專利名稱：一種檢測唾液中hiv抗體的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測唾液中人類免疫缺陷病毒(HIV)抗 體的試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，是一種感染人類免疫 系統(tǒng)細(xì)胞的病毒，該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失去抵抗力，而導(dǎo)致各種疾病 及癌癥得以在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合征)。艾滋病是 一種至今無有效療法的致命性傳染病。艾滋病感染者的治療費用昂貴，美國第一批艾滋病病人醫(yī)療費用為15億美元；我 國專家估算每個艾滋病病人直接間接耗費達(dá)15萬元左右，預(yù)計09年我國艾滋病病人耗費 達(dá)154億元；其次針對艾滋病的研究投入驚人，美國每年投入艾滋病防治、科研的經(jīng)費達(dá)數(shù) 10億美元，中國自2008年啟動艾滋病等重大傳染病專項，已投入約100億。艾滋病感染會 極大影響人口素質(zhì)的提高，目前HIV感染者均為在18-45歲階段，作為社會財富創(chuàng)造者，他 們的死亡對社會經(jīng)濟(jì)說是無法彌補(bǔ)的，艾滋病病人及其家屬的就業(yè)、上學(xué)、醫(yī)療、婚姻、生育 問題，都對社會造成了沉重的負(fù)擔(dān)。近年來母嬰垂直傳播的比率逐年增長，對于不斷強(qiáng)化的 人口素質(zhì)問題是很大的影響。針對目前艾滋病感染既沒有有效的疫苗預(yù)防，又無特效藥物 治療，早期診斷HIV感染是預(yù)防、控制HIV擴(kuò)散的有效手段。目前，檢測HIV主要是血液HIV抗體免疫學(xué)檢測(如酶聯(lián)法、印跡法、膠體金法、熒 光法等)及血液核酸檢測。①傳統(tǒng)免疫學(xué)方法包括初篩試驗和確認(rèn)試驗。前者最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試 驗(ELISA)、斑點免疫滲濾/層析試驗等，具有較高的靈敏性和實用性；后者最常用的是免 疫印跡試驗(Western Blot, WB)，具有較高的特異性。20世紀(jì)80年代以后，ELISA技術(shù)廣 泛應(yīng)用于微生物、病毒等的檢測中。②新免疫學(xué)檢測技術(shù)(1)免疫復(fù)合物裂解檢測法(ICD)，敏感性僅為90%，不宜 單獨使用，但在不具備先進(jìn)儀器的地方有較大應(yīng)用價值。(2)超敏感酶免疫測定法(UEI)， 即雙位點免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移酶免疫測定，對試劑要求高，需要一定儀器，操作復(fù)雜。(3)免疫吸 附電鏡法(ISEM)，實現(xiàn)了對病毒顆粒的直接特異性檢測，靈敏度高，但需昂貴精密儀器，操 作復(fù)雜。(4)線性免疫酶測定(LIA)和CobasCore HIV,Combi EIA是新近發(fā)展起來的第四 代HIV檢測技術(shù)。③分子生物學(xué)方法RT-PCR檢測法、實時熒光PCR檢測技術(shù)、支鏈DNA、連接酶酶促 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸序列依賴性擴(kuò)增以及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增等。PCR的過高靈敏度，操作時容易導(dǎo) 致污染，假陽性率較高，PCR檢測系統(tǒng)將PCR擴(kuò)增反應(yīng)和檢測限制在單個反應(yīng)管中進(jìn)行。實 時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號實時監(jiān)整個PCR進(jìn) 程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。但這種新的檢測方法依靠手工加樣，耗費 人力，也存在造成變異的潛在危險。
