專利名稱：石墨烯基質(zhì)及其在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析檢測(cè)，具體是一種石墨烯基質(zhì)及其在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其無(wú)論是在理論上還是在設(shè)計(jì)上都是十分簡(jiǎn)單和高效的。儀器主要由兩部分組成 基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測(cè)定。TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測(cè)離子。MALDI-T0F-MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段，并正扮演著越來(lái)越重要的作用。1988年，Tanaka和Hillenkamp各自提出了 MALDI技術(shù)，這種方法的成功之處是在質(zhì)譜中引入了基質(zhì)(Matrix)。在MALDI-TOF MS中，基質(zhì)起著吸收、傳遞激光能量、使樣品離子化的決定性作用，而且輔助基質(zhì)的引入還解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性的生物大分子在質(zhì)譜中的解吸離子化問題，使其能成功檢測(cè)。目前，市場(chǎng)上出售的常用基質(zhì)為α--氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、2，5-二羥基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、納米硅膜、類金剛石材料及其他們的衍生物等?；|(zhì)的存在對(duì)于能量傳遞以及保持分子的完整性及其重要，但基體的引入不可避免地導(dǎo)致在低分子量區(qū)域內(nèi)基質(zhì)峰的存在，因此大大限制了該方法在小分子分析中的應(yīng)用。因此，基質(zhì)種類的選擇，濃度的大小，樣品和基質(zhì)的比例大小的選擇因素使樣品制備更加復(fù)雜，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子化合物的快速分析。熊少祥等利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析甲殼素脫乙?；到猱a(chǎn)物一殼聚糖，對(duì)基質(zhì)、制樣方法等影響MALDI-T0FMS測(cè)定結(jié)果的因素進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以2，5_ 二羥基苯甲酸(DHB)為基質(zhì)，二次結(jié)晶法制樣分析殼聚糖，既獲得了殼聚糖的分子量信息，又可以推斷殼聚糖的脫乙酰度；卓慧欽等以二羥基苯甲酸(DHB)為基質(zhì)，應(yīng)用 MALDI-TOF MS技術(shù)，采用比對(duì)法，研究在乙腈作用下HTF裂解成為各種各樣短肽的規(guī)律，初步闡明其裂解機(jī)理。在乙腈作用下，HTF可能通過蛋白質(zhì)去折疊途徑，形成不同多聚態(tài)HTF 或多肽裂解產(chǎn)物。推測(cè)目前用于臨床診斷先天性糖基化紊亂(CDG)和慢性酒精濫用(CAA) 疾病低準(zhǔn)確率的起因可能是受HTF裂解產(chǎn)物或多聚體的干擾；劉念等以芥子酸(SA)為基質(zhì)，通過探討影響質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)的主要因素，建立了優(yōu)化的基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜的生物組織質(zhì)譜成像方法。但正如上所述，上述基質(zhì)易產(chǎn)生小分子離子峰對(duì)分析結(jié)果(尤其是對(duì)小分子化合物)產(chǎn)生干擾，且對(duì)于純的樣品，MALDI-FOF MS能夠分析樣品低至飛摩爾(femtomole，IO"15)到阿托摩爾(attOmOle，10_18)的樣品。但是在實(shí)際分析樣品時(shí)，樣品來(lái)源都是非常復(fù)雜的體系如血液、細(xì)胞溶解物、組織、培養(yǎng)液等，其中含有大量的蛋白質(zhì)、鹽、表面活性劑、防腐劑等雜質(zhì)，此外，樣品本身的疏水性和酸堿性質(zhì)也極大地影響離子化效率，因而傳統(tǒng)基質(zhì) (matrix，如α —氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、2，5_ 二羥基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA))的 MALDI-TOF MS很難分析這樣復(fù)雜的樣品，同時(shí)對(duì)操作者也有很高的要求，而且操作者需要冗長(zhǎng)的時(shí)間去摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此限制了該項(xiàng)技術(shù)對(duì)低分子量化合物的分析及對(duì)小分子代謝物等生物催化反應(yīng)體系的監(jiān)控，急需開發(fā)新型基質(zhì)。石墨烯基質(zhì)在MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析中的應(yīng)用，尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供石墨烯或功能化石墨烯基質(zhì)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是
