專利名稱：雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測雌激素類獸藥的器具，特別是涉及一種雌二醇、雌三醇和己 烯雌酚三聯(lián)檢測卡及其檢測樣品的處理方法，屬于雌激素類獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人類對動物內(nèi)分泌干擾物所造成的環(huán)境污染和危害的普遍認(rèn)知和系統(tǒng)研究還不 到十年的歷史，但越來越多的研究表明，具有內(nèi)分泌干擾性的污染物不斷富集所造成的污 染正通過各種途徑給人類和野生動物帶來危害，且其已在世界范圍內(nèi)的自然水體，城市污 水處理系統(tǒng)及供水系統(tǒng)中被廣泛檢出。其中尤以雌性激素污染更為嚴(yán)重，目前應(yīng)用最廣的主要有天然激素中的雌二醇、 雌三醇及人工合成的己烯雌酚。雌二醇是天然雌激素的主要成分，因其可以促進(jìn)動物生長和提高畜禽瘦肉比，而 在畜牧業(yè)中有應(yīng)用。它可在動物體內(nèi)殘留，通過食物鏈危害人體健康，使女性兒童提前發(fā) 育，男性兒童乳腺組織發(fā)育女性化，男性生殖系統(tǒng)異常化，引起病變，并導(dǎo)致女性乳腺癌和 子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生率上升，且存在明顯致癌性，歐美等發(fā)達(dá)國家相繼禁止使用雌二醇作 為飼料添加劑。雌三醇是廣泛存在于人和動物體內(nèi)的一種類固醇激素，在檢測食品特別是動物食 品中這種激素的含量，保障食品衛(wèi)生與人類健康方面有重要的意義和作用。己烯雌酚是第一個(gè)口服有活性的人工合成雌激素。但由于其具有促進(jìn)動物生長， 增加蛋白質(zhì)沉積和提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用，也被作為促生長劑，廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。己 烯雌酚殘留會使正常人的生理功能發(fā)生紊亂，更嚴(yán)重的是影響兒童正常的生長發(fā)育。近期 研究發(fā)現(xiàn)，己烯雌酚能引發(fā)動物和人的癌癥和致畸毒性，且妊娠期間使用還會引起后代生 殖系統(tǒng)疾病。因此，世界許多國家禁止在飼料中使用己烯雌酚來促進(jìn)動物生長。這三類激素大都可以促進(jìn)少女早熟，因此，對食品中尤其是對畜禽產(chǎn)品進(jìn)行這幾 類雌激素檢測是很有必要的。目前，現(xiàn)有技術(shù)對于這三類雌激素類飼料添加劑的檢測主要依賴化學(xué)儀器分析、 放射免疫檢測試劑盒及酶免疫檢測試劑盒，這些方法操作過程繁瑣、時(shí)間長，操作人員須具 有一定的專業(yè)技術(shù)知識才能操作，因此應(yīng)用范圍受限。也有單獨(dú)檢測雌二醇、雌三醇及己烯 雌酚的檢測試紙條，但到目前為止，沒有同時(shí)檢測這三種物質(zhì)的檢測器具。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于提供一種操作簡便快捷、成本低、攜帶方便、非專業(yè)人員也 能操作及可進(jìn)行現(xiàn)場檢測的膠體金試紙，且能同時(shí)檢測三類雌性激素，克服現(xiàn)有技術(shù)操作 繁瑣、專業(yè)要求高及只能逐一單項(xiàng)檢測的缺陷。本實(shí)用新型的技術(shù)方案一種雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡它在長條 扁平薄殼狀的檢測卡外殼1中設(shè)置測試條2，檢測卡外殼表面有檢測窗孔3和加樣孔4，測試條2是由支承背板5上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊8、含抗雌二醇抗體膠體金標(biāo)記 物的玻璃纖維膜11、含抗雌三醇抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜10、含抗己烯雌酚抗體膠 體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜7、硝酸纖維素膜6和吸水膜9所組成；支承背板中部疊置粘貼硝 酸纖維素膜6，支承背板一端疊置粘貼吸水膜9，另一端疊置粘貼樣品墊8，吸水膜內(nèi)端與樣 品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在樣品墊與硝酸纖維素膜的搭接部，兩者之間夾 置粘貼粘貼三段膠體金膜11、10、7 ；膠體金膜11、10、7依次是含抗雌二醇抗體膠體金標(biāo)記 物的玻璃纖維膜、抗雌三醇抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜、及抗己烯雌酚抗體膠體金標(biāo) 記物的玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜上有三條檢測帶和一條質(zhì)控帶，依次是含雌二醇蛋白質(zhì) 偶聯(lián)物檢測帶12，含雌三醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測帶13，含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測帶14， 質(zhì)控帶15，質(zhì)控帶為抗兔抗體或抗鼠抗體，測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣孔， 硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。