二胺-N，N， N'，N'-四乙酸；(S)-l-(對(duì)-溴乙酰氨基芐基)乙二胺四乙酸；一水合酒石酸氫鈉；酒石酸二鈉溶液；檸檬酸鈉；叔-Boc-氨基己酸次氮基三乙酸；四乙酰氧甲基雙(2-氨基乙基) 醚N,N,N' ,N'-四乙酸；X-206 ;Zinpyr-l ;或Zinpyr-4。不受理論所束縛,可以認(rèn)為，由于 DNA酶需要游離Mg2+以實(shí)現(xiàn)其功能，因此二價(jià)陽離子螯合劑，特別是Mg2+螯合劑，例如EDTA， 在抑制DNA酶方面有效。
RNA酶抑制劑的例子包括但不限于核糖核酸酶抑制因子(RI)。RI是一種大的(約 450個(gè)殘基，約49kDa)、酸性的(PI約4. 7)、富含亮氨酸的重復(fù)蛋白質(zhì)，它與某些核糖核酸酶形成極其緊密的復(fù)合體。RI對(duì)氧化作用敏感。在一些實(shí)施方式中，ROS清除劑可以用來保護(hù)RI免于氧化。在這樣的實(shí)施方式中，RI和ROS清除劑在共同溶液中使用。有幾種市售的RI形式可以在本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒中使用。它們的非窮盡的清單包括: SUPERase · In 、RNA 酶 cure 、Ambion .⑧ RNAlater 、RNAlater ⑩-ICE、核糖核昔-氧鑰； 基絡(luò)合物、RNasin㊣+RNA酶抑制劑和RNAlater⑩。抗氧化的核糖核酸酶抑制劑(在US 7，650，248中描述)是可在本發(fā)明中使用的RNA酶抑制劑的另一個(gè)例子。
DNA酶抑制劑的例子包括但不限于脫氧核糖核酸酶I、脫氧核糖核酸酶II和微球菌核酸酶的抑制劑。DNA酶的非限制性例子包括N 2-巰基乙醇；2_硝基-5-氰硫基苯甲酸;肌動(dòng)蛋白;黃曲霉毒素B2a、G2、G2a和Ml (非競(jìng)爭(zhēng)性)；Ca2+ ；EGTA和EDTA ;十二烷基硫酸鈉；小牛脾抑制劑蛋白質(zhì)；和碳二亞胺和膽固醇硫酸鹽。其他的核酸酶抑制劑包括美國(guó) 2005/0214839中公開的化合物，其通過引用并入本文。
表I總結(jié)了幾種磷酸鹽拮抗劑。表I.用于固體組織的廣譜核酸酶抑制劑
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含a.降解抑制劑，和b.福爾馬林。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述福爾馬林在1-37質(zhì)量％之間用磷酸鹽緩沖。
3.權(quán)利要求1的組合物，其進(jìn)一步包含固體組織樣品。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述降解抑制劑小到足以容易地?cái)U(kuò)散到小于40nm的孔內(nèi)。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述降解抑制劑包含磷酰基轉(zhuǎn)移酶超家族的小分子抑制劑。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述小分子抑制劑為RNA酶活性抑制劑。
7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述小分子抑制劑為DNA酶活性抑制劑。
8.權(quán)利要求5的組合物，其中所述小分子抑制劑包括表1中的一種或多種。
9.權(quán)利要求5的組合物，其中所述降解抑制劑進(jìn)一步包括Mg2+螯合劑。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述Mg2+螯合劑為EDTA。
11.權(quán)利要求5的組合物，其中所述降解抑制劑進(jìn)一步包括水溶性活性氧清除劑。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述水溶性活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中所述降解抑制劑為活性氧清除劑。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。
15.權(quán)利要求12的組合物，其中所述降解抑制劑進(jìn)一步包括Mg2+螯合劑。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述螯合劑為EDTA。
17.一種組合物，其包含a.磷酰基轉(zhuǎn)移酶超家族的小分子抑制劑，和b.活性氧清除劑。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中所述小分子抑制劑包括表1，并且其中所述活性氧清除 劑為表2。
19.權(quán)利要求17的組合物，其進(jìn)一步包含螯合劑。
20.權(quán)利要求18的組合物，其中所述螯合劑為EDTA。
21.—種用于保存生物樣品中的多核苷酸的方法，該方法包括a.使所述生物樣品與福爾馬林接觸，b.使所述生物樣品與降解抑制劑接觸。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述生物樣品與福爾馬林的接觸在1°C與6°C之間的溫度 或室溫下進(jìn)行。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述福爾馬林具有在3-10范圍內(nèi)的pH。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述降解抑制劑包括磷酰基轉(zhuǎn)移酶超家族的小分子抑制劑。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述小分子抑制劑包括表1中的一種或多種。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述降解抑制劑包括水溶性活性氧清除劑。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述水溶性活性氧清除劑包括表2)中的一種或多種。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述降解抑制劑包括磷?；D(zhuǎn)移酶超家族的小分子抑制劑和水溶性活性氧清除劑。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述小分子抑制劑包括表I中的一種或多種，并且其中所述水溶性活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。