一種石墨烯基質(zhì)的制備方法，包括如下步驟
(1)將石墨(1.5 g, 325 目)加入到 12 ml 濃 H2SO4, 2. 5 g K2S2O8 和 2. 5 g P2O5 的混合物中，加熱上述混合體系至80 °C，保持該溫度，磁力攪拌5小時(shí)。隨后冷卻反應(yīng)體系至
室溫；
(2)將混合物傾入500ml去離子水中，靜置過夜；
(3)將上述靜置物經(jīng)0.2微米濾膜過濾，洗滌并自然晾干，得預(yù)氧化石墨；
(4)將該預(yù)氧化的石墨加入到00C的濃H2SO4 (120 ml)中；
(5)隨后緩慢加入15g KMnO4，并控制反應(yīng)溫度在20 °C攪拌。高錳酸鉀加畢，控制反應(yīng)體系在35 °C攪拌4小時(shí)，隨后，加入250 ml去離子水，并通過外圍冰浴控制溫度在50 0C 以下。攪拌1.5小時(shí)后，再加入700 ml去離子水，半小時(shí)后，逐滴滴入20 ml 30% H2O2，反應(yīng)體系迅速由棕色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色。撤去攪拌裝置；
(6)過濾該棕黃混合物，用1 10 HCl 1 L洗滌以除去金屬離子，隨后再用1 L去離子水反復(fù)洗滌，得棕色固體，室溫干燥后；
(7)將上述棕色固體制成水分散液(0.5% w/w)，連續(xù)透析一周，最后過濾，洗滌，重新分散超聲1小時(shí)，過濾，60 °C真空干燥M小時(shí)，即可制備得到石墨烯氧化物；
(8)將上述石墨烯氧化物制成1mg/ml分散液(100 ml)，加入水合胼(1 ml)，超聲30 分鐘后再100 0C回流M小時(shí)，過濾，洗滌，60 °C真空干燥M小時(shí)，即可制備得到石墨烯納米片基質(zhì)。石墨烯基質(zhì)的另一種制備方法，包括如下步驟
(1)將碳納米管樣品置于空氣中400 °C煅燒1小時(shí)，然后置于通有氬氫混合氣的管式爐中于900 °C加熱1小時(shí)；
(2)將第一步處理好的碳納米管加入到12mol/L的濃鹽酸中在100 °C回流4小時(shí)，再過濾并用去離子水清洗至中性，在800°C烘干；
(3)將堿金屬鈉與碳納米管按質(zhì)量比2 1混合，隨后通過堿金屬熔融法進(jìn)行處理；
(4)將產(chǎn)物過濾洗凈，于80！烘干，得石墨烯納米帶基質(zhì)。除石墨烯納米片和納米帶外，所述的石墨烯還可以是石墨烯納米顆粒、石墨烯納米纖維等各種石墨烯產(chǎn)品。
功能化石墨烯基質(zhì)的制備方法，包括如下步驟
(1)將石墨烯氧化物(200mg)分散到40ml 二氯亞砜與1 ml N，N-二甲基甲酰胺的混合介質(zhì)中，室溫超聲0. 5小時(shí)，隨后回流52小時(shí)，制備得到棕色酰氯化合物(219. 2 mg)
(2)將按照文獻(xiàn)方法制備的鄰苯二甲酰殼聚糖(phthaloylchitosan, 1. 753 g)，LiCl (1.201 g)和N，N-二甲基乙酰胺(DMAC，120 ml)混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下140 °C反應(yīng)2小時(shí)， 冷卻該反應(yīng)體系后，將前一步制得的棕色酰氯化合物(219. 2 mg)及14 ml吡啶加入到反應(yīng)體系中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流48小時(shí)，冷卻后，過濾，洗滌，真空干燥；
(3)干燥后固體在120ml蒸餾水中攪拌6小時(shí)，過濾，保留固體重新分散于200 ml水
中，超聲1小時(shí)，過濾，洗滌。所得固體在真空65 °C下干燥M小時(shí)，得中間體PHCS-GO (205 g)；
(4)將該中間體分散于15ml水合胼中，80 °C下反應(yīng)16小時(shí)去除鄰苯二甲酰保護(hù)。過濾，洗滌，真空干燥得含活性胺基的殼聚糖功能化石墨烯(175 mg)納米片基質(zhì)。功能化石墨烯納米材料的另一種制備方法，包括如下步驟
(1)將方法1制備的功能化石墨烯(100mg)加入1. 5 ml水。隨后，加入10 ml乙二醇，超聲20分鐘，逐滴加入氯化鈀乙二醇溶液10 ml (2. 03 mg Pd/ml)，調(diào)節(jié)pH值到5_6，反應(yīng)體系劇烈超聲5分鐘，隨后攪拌過夜；
(2)隨后，用2.5 M的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到13，140 °C下反應(yīng)3小時(shí)，整個(gè)反應(yīng)過程均采取氮?dú)獗Ｗo(hù)。冷卻到室溫后，過濾；
(3)水及乙醇洗滌各三次，真空650C下干燥M小時(shí)，得功能化石墨烯鈀納米顆粒/ 殼聚糖修飾的石墨烯類納米片基質(zhì)。所述的功能化石墨烯基質(zhì)包括羥基、巰基等功能團(tuán)修飾、小分子修飾、高分子修飾、量子點(diǎn)、金屬納米粒子修飾、金屬氧化物修飾、DNA等生物大分子等功能材料修飾的石墨火布。石墨烯基質(zhì)表征
檢測(cè)所用儀器有