④基因芯片技術(shù)利用基因芯片對HIV的蛋白酶基因的多態(tài)性進(jìn)行分析?；蛐?片技術(shù)縮短檢測窗口期，加強(qiáng)獻(xiàn)血者血液的安全，但耗費高。中國專利CN20133127Y公開了一種檢測HIV抗體的試劑盒，其是利用膠體金標(biāo)記 HIV抗原，利用硝酸纖維素NC膜包被HIV抗原的抗原，根據(jù)NC膜C、T線的出現(xiàn)情況，來判 定檢測結(jié)果。然而，該專利公開的試劑盒雖然操作簡便，結(jié)果易得，但其仍然是利用血液來 檢測HIV抗體的，使用的是一般的捕獲方法，難以實現(xiàn)信號的級聯(lián)放大。上述檢測方法基本均采用血液檢測，需采集患者血清或血漿樣本，都存在入侵性 或不準(zhǔn)確，對患者及操作者均有再次感染的風(fēng)險，且采血過程屬于“有創(chuàng)”過程，不利于HIV 檢測在家庭、在基層及更廣泛人群中推廣使用。近年關(guān)于艾滋病的研究表明，HIV感染者的口腔液體含有HIV抗體，其通過口腔粘 膜毛細(xì)血管滲透到口腔。唾液檢測與血液檢測一樣，遵循同樣的篩查和確診步驟，在采血不 實用或不安全的情況下，口腔檢測有非侵入性采集樣本的優(yōu)點。專利申請?zhí)枮镃N101368954A所公開的利用唾液檢測HIV的試劑，采用的是滲濾 法，配件多，包括長條形的檢測盒，圓柱狀的集液濾器、柱塞、采樣杯、刻度吸管、酸酸緩沖液 試劑以及抗人IgG膠體金復(fù)合物試劑，操作比膠體金法復(fù)雜，不利于一般家庭和個人的自 檢和推廣。專利申請?zhí)枮镃N101539575A公開了一種檢測唾液HIV抗體的方法，其是采取雙抗 原夾心原理，首先用純化的重組HIV-1/2抗原在纖維膜上捕獲唾液里的抗原，然后在T線用 抗人IgG抗體捕獲。但是唾液里抗體含量比血液含量少很多，用一般的捕獲方法難以實現(xiàn) 信號的級聯(lián)放大，從而會影響靈敏度。如上所述，利用唾液檢測HIV抗體的方法具有安全無痛、且快速簡便的優(yōu) 點，然而，與此同時，研究發(fā)現(xiàn)唾液中HIV抗體濃度極低，約為血液的HIV抗體濃度的 1/100-1/1000，且水分多、含有降解HIV抗體蛋白的蛋白酶等物質(zhì)，成分復(fù)雜，極易導(dǎo)致假 陽。因此采用唾液檢測HIV抗體，需要解決的問題即是HIV抗體濃度低，導(dǎo)致檢測結(jié)果不明 顯，檢測難度大的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的唾液HIV抗體濃度低、檢測結(jié)果不明顯 的缺陷，而提供一種新的檢測唾液中人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體的試紙條。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案一種檢測唾液中HIV抗體的試紙條，包括樣品墊、與所述樣品墊一端緊密相連的 含有膠體金顆粒標(biāo)記物的玻璃纖維膜、與所述玻璃纖維膜另一端緊密相連的硝酸纖維素 膜、以及與所述纖維素膜的另一端緊密相連的吸水紙，所述樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維 素膜和吸水紙均設(shè)置于底板上，所述硝酸纖維素膜包括包被有HIV重組抗原的檢測區(qū)和包 被有羊抗兔抗體的控制區(qū)，所述膠體金顆粒標(biāo)記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標(biāo)記兔 IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒_親和素_生物素_抗人IgG抗體復(fù)合物。優(yōu)選地，所述膠體金顆粒_親和素_生物素_抗人IgG抗體復(fù)合物的用量為 0. 65-0. 9 μ g/cm2 ；所述膠體金標(biāo)記兔IgG抗體的用量為0. 25-0. 45 μ g/cm2 ；所述HIV重組 抗原為 gp41 (3. 00mg/ml)和 gp36 (3. 5mg/ml)，混合的包被濃度為 0. 8mg/ml-l. 5mg/ml，所述HIV重組抗原的用量為0. 