專利名稱：一種聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中g(shù)fap濃度的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)血清中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)濃度的試劑盒，尤其涉及一種應(yīng)用抗-GFAP抗體特異性包被聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒。
背景技術(shù)：
流行病學(xué)調(diào)查研究表明，目前腦血管疾病與心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成人類疾病死亡的三大原因。與西方發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)腦血管病的發(fā)病率和死亡率明顯高于心血管病。據(jù)估算，全國(guó)每年新發(fā)腦卒中患者約為200萬人；每年死于腦卒中的患者約150萬人；存活患者人數(shù)600萬 700萬，且70% 80%的存活者遺留癱瘓、失語(yǔ)等嚴(yán)重殘疾，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前我國(guó)腦卒中的分型比例中，腦出血約占35% 45%，農(nóng)村高于城市，貧窮地區(qū)高于富裕地區(qū)，腦出血的病死率遠(yuǎn)較腦梗塞高，是一種致死率和致殘率均高的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類特別是老年人的健康，威脅病人的生命，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是一種分子量為 50 52KDa的酸性蛋白，是腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AST)中間纖維的結(jié)構(gòu)蛋白組成成分，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。正常生理?xiàng)l件下，AST對(duì)神經(jīng)元起到營(yíng)養(yǎng)、支持、保護(hù)作用，并積極參與神經(jīng)元的電生理活動(dòng)；腦損傷后AST活化數(shù)量增多由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)態(tài)，其標(biāo)志蛋白GFAP表達(dá)增加。腦出血后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受到損害，大量的胞漿蛋白質(zhì)漏出細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞間液，可溶性的GFAP通過細(xì)胞間液進(jìn)入腦脊液，穿過破壞的血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)。研究表明GFAP在傷后6小時(shí)開始增高，在傷后1 4天期間，腦皮質(zhì)的星形細(xì)胞GFAP陽(yáng)性表達(dá)明顯增加。因此GFAP可作為急性腦出血的生物學(xué)標(biāo)志物。有研究表明，腦出血患者發(fā)病6小時(shí)內(nèi)血清GFAP水平即明顯升高，而缺血性腦卒中患者6小時(shí)內(nèi)血清GFAP 水平與正常對(duì)照組無明顯差異，因此GFAP在發(fā)病6小時(shí)以內(nèi)對(duì)出血性及缺血性卒中患者具有早期鑒別診斷意義。還有研究表明，急性腦出血患者血清中的GFAP與腦出血體積之間有著密切的正相關(guān)關(guān)系。因此GFAP水平在出血后早期判斷腦損傷的程度及患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。目前，對(duì)GFAP的檢測(cè)主要是ELISA實(shí)驗(yàn)方法，且大多僅應(yīng)用于科學(xué)研究，不適用于臨床診斷，而且ELISA方法實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，一般需要2 池才能完成檢測(cè)，不利于實(shí)現(xiàn)對(duì)腦出血患者早期的快速診斷及鑒別診斷的效率的提高。近年來免疫微粒技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫診斷中，免疫微粒技術(shù)是指利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作為載體，包被上具有特異性親和力的抗原或抗體，來檢測(cè)樣本中的生物大分子的一種技術(shù)。乳膠、聚苯乙烯、金膠體或順磁性材料均可制成微粒，與抗原或抗體經(jīng)過物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)及生物素親和橋聯(lián)法形成免疫微粒。但在檢索的結(jié)果中，目前尚未見應(yīng)用聚苯乙烯微球?yàn)楣滔噍d體， 以液相雜交為反應(yīng)模式，制備檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒以定量檢測(cè)血清中GFAP濃度的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種應(yīng)用抗-GFAP抗體特異性包被聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，以實(shí)現(xiàn)快速高效、準(zhǔn)確、可靠的定量檢測(cè)人血清中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)濃度。