產(chǎn)物尺寸和形貌的表征是在JEM-2010F透射電鏡(TEM)，JE0L-2010F高分辨透射電鏡 (HRTEM)以及JSM-7401F場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FESEM)上進(jìn)行的，電鏡的工作電壓為200 kV。X 射線能譜(EDS)及選區(qū)衍射(SAED)實(shí)驗(yàn)是在JE0L-2010F高分辨透射電鏡下完成的。產(chǎn)物的粉末X射線衍射(XRD)表征是在德國(guó)Bruker D8-advance X射線衍射儀上進(jìn)行的，X射線是單色的CuK α輻射線(λ =1.5418 A)，2 θ掃描角度從10到70°，步長(zhǎng)0.02°。傅里葉紅外光譜(FTIR)實(shí)驗(yàn)FTIR-8201 (PerkinElmer公司)紅外光譜儀上進(jìn)行。紅外光譜分析通過樣品與KBr壓片后進(jìn)行測(cè)試。拉曼光譜選用英國(guó)雷紹尼公司Renishaw microprobe RM1000型拉曼光譜儀，激發(fā)波長(zhǎng)633 nm(He/Ne激光器)。原子力測(cè)試(Atomic force microscopic, AFM)采用美國(guó)維易科精密儀器有限公司的Nanoscope III MultiMode SPM (數(shù)顯)型掃描探針原子力顯微鏡。元素分析采用美國(guó)EAI公司的CE-440元素分析儀。檢測(cè)結(jié)果為
典型功能化石墨烯材料表征結(jié)果如下以鈀納米顆粒/石墨烯復(fù)合材料為例，負(fù)載前石墨烯納米片基本為單層或少層疊加形貌，單層石墨烯層厚約0. 80 nm,石墨烯大小約為 1-5 μ m,負(fù)載后鈀納米粒子的直徑范圍在2-8 nm之間，具有較小的粒徑及較窄帶粒徑分布(依據(jù)透射電鏡及掃描電鏡表征結(jié)果);拉曼光譜顯示其在1331 cnT1及1590 cnT1具有特征拉曼峰，分別歸屬為石墨烯的D帶和G帶；X射線衍射圖(XRD)觀察到7。、39.6°、45· 5° 和67.3°等四個(gè)布拉格反射峰，第一個(gè)對(duì)應(yīng)于石墨烯的(002)晶面，后三個(gè)峰依次對(duì)應(yīng)鈀的(111)，(200), (220)晶面；紅外光譜顯示該納米材料具有1545 cnT1特征峰，可歸屬為石墨烯的骨架震動(dòng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供石墨烯或功能化石墨烯材料作為基質(zhì)應(yīng)用于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)。石墨烯或功能化石墨烯在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用方法，包括如下步驟
(1)儀器與試劑的準(zhǔn)備BIFLEXIII型MALDI TOF質(zhì)譜儀；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm, 采用離子延遲引出及反射的工作方式，正離子檢測(cè)；所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件FlexAnalysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flexlmaging 1.0，差異分析軟件 ClinProtools 2. O 等軟件處理;
(2)在載體上制備石墨烯膜或石墨烯涂層，氣體吹干備用；所述的石墨烯膜為單層或 2-4層，是以石墨烯或功能化石墨烯粉末為原料，經(jīng)物理方法在載體表面形成均勻的鍍層， 厚度約為100-500 nm ；所述石墨烯涂層亦為單層或2_4層。(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將溶劑分散后樣品滴加到石墨烯膜或涂層表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。所述的石墨烯或功能化石墨烯膜作為基質(zhì)可用于分子量為50_8500Da.(道爾頓) 有機(jī)小分子化合物、生物大分子、聚合物、C6tl、一些配合物的質(zhì)譜檢測(cè)，且石墨烯不易被分析物分析，并具有很好的重現(xiàn)性和高耐磨性。所述的有機(jī)小分子化合物為50_1000Da，包括小肽核苷酸單體、氨基酸、脂類或糖類化合物。所述的生物大分子為1000-8500Da，包括多鈦、蛋白質(zhì)、寡糖、寡核苷酸等。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1、特質(zhì)性強(qiáng)作為基質(zhì)的石墨烯(功能化石墨烯)膜或涂層具有獨(dú)特的物理和化學(xué)特性，如高硬度、低摩擦系數(shù)、高耐磨性、化學(xué)穩(wěn)定性、耐腐蝕性、導(dǎo)熱性、光學(xué)透過性、生物相容性等；
2、適應(yīng)性強(qiáng)載體可以是商品化MALDI靶、硅片、載玻片、玻璃、金屬片或高分子塑料；
3、成本低，通用性強(qiáng)使用后的基質(zhì)石墨烯膜或涂層經(jīng)有機(jī)溶劑清洗、再生后，可重復(fù)使用；