054-0. 08μ g/mm ；所述羊抗兔抗體為羊抗兔IgG抗體，所述羊抗兔 抗體的濃度為4mg/ml，所述羊抗兔抗體的用量為0. 09-0. 22 μ g/mm。本發(fā)明還提供了一種檢測唾液中HIV抗體的試劑卡，包括上述試劑條。本發(fā)明還提供了上述試紙條的制備方法，包括以下步驟(1)按常規(guī)方法制備鼠抗人IgG抗體、HIV重組抗原gp41和gp36、以及膠體金標(biāo) 記兔IgG抗體；(2)制備微信號放大系統(tǒng)a、制備膠體金標(biāo)記親和素將待標(biāo)記親和素預(yù)先在0. 005mol/L pH7. 0的NaCl溶液中4°C透析過夜，然后4°C 100 OOOg離心Ih,以0. lmol/L K2CO3或0. lmol/L HCl調(diào)節(jié)膠體金液的pH值至9 10，標(biāo) 記親和素以形成膠體金標(biāo)記親和素；b、按常規(guī)方法制備生物素化抗人IgG抗體c、完成微信號放大系統(tǒng)將步驟a得到的膠體金標(biāo)記親和素和步驟b得到的生物素化抗人IgG抗體連接， 得到膠體金_親和素_生物素_抗人IgG抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌處理后，即得微信號放大系 統(tǒng)；(3)按稀釋參數(shù)25cm2/ml 35cm2/ml，將步驟⑵的膠體金_親和素_生物素_抗 人IgG抗體復(fù)合物、以及步驟(1)的膠體金標(biāo)記兔IgG抗體噴灑到玻璃纖維膜上，干燥12 個小時以上，備用；(4)用包被緩沖液稀釋HIV重組抗原，使其濃度為0. 8mg/ml 1. 5mg/ml，按膜液 量0. 16 μ 1/mm 0. 2 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個小時以上，備 用；用包被緩沖液稀釋羊抗兔抗體，使其濃度為1. Omg/ml 2. Omg/ml，按膜液量0. 18 μ 1/ mm 0. 22 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個小時以上，備用；(5)將樣品墊、步驟(3)的玻璃纖維膜、步驟(4)的硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼 于底板上，即得。為了解決信號擴(kuò)大不足和操作復(fù)雜的問題，本發(fā)明基于固相免疫層析原理，采用 功能性彩色微球技術(shù)(采用膠體金顆粒標(biāo)記)及微信號放大技術(shù)(親和素_生物素體系) 檢測唾液中的HIV抗體。若唾液樣品中含有HIV抗體，經(jīng)玻璃纖維膜上的微信號放大系統(tǒng) 將信號放大，使HIV抗體與膠體金顆粒標(biāo)記物結(jié)合，形成復(fù)合物，并擴(kuò)散到硝酸纖維素膜上 進(jìn)一步層析，當(dāng)遇到包被在硝酸纖維素膜上檢測區(qū)(T線)處的配對抗原時，復(fù)合物則又和 包被抗原結(jié)合，被捕獲在包被處，當(dāng)被捕獲的復(fù)合物達(dá)到一定數(shù)量時，則形成肉眼可見的T 線，說明樣品中含有HIV抗體，若不出現(xiàn)，說明樣品為陰性或含量低于試紙條的最低檢測 限?？刂茀^(qū)(C線)作為試紙條的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明在現(xiàn)有檢測試紙條的基礎(chǔ)上，采用了生物素_親和素微信號放大系統(tǒng)， 因而，在檢測唾液中HIV抗體的過程中，擴(kuò)大了目標(biāo)抗體的信號，增加檢測靈敏度，避免因 信號太弱而出現(xiàn)假陰或者漏檢；(2)本發(fā)明的試紙條具有操作安全(無放射物污染)、簡便(簡單操作一步完成)、 適合單人/份檢測(放免、酶免不適合單人/份或少量樣品檢測)和快速(15分鐘左右即可有結(jié)果)等優(yōu)點，可實現(xiàn)對HIV抗體現(xiàn)場和家庭自檢；(3)本發(fā)明的試紙條可以在牙齦處取樣，成分多為口腔粘膜毛細(xì)血管滲透物，來源 更加直接，水分和雜質(zhì)較少，干擾物少，HIV抗體的含量比重增加。