本發(fā)明所述聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，由96孔過濾板、 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球、微球儲(chǔ)存液、酶結(jié)合物、 底物A、底物B、20X洗滌液組成，其特征在于所述96孔過濾板是底部有滲透性的濾膜并能通過抽真空進(jìn)行洗滌的一種微孔板；所述標(biāo)準(zhǔn)品為濃度為lOOng/ml的GFAP蛋白凍干粉； 所述樣品稀釋液為每升含IOg牛血清白蛋白(BSA)、lml Proclin 300,0. 3ml Tween20的 0. OlM ρΗ7· 4PBS ；所述微球儲(chǔ)存液為每升含0. 1%BSA,0. 02%Tween,0. 1% Proclin 300 的 0. OlM pH7. 4PBS ；所述酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的GFAP 二抗；所述底物A為3mmol/L 魯米諾與lmmol/L對(duì)碘苯酚的混合液；所述底物液B為3mmol/L的雙氧化脲溶液；所述20X 洗滌液為每升含160g氯化鈉、72. 64g十二水合磷酸氫二鈉、4g磷酸二氫鉀、氯4. Sg化鉀、 IOml Tween 20的水溶液。上述聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒中所述表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球上的抗-GFAP抗體優(yōu)選為單克隆抗體；所述辣根過氧化酶標(biāo)記的GFAP 二抗為多克隆抗體。上述聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，優(yōu)選由1塊96孔過濾板、2瓶標(biāo)準(zhǔn)品、1瓶樣品稀釋液、表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球、1瓶微球儲(chǔ)存液、1瓶酶結(jié)合物、1瓶底物A 1瓶、底物B 1瓶、20X洗滌液、20片不干膠封片和1份使用說明書構(gòu)成。上述聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒的應(yīng)用，步驟是(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋每瓶標(biāo)準(zhǔn)品臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，靜置IOmin后， 反復(fù)顛倒混勻，濃度為100ng/ml,做系列稀釋，分別為:100ng/ml、50ng/ml、12· 5ng/ml、 3. 12ng/ml、0. 78ng/ml、0. 05ng/ml，樣品稀釋液作為 0ng/ml ；(2)加樣微球使用前中速振蕩混勻，每孔加入10μ1微球儲(chǔ)存液，其中含 50000 士400個(gè)表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球，用100 μ 1洗滌液真空抽濾洗滌 2-3次后，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測(cè)樣本50μ 1，另設(shè)一空為空白，混勻，37°C振蕩30min ；(3)洗板使用真空泵抽濾，洗滌液洗滌3-4次；(4)加酶結(jié)合物加入50 μ 1酶結(jié)合物，混勻，37°C振蕩30min ；(5)洗板同(3)洗滌3-4次；(6)加底物每孔先后加入底物液A、底物液B各50 μ 1，避光顯色I(xiàn)Omin ；(7)測(cè)定避光顯色I(xiàn)Omin后在化學(xué)發(fā)光儀上讀出各孔相對(duì)發(fā)光度(RLU)；(8)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的相對(duì)發(fā)光度(RLU)由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)； 或計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的相對(duì)發(fā)光度(RLU)代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。本發(fā)明所述的聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度試劑盒的應(yīng)用原理是 將抗GFAP抗體交聯(lián)在聚苯乙烯微球上，在液相環(huán)境中與被測(cè)樣本反應(yīng)以后，再與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標(biāo)記的抗GFAP 二抗反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物(雙抗體夾心復(fù)合物)，然后再同發(fā)光底物反用，通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)其相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定被檢測(cè)樣本中GFAP的濃度，即測(cè)知急性腦出血患者血清中的GFAP濃度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)(1)耗時(shí)短本發(fā)明的固相載體是顆粒極其微小的聚苯乙烯微球，其比表面積大， 