所述的雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡檢測樣品的處理方法，檢測樣品為 尿液樣品、飼料樣品或動物組織、肉、肝臟樣品，對于各種不同的檢測樣品有不同的處理方 法；尿液樣品的處理方法尿液直接用作檢測樣品，渾濁狀態(tài)的尿液用濾紙過濾，取清 亮上清液作測試樣品樣品，澄清的尿液直接作測試樣品；測試樣品滴入加樣孔后用于檢測。飼料樣品的處理方法稱取0. 5克飼料樣品，加入ImL樣品抽提液，在試管中攪拌 1分鐘，靜置10分鐘后，取清亮上清液作測試樣品滴入加樣孔后用于檢測。動物組織、肉、肝臟樣品的處理方法取Ig剪碎或勻漿過的動物組織、肉、肝臟樣 品，加入含ImL樣品抽提液的試管中，扭緊管蓋，振搖樣品1分鐘后，經(jīng)100°C水浴加熱5分 鐘，冷卻至室溫，取清亮的中間部分作測試樣品滴入加樣孔后用于檢測。所述樣品抽提液為pH 7. 0、濃度50mmol/L Tris-HCL緩沖液。本實(shí)用新型的有益效果本發(fā)明的三聯(lián)檢測卡能同時(shí)檢測出尿液或飼料、動物組 織、肉、肝臟中含有的雌二醇、雌三醇及己烯雌酚，本三聯(lián)檢測卡易于制備且節(jié)省檢測費(fèi)用， 使用方便快速，結(jié)果準(zhǔn)確。

圖1雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡的外殼及測試條在外殼內(nèi)的安置圖。 1、檢測卡外殼，2、測試條，3、檢測窗孔，4、加樣孔。圖2雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡的測試條結(jié)構(gòu)示意圖。5、支承背板，6、 硝酸纖維素膜，7、含抗己烯雌酚抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜，8、樣品墊，9、吸水膜，10、含 抗雌三醇抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜，11、含抗雌二醇抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜。圖3雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡的硝酸纖維素膜上顯示印跡示意圖。 6、硝酸纖維素膜，12、含雌二醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測帶，13、含雌三醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測帶， 14、含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測帶，15、質(zhì)控帶。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型結(jié)合具體實(shí)施例參見附圖進(jìn)一步說明如下。實(shí)施例1[0022]一種雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡，它是在檢測卡外殼1中設(shè)置測試條 2，檢測卡外殼1的結(jié)構(gòu)及測試條2的設(shè)置參見附圖1、圖2。檢測卡外殼1為長條扁平薄殼 狀外殼，長7cm，寬2cm，厚0. 5cm,薄殼壁厚0. Icm,由工程塑料制成。檢測卡外殼1由殼蓋 與殼座兩半聯(lián)接構(gòu)成，在檢測卡外殼1殼蓋上有檢測窗孔3和加樣孔4。測試條2放置在檢 測卡外殼1的殼座內(nèi)。測試條2是多層結(jié)構(gòu)的窄條薄片，片長約6. 0cm，片寬約0. km，厚度小于2. 5mm。 測試條2是多層結(jié)構(gòu)底層是支承背板5，為聚氯乙烯塑料薄片，厚約0. 5mm,長6. Ocm,寬 0. 4cm ；支承背板5中部疊置粘貼硝酸纖維素膜6，硝酸纖維素膜厚0. 5mm，長2_2. 5cm,寬 0. 4cm0硝酸纖維素膜6上有四條間隔開的橫向顯示印跡帶，參見附圖3，四條顯示印跡中， 第一條是檢測帶12，含雌二醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，第二條檢測帶13，含雌三醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，第 三條是檢測帶14，含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，第四條是質(zhì)控帶15，含抗兔抗體或抗鼠抗體。 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)偶聯(lián)物濃度大約為lmg/ml，抗兔抗體或抗鼠抗體濃度大約為0. lmg/ml時(shí)噴膜。 