30.一種用于分析多核苷酸的方法,包括a.獲得生物樣品，其中該樣品已經(jīng)與福爾馬林溶液接觸、與降解抑制劑接觸、脫水、包埋并儲(chǔ)存；b.純化所述多核苷酸，和c.分析所述多核苷酸。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述分析包括進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)、測(cè)序反應(yīng)、微陣列分析或表達(dá)分析。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述小分子抑制劑包括表I中的一種或多種。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述降解抑制劑包括活性氧清除劑。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述水溶性活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述降解抑制劑包括磷?；D(zhuǎn)移酶超家族的小分子抑制劑和活性氧清除劑。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述小分子抑制劑包括表I中的一種或多種，并且所述水溶性活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。
37.權(quán)利要求21或30的方法，其中在降解抑制劑在福爾馬林溶液中時(shí)進(jìn)行生物樣品與降解抑制劑的接觸。
38.權(quán)利要求21或30的方法，其中在降解抑制劑在乙醇-水清洗液中時(shí)進(jìn)行生物樣品與降解抑制劑的接觸。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述降解抑制劑是水溶性活性氧清除劑。權(quán)利要求39的方法，其中所述活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。一種用于儲(chǔ)存生物樣品的試劑盒，包括福爾馬林溶液和降解抑制劑。權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述降解抑制劑包括磷?；D(zhuǎn)移酶超家族的小分子抑
40.
41.
42. 制劑。
43.
44.
45.
46.權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述小分子抑制劑包括表I中的一種或多種。權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述降解抑制劑包括水溶性活性氧清除劑。權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。一種含有多種多核苷酸的福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織，其中至少5%的多核苷酸鏈為超過300個(gè)堿基對(duì)。
47.一種從固定的組織中回收的多核苷酸a.其中所述多核苷酸鏈為至少300個(gè)堿基對(duì)，b.其中所述組織在福爾馬林中固定，c.其中所述福爾馬林包含降解抑制劑，d.其中所述固定的組織包埋在石蠟中。
48.權(quán)利要求47的多核苷酸，其中所述降解抑制劑包括磷?；D(zhuǎn)移酶超家族的小分子抑制劑。
49.權(quán)利要求48的多核苷酸,其中所述小分子抑制劑包括表I中的一種或多種。
50.權(quán)利要求48的多核苷酸，其中所述小分子抑制劑進(jìn)一步包括水溶性活性氧清除劑。
51.權(quán)利要求50的多核苷酸，其中所述活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。
52.權(quán)利要求47的多核苷酸，其中所述降解抑制劑包括活性氧清除劑。
53.權(quán)利要求52的多核苷酸，其中所述活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。
54.—種從固定的組織中回收的多核苷酸a.其中所述多核苷酸鏈為至少300個(gè)堿基對(duì)，b.其中所述組織在福爾馬林中固定，c.其中在含有水溶性活性氧清除劑的乙醇_水清洗液中清洗所述組織，且d.其中所述固定的組織包埋在石蠟中。
55.權(quán)利要求54的多核苷酸，其中所述活性氧清除劑包括表2中的一種或多種。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及用于提高福爾馬林固定的、任選地石蠟包埋的生物材料的穩(wěn)定性的方法。在一個(gè)實(shí)例中，在固定時(shí)或之前不久，將DNA酶抑制劑和/或RNA酶抑制劑與生物材料或福爾馬林合并。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102939525SQ201180018483
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者M·霍甘 申請(qǐng)人:金沃特公司