4、靈敏度高有效排除有機(jī)基質(zhì)產(chǎn)生的背景影響，避免基質(zhì)分子離子峰信號(hào)的干擾，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小分子化合物的準(zhǔn)確定性分析；
5、分析范圍寬可成功實(shí)現(xiàn)氨基酸、核苷酸單體等小分子量化合物、聚醚等高分子聚合物、C6tl、一些配合物乃至DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)范圍分子量 50-8500 Da.(道爾頓)；
6、重現(xiàn)性和高耐鹽性應(yīng)用石墨烯為新型基體可避免被分析物分解，具有很好的重現(xiàn)性和高耐鹽性；7、高效、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)用石墨烯(功能化石墨烯)作為基質(zhì)的MALDI-TOF MS，是一種不需要加入任何有機(jī)基質(zhì)的新的解吸離子化方法，為天然產(chǎn)物及生物代謝物提供了高效、快速的檢測(cè)方法，同樣也適用于常見生物大分子的檢測(cè)，可以在所有的MALDI-TOF MS質(zhì)譜中推廣和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了石墨烯的深層次應(yīng)用。


圖1為以石墨烯為基質(zhì)檢測(cè)精胺(分子離子峰203 [M+H]+，205 [M+Na]+)，精脒 (分子離子峰168 [M+Na] + )及腐胺(分子離子峰111 [M+Na] + )等混合胺的MALDI-TOF MS譜圖2為微波輔助法制備的石墨烯的原子力圖；基底云母片，尺寸4.0 X 4.0 ym； 圖3為XRD射線衍射分析a)石墨烯；b)鈀納米粒子功能化的的石墨烯； 圖4為輪烯的MALDI-TOF MS譜圖(基質(zhì)石墨烯，分子離子峰300. 1)； 圖5為以石墨烯為基質(zhì)檢測(cè)氯苯Ullmarm反應(yīng)中間體捕捉的MALDI-TOF MS譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過幾個(gè)典型應(yīng)用實(shí)施例進(jìn)一步闡述石墨烯基質(zhì)或功能化石墨烯基質(zhì)在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用。實(shí)施例中所述石墨烯基質(zhì)或功能化石墨烯基質(zhì)采用如前所述的制備方法制得，在此不再重述。實(shí)施例1 檢測(cè)精胺精脒腐胺等混合胺樣品的方法
(1)儀器與試劑為=BIFLEXIII型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng) 337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)；所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理；
(2)在載體上制備石墨烯納米片涂層，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將N，N-二甲基甲酰胺溶劑分散后的精胺精脒腐胺等混合胺(等摩爾比)樣品溶液滴加到石墨烯膜或涂層表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析(圖1)。實(shí)施例2 檢測(cè)輪烯樣品的方法
(1)儀器與試劑為=BIFLEXIII型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng) 337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)；所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理；
(2)在載體上制備石墨烯納米片涂層，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將二甲苯溶劑分散后的輪烯樣品溶液滴加到石墨烯涂層表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析(圖 4)。實(shí)施例3 檢測(cè)鯊烯樣品的方法(1)儀器與試劑為=BIFLEXIII型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng) 337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)；所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理；
(2)在載體上制備石墨烯納米片涂層，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將N，N-二甲基甲酰胺溶劑分散后鯊烯樣品溶液滴加到石墨烯膜或涂層表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。實(shí)施例4 檢測(cè)黃連堿樣品的方法