支承背板5 —端上疊置粘貼吸水膜9，支承背板5另一端上疊置粘貼樣品墊8，吸水膜9內(nèi) 端與樣品墊8內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜6 —端搭接，在樣品墊8與硝酸纖維素膜6的 搭接部，兩者之間夾置粘貼三段膠體金膜11、10、7，膠體金膜11、10、7依次是含抗雌二醇抗 體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜、抗雌三醇抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜、及抗己烯雌酚 抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜。膠體金膜厚0. 5-0. 8mm,長0. 5-0. 6cm,寬0. 4cm0樣品墊 8 厚 0. 5-0. 8mm,長 2cm，寬 0. 4cm。吸水膜 9 厚 0. 5-0. 8mm,長 1. 6_2cm，寬 0. 4cm。膠體金膜 是將抗體與膠體金顆粒標(biāo)記后，調(diào)節(jié)濃度大約為ID涂布膠體玻璃纖維膜，烘干后備用。膠 體金膜11、107、樣品墊8及吸水膜9與硝酸纖維素膜6搭接長度為0. 1-0. 2cm。吸水膜9 材料是吸水紙，樣品墊8材料是吸水玻璃纖維膜。本實(shí)用新型雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡用于檢測畜牧飼料或動物尿樣 或動物組織、肉、肝臟中是否含有雌二醇、雌三醇及己烯雌酚，據(jù)此鑒別畜牧食品的安全性。實(shí)施例2檢測樣品的處理方法針對尿液樣品的處理方法是尿液直接用作檢測樣品，若尿樣呈渾濁狀，需先經(jīng)濾 紙濾過，取上清液作測試樣品；若尿液澄清，則直接作測試樣品。針對飼料樣品的處理方法是稱取0. 5克飼料樣品，加入ImL樣品抽提液(pH 7. 0、50mmol/L的Tris-HCL)，在試管中攪拌1分鐘，靜置10分鐘后，取清亮上清液作測試樣品。針對動物組織、肉、肝臟樣品的處理方法是取1克剪碎或勻漿過的動物組織、肉、 肝臟樣品，置于含ImL樣品抽提液(pH 7. 0、50mmol/L的Tris-HCL)的試管中，扭緊管蓋，振 搖樣品一分鐘后，經(jīng)100°C水浴5分鐘，冷卻至室溫，取清亮的中間清液作測試樣品。使用雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡進(jìn)行檢測時(shí)，先將待檢測的樣品液從 加樣孔4中滴注入雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡的樣品墊8，由于虹吸作用原理， 帶動待檢測的樣品液及膠體金膜所含的抗雌二醇、抗雌三醇和抗己烯雌酚單克隆抗體或多 克隆抗體膠體金標(biāo)記物一起向硝酸纖維素膜6擴(kuò)散，5-10分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。檢測卡的主要反應(yīng)是免疫學(xué)的抗原和抗體反應(yīng)，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金 標(biāo)記的抗體，在測試帶上分別與含雌二醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、含雌三醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，以及質(zhì)控帶抗兔抗體或抗鼠抗體反應(yīng)，形成棕紅色條帶。當(dāng)樣品中有相應(yīng) 的待檢雌二醇、雌三醇及己烯雌酚存在，則樣品加入后即與相應(yīng)的抗體發(fā)生反應(yīng)，而不會與 相應(yīng)的檢測帶所含的雌二醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、含雌三醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶 聯(lián)物反應(yīng)，從而不顯色。主要反應(yīng)的結(jié)果有以下9種情況1、所述檢測帶12、13、14和質(zhì)控帶15同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡帶，表示檢測結(jié)果為陰 性，說明被檢測樣品中雌二醇、雌三醇和己烯雌酚含量均沒有超過允許值。2、所述檢測帶12、13、14不顯示顏色，只有質(zhì)控帶15顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢測結(jié)果為 陽性，表明被檢測樣品中雌二醇、雌三醇和己烯雌酚含量均超過允許值。3、所述檢測帶12、13不顯示顏色，檢測帶14和質(zhì)控帶15同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢 測結(jié)果為陽性，表明被檢測樣品中雌二醇和雌三醇含量均超過允許值，而己烯雌酚含量沒 有超過允許值。4、所述檢測帶12、14不顯示顏色，檢測帶13和質(zhì)控帶15同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢 測結(jié)果為陽性，表明被檢測樣品中雌二醇和己烯雌酚含量均超過允許值，而雌三醇含量沒 有超過允許值。