圖1為本發(fā)明的檢測唾液中HIV抗體的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為利用本發(fā)明試紙條檢測HIV抗體的陽性結(jié)果示意圖；圖3為利用本發(fā)明試紙條檢測HIV抗體的陰性結(jié)果示意圖；圖4為本發(fā)明實施例1的使用方法示意圖；圖5為本發(fā)明實施例1的測試結(jié)果示意圖；圖6為本發(fā)明實施例2的取樣示意圖；圖7為本發(fā)明實施例2的滴樣示意圖；附圖標(biāo)記1.樣品墊；2.玻璃纖維膜；3.硝酸纖維素膜；4.吸水紙；5.檢測區(qū)； 6.控制區(qū)；7.底板。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。實施例1本發(fā)明檢測唾液中HIV抗體的試紙條如圖1所示，為本發(fā)明所述的一種檢測唾液中HIV抗體的試紙條。包括樣品墊1、 與所述樣品墊1 一端緊密相連的含有膠體金顆粒標(biāo)記物的玻璃纖維膜2、與所述玻璃纖維 膜2另一端緊密相連的硝酸纖維素膜3、以及與所述纖維素膜3的另一端緊密相連的吸水 紙4，所述樣品墊1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3和吸水紙4均粘貼于底板7上，所述樣品 墊1為玻璃纖維膜，所述硝酸纖維素膜3包括包被有HIV重組抗原gp41和gp36的檢測區(qū) 5和包被有羊抗兔IgG抗體的控制區(qū)6，所述玻璃纖維膜2上的膠體金顆粒標(biāo)記物包括微信 號放大系統(tǒng)和膠體金顆粒_兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒_生物素_親 和素-抗人IgG抗體復(fù)合物。本發(fā)明的試劑條，所述膠體金顆粒_親和素_生物素_抗人IgG抗體復(fù)合物在玻 璃纖維膜2上的用量為0. 7μ g/cm2 ；膠體金標(biāo)記兔IgG抗體在玻璃纖維膜2上的用量為 0. 35 μ g/cm2 ；HIV重組抗原為gp41 (原始濃度為3. 00mg/ml)和gp36 (原始濃度為3. 5mg/ ml)，包被到硝酸纖維膜3的檢測區(qū)5時的濃度為1. 2mg/ml，包被用量為0. 07 μ g/mm ；羊抗 兔IgG抗體的濃度為4mg/ml，羊抗兔IgG抗體包被在控制區(qū)時的用量為0. 15 μ g/mm。實施例2本發(fā)明試紙條的制備方法在本發(fā)明中采用膠體金顆粒標(biāo)記。其中膠體金顆粒的顆粒直徑大小為納米級 (30 50nm)，膠體顆粒的吸附機(jī)理是利用它在堿性條件下帶負(fù)電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子 的正電荷集團(tuán)，靠靜電吸引而結(jié)合形成免疫診斷試劑。檢測唾液中人類免疫缺陷病毒(HIV) 抗體的試紙條的制備步驟如下1.制備抗人IgG抗體利用常規(guī)方法從人細(xì)胞質(zhì)中分離IgG，利用人IgG免疫小鼠，人IgG免疫的小鼠與 骨髓瘤細(xì)胞融合后，用ELISA方法鑒別，鑒別出來的雜交瘤在腹水中培養(yǎng)，篩選陽性克隆，分離純化鼠抗人IgG抗體。ELISA鑒定抗人IgG抗體的活性和效價，純化備用。2、制備重組抗原gp41和gp36確定HIV目的基因后，利用常規(guī)方法構(gòu)建目標(biāo)蛋白表達(dá)載體，經(jīng)過表達(dá)、篩選、鑒 定、純化后保存待用。gp41的原始濃度為3. 00mg/ml, gp36的原始濃度為3. 5mg/ml。3、制備微信號放大系統(tǒng)a、制備膠體金標(biāo)記親和素將待標(biāo)記親和素預(yù)先在0. 