表面偶聯(lián)容量大；懸浮反應(yīng)克服了傳統(tǒng)ELISA模式在檢測(cè)時(shí)存在的表面張力和空間障礙對(duì)抗原抗體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，而且液相環(huán)境更有利于保持抗原抗體的天然構(gòu)像和活性，更有利于抗原抗體間的充分反應(yīng)，從而有效的縮短了反應(yīng)時(shí)間，減少了洗滌次數(shù)；(2)靈敏度高本發(fā)明的最低檢出限為17pg/ml，優(yōu)于目前市場(chǎng)上的GFAP ELISA試劑盒(其靈敏度一般為50pg/ml 200pg/ml)；(3)檢測(cè)線性范圍寬標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍在0. 025ng/ml lOOng/ml，可以達(dá)到 3 5個(gè)數(shù)量級(jí)，而一般的ELISA試劑盒檢測(cè)范圍僅有1 2個(gè)數(shù)量級(jí)，比常規(guī)的ELISA方法高10倍以上；(4)成本低本發(fā)明所用的檢測(cè)試劑、消耗品價(jià)格不高，此外可以利用臨床現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀的資源，無需再增加新的設(shè)備，有利于其普及與推廣。本發(fā)明的臨床診斷意義(1)可用于對(duì)腦出血后早期甚至超早期的診斷，并區(qū)別與腦缺血及健康人員；(2)可用于腦出血預(yù)后評(píng)價(jià)動(dòng)態(tài)觀察患者血清中GFAP含量，及時(shí)準(zhǔn)確評(píng)估腦組織破壞程度，提示疾病轉(zhuǎn)歸情況，對(duì)醫(yī)生指導(dǎo)腦出血患者治療具有重要意義；(3)聯(lián)合影像學(xué)檢查，可提高診斷效率，具有重要的臨床意義。


圖1本發(fā)明GFAP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理圖。其中1 聚苯乙烯微球；2 —抗抗-GFAP單克隆抗體；3 被檢測(cè)物GFAP ；4 二抗抗-GFAP多克隆抗體；5 標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP) ；6 底物。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1步驟一微球儲(chǔ)存液的制備(1)微球的活化將聚苯乙烯微球分散均勻后，取5. OX IO6微球加入ΙΟΟμΙ洗滌緩沖液(PBS，0. 05% Tween)，高速振蕩15s，清洗后用80 μ 1活化緩沖液懸浮微球，加入 10 μ 1 碳二亞胺(EDC, 50mg/ml)，再迅速加入 10 μ L Sulfo-NHS (50mg/ml)，高速振蕩 30s,室溫避光振搖20min，然后用500μ 1 0. OlM pH7. 4PBS洗滌2次，每次12000r/min離心!3min， 棄上清，最后用100 μ L 0. OlM pH7. 4PBS懸浮微球。(2)微球的交聯(lián)取抗-GFAP單克隆抗體IOOyg加入到活化后的微球中，用 0. 01MpH7. 4PBS定容至500 μ 1，錫箔紙包裹，室溫避光振搖4h，15000r/min離心5min，棄上清，再用500 μ 1 PBS洗1次，15000r/min離心5min，棄上清。用Iml封閉液(PBS，1 % BSA, 0. 1% Proclin 300)懸浮微球，中速振蕩15s，室溫避光振搖45min, 15000r/min離心5min，棄上清；加入 1. 5ml 微球儲(chǔ)存液(0. OlM pH7. 4PBS，0. 1% BSA，0. 02% Tween,0. 1% Proclin300)，洗滌微球2次，每次15000r/min離心7min，棄上清，最后用Iml微球儲(chǔ)存液懸浮包被上了 GFAP單抗的微球，計(jì)數(shù)后4°C避光保存。步驟二酶結(jié)合物的制備取5mgHRP溶于Iml NaHCO3,攪拌過程中加入含1 % 2，4_ 二硝基氟苯的無水乙醇 0. 1ml，室溫避光攪拌Ih ；加入Iml 0. 06M NaIO4室溫下避光輕攪30min ；加入Iml 0. 16M的乙二醇，室溫下繼續(xù)攪拌lh，用0. OlM pH9. 6的碳酸鹽緩沖液4°C透析過夜。透析袋中加入 5mg抗-GFAP多克隆抗體，用0. 05mol/L,pH9. 6碳酸鹽緩沖液4°C透析20小時(shí)，中間換液3 次。取透析后結(jié)合液加入5mg/mL NaHB4O. 2mL，攪拌30min后，4°C放置4h ；加50%飽和硫酸銨溶液6mL沉淀結(jié)合物，置4°C 30min后，4°C 3000r/min離心30min，取沉淀，將沉淀溶于 0.01M !17.4 85中，用0.0說pH7. 4PBS 4°C透析過夜，最后將透析袋中的酶結(jié)合物收集，分裝，-20°C保存。使用ELISA法測(cè)定其效價(jià)。步驟三標(biāo)準(zhǔn)品的制備標(biāo)準(zhǔn)品為lOOng/ml的GFAP重組抗原凍干粉。使用前用樣品稀釋液溶解并稀釋至設(shè)定濃度。步驟四樣品稀釋液、底物A、底物B、洗滌液的配制(1)樣品稀釋液牛血清白蛋白(BSA) IOgProclin 300ImlTween 200. 3ml0. OlM pH7. 4PBS 定容至 1000ml，過濾除菌，4°C保存。(2)底物 A 魯米諾0. 53g對(duì)碘苯酚 0. 22g0. OlM pH7. 4PBS 定容至 1000ml，過濾除菌，4°C保存。(3)底物 B 過氧化脲 0. 282g0. OlM pH7. 4PBS 定容至 1000ml，過濾除菌，4°C保存。(4) 2O X 洗滌液純化水定容至1000ml，并調(diào)pH至7. 4，過濾除菌，4°C保存。實(shí)施例21.聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，由1塊96孔過濾板、2瓶