5、所述檢測帶13、14不顯示顏色，檢測帶12和質(zhì)控帶15同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢 測結(jié)果為陽性，表明被檢測樣品中雌三醇和己烯雌酚含量均超過允許值，而雌二醇含量沒 有超過允許值。6、所述檢測帶12不顯示顏色，檢測帶13、14和質(zhì)控帶15同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢 測結(jié)果為陽性，表明被檢測樣品中雌二醇含量超過允許值，而雌三醇、己烯雌酚含量均沒有 超過允許值。7、所述檢測帶13不顯示顏色，檢測帶12、14和質(zhì)控帶15同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢 測結(jié)果為陽性，表明被檢測樣品中雌三醇含量超過允許值，而雌二醇、己烯雌酚含量均沒有 超過允許值。8、所述檢測帶14不顯示顏色，檢測帶12、13和質(zhì)控帶15同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢 測結(jié)果為陽性，表明被檢測樣品中己烯雌酚含量超過允許值，而雌二醇、雌三醇含量均沒有 超過允許值。9、所述檢測帶12、13、14和質(zhì)控帶15均不顯色，則表明測試條失效。
權(quán)利要求1. 一種雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡，其特征在于它在長條扁平薄殼狀的 檢測卡外殼(1)中設(shè)置測試條(2)，檢測卡外殼表面有檢測窗孔(3)和加樣孔(4)，測試條 (2)是由支承背板(5)上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊(8)、含抗雌二醇抗體膠體金標(biāo) 記物的玻璃纖維膜(11)、含抗雌三醇抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜(10)、含抗己烯雌酚 抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜(7)、硝酸纖維素膜(6)、和吸水膜(9)所組成；支承背板中 部疊置粘貼硝酸纖維素膜(6)，支承背板一端疊置粘貼吸水膜(9)，另一端疊置粘貼樣品墊 (8)，吸水膜內(nèi)端與樣品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在樣品墊與硝酸纖維素膜的 搭接部，兩者之間夾置粘貼抗雌二醇抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜(11)、抗雌三醇抗體 膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜(10)、及抗己烯雌酚抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜(7)，硝 酸纖維素膜上有三條檢測帶和一條質(zhì)控帶，依次是含雌二醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測帶(12)， 含雌三醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測帶(13)，含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測帶(14)，質(zhì)控帶(15)， 質(zhì)控帶為抗兔抗體或抗鼠抗體，測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素 膜正對檢測窗孔。
專利摘要一種雌二醇、雌三醇和己烯雌酚三聯(lián)檢測卡，屬于雌激素類獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域。本實(shí)用新型三聯(lián)檢測卡外殼內(nèi)有測試條，由支承背板上依次粘貼樣品墊、膠體金膜、硝酸纖維素膜和吸水膜所組成；膠體金膜為含抗雌二醇抗體、抗雌三醇抗體、及抗己烯雌酚抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜上有3條檢測帶，分別含雌二醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、雌三醇蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，另有1條含抗兔抗體或抗鼠抗體的質(zhì)控帶。本實(shí)用新型優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)檢測出尿液或飼料、動物組織、肉、肝臟中含有的雌二醇、雌三醇及己烯雌酚。檢測卡易于制備且節(jié)省檢測費(fèi)用，使用方便快速，結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號G01N33/558GK201876459SQ20102061294
公開日2011年6月22日 申請日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者吳文曄, 周堅(jiān), 熊曉芳 申請人:無錫安迪生物工程有限公司