(1)儀器與試劑BIFLEX III型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)。所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理。(2)在載體上制備石墨烯納米片涂層，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將四氫呋喃溶劑分散后黃連堿樣品溶液滴加到石墨烯納米片涂層表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。實(shí)施例5 檢測(cè)甲基丙烯酸甲酯(PMMMA，聚合物)樣品的方法
(1)儀器與試劑BIFLEX III型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)。所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理。(2)在載體上制備石墨烯納米帶膜，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將1，4-二氧六環(huán)溶劑分散后的甲基丙烯酸甲酯(PMMMA，聚合物)樣品溶液滴加到石墨烯納米帶膜表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。實(shí)施例6 檢測(cè)小肽Gly-Val樣品的方法
(1)儀器與試劑BIFLEX III型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)。所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理。(2)在載體上制備殼聚糖功能化石墨烯納米片膜，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將乙酸乙酯溶劑分散后的小肽Gly-Val樣品溶液滴加到殼聚糖功能化石墨烯納米片膜表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。
實(shí)施例7 檢測(cè)維生素Bl (鋅配合物)樣品的方法
(1)儀器與試劑BIFLEX III型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)。所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理。(2)在載體上制備鈀納米顆粒/殼聚糖修飾的石墨烯納米片涂層，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將N，N-二甲基甲酰胺溶劑分散后維生素Bl (鋅配合物)樣品溶液滴加到鈀納米顆粒/殼聚糖修飾的石墨烯納米片涂層表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。實(shí)施例8 檢測(cè)馬肌紅蛋白樣品的方法
(1)儀器與試劑BIFLEX III型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)。所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理。(2)在載體上制備石墨烯納米片膜，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將乙醇溶劑分散后馬肌紅蛋白樣品溶液滴加到石墨烯納米片膜表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。實(shí)施例9 檢測(cè)Bicr6蛋白(人血清中腫瘤標(biāo)志物)樣品的方法
(1)儀器與試劑BIFLEX III型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)。所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理。(2)在載體上制備巰基化石墨烯納米片膜，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將乙醇溶劑分散后Bicr6蛋白(人血清中腫瘤標(biāo)志物)樣品溶液滴加到巰基化石墨烯膜表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。實(shí)施例10 檢測(cè) DNA (序列ACCCGTTAG CGG CGG TCG TCG AATC CGGG ATCG TG tcgaggg aagaag acacgatcgc)樣品的方法
(1)儀器與試劑BIFLEX III型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)。所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理。(2)在載體上制備石墨烯納米片膜，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將正己燒溶劑分散后DNA (序列ACCCGTTAG CGG CGG TCG TCG AATC CGGG ATCG TGTCGAGGG AAGAAG ACACGATCGC)樣品溶液滴加到石墨烯納米片膜表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。實(shí)施例11 檢測(cè)Ullmarm反應(yīng)中間體的方法