氯化鈉
十二水合磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀氯化鉀
4g
4.8g
IOml
160g 72.64g
Tween 20標(biāo)準(zhǔn)品、1瓶樣品稀釋液、表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球、1瓶微球儲(chǔ)存液、1瓶酶結(jié)合物、1瓶底物A 1瓶、底物B 1瓶、20X洗滌液、20片不干膠封片和1份使用說明書構(gòu)成。2.聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒的應(yīng)用(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至lml，靜置IOmin后，反復(fù)顛倒混勻，濃度為 100ng/ml，做系列稀釋，分別為:100ng/ml、50ng/ml、12. 5ng/ml、3. 12ng/ml、 0. 78ng/ml、0. 05ng/ml，樣品稀釋液為 Ong/ml。(2)加樣微球使用前中速振蕩混勻，每孔加入10 μ 1約含50000個(gè)包被GFAP單抗的微球，用100 μ 1洗滌液真空抽濾洗滌2次后，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測(cè)樣本50 μ 1， 另設(shè)一孔為空白，混勻，37°C振蕩30min。(3)洗板使用真空泵抽濾，洗滌液洗滌3次。(4)加酶結(jié)合物加入50 μ 1酶結(jié)合物，混勻，37°C振蕩30min。(5)洗板同⑶洗滌3次。(6)加底物每孔先后加入底物液A、底物液B各50 μ 1，避光顯色I(xiàn)Omin。(7)測(cè)定避光顯色I(xiàn)Omin后在化學(xué)發(fā)光儀上讀出各孔相對(duì)發(fā)光度(RLU)。(8)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的RLU由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的RLU代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。實(shí)施例3對(duì)聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)(1)線性范圍用樣品稀釋液將GFAP抗原以2倍梯度稀釋以下系列濃度100ng/ ml、50ng/ml、12.5ng/ml、6. 25ng/ml、3. 13ng/ml、l.56ng/ml、0. 39ng/ml、0. 10ng/ml、 0. 025ng/ml、0. 013ng/ml,Ong/ml進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度樣本重復(fù)檢測(cè)3次，以樣本濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，線性范圍在0. 025ng/ml lOOng/ml。(2)最低檢出限將去除GFAP的零值血清分成20份進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其濃度，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差的2倍之和，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出本發(fā)明的最低檢測(cè)線為 17pg/ml。(3)精密度a 每10 μ 1微球的精密度評(píng)價(jià)微球儲(chǔ)存液中速振蕩混勻后，使用微量移液器連續(xù)20次吸取微球，每次10 μ 1，計(jì)數(shù)，計(jì)算其平均值和方差，計(jì)算精密度CV為0. 7%，即若每次混勻后，準(zhǔn)確取樣，則每10 μ 1儲(chǔ)存液中微球數(shù)為49940士352個(gè)。b 本發(fā)明試劑盒精密度評(píng)價(jià)測(cè)定GFAP濃度為0. 78ng/ml、3. 12ng/ml、12. 5ng/ml 的質(zhì)控血清，重復(fù)檢測(cè)3次，每次重復(fù)10孔，進(jìn)行批內(nèi)精密度測(cè)定。結(jié)果見表1。3份樣本每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定20天，進(jìn)行批間精密度測(cè)定。結(jié)果見表2.表1批內(nèi)精密度測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，由96孔過濾板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球、微球儲(chǔ)存液、酶結(jié)合物、底物A、底物B、20X洗滌液組成，其特征在于所述96孔過濾板是底部有滲透性的濾膜并能通過抽真空進(jìn)行洗滌的一種微孔板；所述標(biāo)準(zhǔn)品為濃度為lOOng/ml的GFAP蛋白凍干粉； 所述樣品稀釋液為每升含IOg牛血清白蛋白、Iml Proclin 300,0. 