(1)儀器與試劑BIFLEX III型MALDI TOF質(zhì)譜儀(Bruker公司)；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出(delayed extraction)及反射(reflectorn)的工作方式，正離子檢測(cè)。所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理。(2)在載體上制備鈀納米顆粒/殼聚糖修飾的石墨烯納米片涂層，氣體吹干備用；
(3)將載體固定在MALDI靶上；
(4)將氯苯溶劑(同時(shí)也作為Ullmarm反應(yīng)的反應(yīng)物，0.5ml)與鋅粉(0.01 g，還原劑) 和酸性離子液體[bmim (HSO3C4)] [HSO4] (0.25 ml)混合，并逐漸滴加到石墨烯納米帶膜表面后，鈀納米顆粒/殼聚糖修飾的石墨烯納米片除作為基質(zhì)外，還可作為Ullmarm反應(yīng)催化劑，隨著混合樣品的滴加，部分Ullmarm反應(yīng)產(chǎn)物可被檢測(cè)器俘獲并進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析(圖5)。
權(quán)利要求
1.石墨烯基質(zhì)在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征是包括如下步驟(1)儀器與試劑的準(zhǔn)備BIFLEXIII型MALDI TOF質(zhì)譜儀；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出及反射的工作方式，正離子檢測(cè)；所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理；(2)在載體上制備石墨烯膜或涂層，氣體吹干備用；(3)將載體固定在MALDI靶上；(4)將溶劑分散后樣品滴加到石墨烯或功能化石墨烯膜或涂層表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述石墨烯基質(zhì)采用包括如下步驟的制備方法制得(1)將石墨(1.5 g, 325 目)加入到 12 ml 濃 H2SO4, 2. 5 g K2S2O8 和 2. 5 g P2O5 的混合物中，加熱上述混合體系至80 °C，保持該溫度，磁力攪拌5小時(shí)，隨后冷卻反應(yīng)體系至室溫；(2)將混合物傾入500ml去離子水中，靜置過夜；(3)將上述靜置物經(jīng)0.2微米濾膜過濾，洗滌并自然晾干，得預(yù)氧化石墨；(4)將該預(yù)氧化的石墨加入到O0C的濃H2SO4 (120 ml)中；(5)隨后緩慢加入15g KMnO4，并控制反應(yīng)溫度在20 °C攪拌，高錳酸鉀加畢，控制反應(yīng)體系在35 °C攪拌4小時(shí)，隨后，加入250 ml去離子水，并通過外圍冰浴控制溫度在50 0C 以下，攪拌1.5小時(shí)后，再加入700 ml去離子水，半小時(shí)后，逐滴滴入20 ml 30% H2O2，反應(yīng)體系迅速由棕色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色，撤去攪拌裝置；(6)過濾該棕黃混合物，用1 10 HCl (1 L)洗滌以除去金屬離子，隨后再用1 L去離子水反復(fù)洗滌，得棕色固體，室溫干燥后；(7)將上述棕色固體制成水分散液(0.5% w/w)，連續(xù)透析一周，最后過濾，洗滌，重新分散超聲1小時(shí)，過濾，60 °C真空干燥M小時(shí)，即可制備得到石墨烯氧化物；(8)將上述石墨烯氧化物制成1mg/ml分散液(100 ml)，加入水合胼(1 ml)，超聲30 分鐘后再100 0C回流M小時(shí)，過濾，洗滌，60 °C真空干燥M小時(shí)，即可制備得到石墨烯納米片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述石墨烯基質(zhì)采用包括如下步驟的制備方法制得(1)將碳納米管樣品置于空氣中400 °C煅燒1小時(shí)，然后置于通有氬氫混合氣的管式爐中于900 °C加熱1小時(shí)；(2)將第一步處理好的碳納米管加入到12mol/L的濃鹽酸中在100 °C回流4小時(shí)，再過濾并用去離子水清洗至中性，在800°C烘干；(3)將堿金屬鈉與碳納米管按質(zhì)量比2 1混合，隨后通過堿金屬熔融法進(jìn)行處理； (4)將產(chǎn)物過濾洗凈，于80 ！烘干，得石墨烯納米帶基質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的石墨烯基質(zhì)，其特征是所述的石墨烯為石墨烯納米片、石墨烯納米帶或石墨烯納米纖維。
5.功能化石墨烯基質(zhì)在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征是包括如下步驟(1)儀器與試劑BIFLEXIII型MALDI TOF質(zhì)譜儀；氮激光器，波長(zhǎng)337 nm，采用離子延遲引出及反射的工作方式，正離子檢測(cè)；所采集的數(shù)據(jù)利用Flexcontrol 2. 2，數(shù)據(jù)分析軟件Flex Analysis 2. 4，質(zhì)譜成像軟件Flex Imaging 1.0，差異分析軟件Clin Protools 2. O等軟件處理；(2)在載體上制備石墨烯膜或涂層，氣體吹干備用；(3)將載體固定在MALDI靶上；(4)將溶劑分散后樣品滴加到石墨烯或功能化石墨烯膜或涂層表面后，使樣品與基質(zhì)形成的混晶二次結(jié)晶，溶劑揮發(fā)后即制得待測(cè)分析樣品，進(jìn)行激光解析離子化質(zhì)譜分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是所述功能化石墨烯基質(zhì)采用包括如下步驟的制備方法制得(1)將石墨烯氧化物(200mg)分散到40ml 二氯亞砜與1 ml N，N-二甲基甲酰胺的混合介質(zhì)中，室溫超聲0. 5小時(shí)，隨后回流52小時(shí)，制備得到棕色酰氯化合物(219. 2 mg)(2)將按照文獻(xiàn)方法制備的鄰苯二甲酰殼聚糖(phthaloylchitosan, 1. 753 g)，LiCl (1.201 g)和N，N-二甲基乙酰胺(DMAC，120 ml)混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下140 °C反應(yīng)2小時(shí)， 冷卻該反應(yīng)體系后，將前一步制得的棕色酰氯化合物(219. 2 mg)及14 ml吡啶加入到反應(yīng)體系中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流48小時(shí)，冷卻后，過濾，洗滌，真空干燥；(3)干燥后固體在120ml蒸餾水中攪拌6小時(shí)，過濾，保留固體重新分散于200 ml水中，超聲1小時(shí)，過濾，洗滌，所得固體在真空65 °C下干燥M小時(shí)，得中間體PHCS-GO (205 g)；(4)將該中間體分散于15ml水合胼中，80 °C下反應(yīng)16小時(shí)去除鄰苯二甲酰保護(hù)，過濾，洗滌，真空干燥得含活性胺基的殼聚糖功能化石墨烯(175 mg)納米片基質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是所述功能化石墨烯基質(zhì)采用包括如下步驟的制備方法制得(1)將方法1制備的功能化石墨烯(100mg)加入1. 5 ml水，隨后，加入10 ml乙二醇， 超聲20分鐘，逐滴加入氯化鈀乙二醇溶液10 ml (2. 03 mg Pd/ml)，調(diào)節(jié)pH值到5_6，反應(yīng)體系劇烈超聲5分鐘，隨后攪拌過夜；(2)隨后，用2.5 M的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到13，140 °C下反應(yīng)3小時(shí)，整個(gè)反應(yīng)過程均采取氮?dú)獗Ｗo(hù)，冷卻到室溫后，過濾；(3)水及乙醇洗滌各三次，真空650C下干燥M小時(shí)，得功能化石墨烯鈀納米顆粒/ 殼聚糖修飾的石墨烯類納米片基質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的應(yīng)用，其特征是所述的石墨烯膜為單層或2-4層，是以石墨烯或功能化石墨烯粉末為原料，經(jīng)物理方法在載體表面形成均勻的鍍層，厚度約為 100-500 nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的應(yīng)用，其特征是石墨烯或功能化石墨烯膜作為基質(zhì)用于分子量50-8500 Da.有機(jī)小分子化合物、生物大分子、聚合物、C6tl或一些配合物的激光解吸離子化質(zhì)譜檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征是所述的有機(jī)小分子化合物為50-1000Da.，包括小肽、核苷酸單體、氨基酸、脂類或糖類化合物；所述的生物大分子為1000-8500 Da.，包括多肽、蛋白質(zhì)、寡糖或寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種石墨烯基質(zhì)及其在基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)的應(yīng)用，它是在MALDI-TOFMS中將石墨烯作為輔助基質(zhì)能高效、快速地實(shí)現(xiàn)從小分子化合物到生物大分子的分析和檢測(cè)，更為重要的是可有效排除傳統(tǒng)有機(jī)基質(zhì)的分子離子峰的背景干擾，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)氨基酸、脂類化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸等各種結(jié)構(gòu)分子的分析和檢測(cè)。用石墨烯作為基質(zhì)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是不需要加入任何有機(jī)基質(zhì)的解吸離子化方法，可避免被分析物分解，具有很好的重現(xiàn)性和高耐鹽性；為天然產(chǎn)物及生物代謝物提供了高效、快速的檢測(cè)方法，同樣也可用于常見生物大分子的檢測(cè)，可以在所有的MALDI-TOFMS質(zhì)譜中推廣和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了石墨烯的深層次應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N1/38GK102426187SQ20111037110
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者程金生 申請(qǐng)人:程金生