3ml Tween 20的0. OlM pH7. 4PBS ；所述微球儲(chǔ)存液為每升含 0. 1% BSA.0. 02% Tween,0. 1% Proclin 300 的 0. OlM pH7. 4PBS ；所述酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的GFAP 二抗；所述底物A為3mmol/L魯米諾與lmmol/L對(duì)碘苯酚的混合液；所述底物液B為3mmol/L的雙氧化脲溶液；所述20 X洗滌液為每升含160g氯化鈉、72. 64g十二水合磷酸氫二鈉、4g磷酸二氫鉀、氯4. 8g化鉀、IOml Tween 20的水溶液。
2.如權(quán)利要求1所述聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，其特征在于所述表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球上的抗-GFAP抗體為單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求1所述聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，其特征在于所述辣根過氧化酶標(biāo)記的GFAP 二抗為多克隆抗體。
4.如權(quán)利要求1所述聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由1塊96孔過濾板、2瓶標(biāo)準(zhǔn)品、1瓶樣品稀釋液、表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球、1瓶微球儲(chǔ)存液、1瓶酶結(jié)合物、1瓶底物A 1瓶、底物B 1瓶、20X洗滌液、20片不干膠封片和1份使用說明書構(gòu)成。
5.權(quán)利要求1所述聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒的應(yīng)用，步驟是(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋每瓶標(biāo)準(zhǔn)品臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，靜置IOmin后，反復(fù)顛倒混勻，濃度為 100ng/ml，做系列稀釋，分別為:100ng/ml、50ng/ml、12. 5ng/ml、3. 12ng/ ml、0. 78ng/ml、0. 05ng/ml，樣品稀釋液作為 Ong/ml ；(2)加樣微球使用前中速振蕩混勻，每孔加入10μ1微球儲(chǔ)存液，其中含50000士400 個(gè)表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球，用100 μ 1洗滌液真空抽濾洗滌2-3次后， 每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測(cè)樣本50 μ 1，另設(shè)一空為空白，混勻，37°C振蕩30min ；(3)洗板使用真空泵抽濾，洗滌液洗滌3-4次；(4)加酶結(jié)合物加入50μ 1酶結(jié)合物，混勻，37°C振蕩30min ；(5)洗板同(3)洗滌3-4次；(6)加底物每孔先后加入底物液A、底物液B各50μ 1，避光顯色I(xiàn)Omin ；(7)測(cè)定避光顯色I(xiàn)Omin后在化學(xué)發(fā)光儀上讀出各孔相對(duì)發(fā)光度；(8)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的相對(duì)發(fā)光度由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的相對(duì)發(fā)光度代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚苯乙烯微球定量檢測(cè)人血清中GFAP濃度的試劑盒，由96孔過濾板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、表面已偶聯(lián)有抗-GFAP抗體的聚苯乙烯微球、微球儲(chǔ)存液、酶結(jié)合物、底物A、底物B、20×洗滌液、不干膠封片和使用說明書組成。本發(fā)明中的試劑盒將固相載體由傳統(tǒng)的微孔板改為聚苯乙烯微球，抗原抗體的反應(yīng)發(fā)生在液相中，不僅有利于二者保持生物活性和正確的空間構(gòu)象，還可消除傳統(tǒng)反應(yīng)模式的表面張力和空間障礙對(duì)抗原抗體反應(yīng)的影響，以上兩點(diǎn)均有利于二者之間的反應(yīng)，可以有效縮短反應(yīng)時(shí)間與洗滌次數(shù)，同時(shí)本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、成本低的特點(diǎn)，對(duì)急性腦出血早期病情程度的診斷具有重要的臨床意義。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102411056SQ201110306638
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者丁興龍, 張?jiān)鳆? 朱之煒, 李夫東, 江長(zhǎng)林, 王佳穎, 王恒, 鄭祖惠, 韓娟 申請(qǐng)人:山東萊博生物科技有限公司