005mol/L pH7. O的NaCl 溶液中4°C透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后4°C 100 OOOg離心lh，去除聚合物；以 0. lmol/L K2CO3或0. lmol/L HCl調(diào)節(jié)膠體金液的pH值至9 10，標(biāo)記親和素以形成膠體 金標(biāo)記親和素；b、制備生物素化抗人IgG抗體先用6-氨基己糖與生物素連接制得長臂生物 素，再使其與抗人IgG抗體結(jié)合，然后在碳二亞胺的作用下將其與N-羥基丁二酰胺進(jìn)行縮 和，生成長臂生物素 N-羥基丁二酰亞胺酯(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl ami do hexanoate, BCNHS)，即為生物素化抗人IgG抗體。通過透析除去游離生物素。C、完成微信號放大系統(tǒng)的將步驟a得到的膠體金標(biāo)記親和素和步驟b得到的生 物素化抗人IgG抗體直接混合，連接得到膠體金_親和素_生物素_抗人IgG抗體復(fù)合物， 經(jīng)過洗滌、離心處理后，即得微信號放大系統(tǒng)。4、膠體金標(biāo)記兔I gG抗體在pH6. 5 7.0范圍內(nèi)，兔IgG與膠體金顆粒蛋白(最低用量為8. 0 μ g/ml)標(biāo)記 形成膠體金標(biāo)記兔IgG抗體(蛋白探針)。5、將膠體金-親和素-生物素-抗人IgG抗體復(fù)合物、以及膠體金標(biāo)記兔IgG抗 體噴灑到玻璃纖維膜2上，稀釋參數(shù)(稀釋參數(shù)是每ml溶液噴灑多少面積的工藝參數(shù))為 25cm2/ml 35cm2/ml，并在溫度20 40°C，濕度10% -30%，將玻璃纖維膜2干燥12個小 時以上，備用。6、用包被緩沖液(主要成分是磷酸緩沖液、蔗糖)稀釋HIV重組抗原，使其濃度為 1.0mg/ml，按膜液量0. 18 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜3上，其中硝酸纖維素 膜3孔徑為5. 0 μ m 12. 0 μ m，置于20 40°C，濕度10% 30%條件下烘干處理12個小時 以上，備用；用包被緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體，使其濃度為1. 5mg/ml，按膜液量0. 20 μ 1/ mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜3上，置于20 40°C，濕度10% 30%條件下烘干 處理12個小時以上，封袋，備用；7、將樣品墊1、玻璃纖維膜2、硝酸纖維素膜3和吸水紙4依序粘貼于底板7上，即 得本發(fā)明所述的試紙條。本發(fā)明所述的檢測唾液中人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體的試紙條經(jīng)過包裝可以 直接使用，或者安裝到試劑盒里，配合小滴管，充當(dāng)試劑卡使用。實施例3利用實施例1中的試紙條檢測唾液中HIV抗體的方法本實施例利用實施例1的試紙條對唾液樣本中的HIV抗體進(jìn)行檢測。為了便于使 用，在玻璃纖維膜2上粘貼有指示箭頭和液面標(biāo)志(MAX標(biāo)志線)。包括以下步驟(1)采集唾液樣品后，加入 Iml 樣品處理液(0. 02MPBS+0. 05% Tween-20+l% BSA, PH7. 4士0. 2)處理即可用于測試。常溫下，樣本應(yīng)在采集后1小時內(nèi)進(jìn)行處理。如樣本處理后無法及時進(jìn)行檢測，應(yīng)將處理后的樣本置于2 8°C冷藏，且樣本應(yīng)在處理后12小時內(nèi)測 試完畢。(2)將試紙條按箭頭朝下的方向把樣品墊1插入經(jīng)處理的唾液樣本溶液中(液面 不應(yīng)超過MAX標(biāo)志線)(圖4)，20秒后取出平放；由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著試紙條向玻 璃纖維素膜2和硝酸纖維素膜3移動，待樣品完全通過玻璃纖維素膜2以及硝酸纖維素膜 3，結(jié)果開始顯示；(3) 15分鐘后觀察顯示結(jié)果(30分鐘后顯示的結(jié)果無效)，判讀并記錄檢測結(jié)果 (圖5)，若硝酸纖維素膜3的檢測區(qū)5出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線(T線)，即表明樣品中 含有大量HIV抗體，即說明受檢驗者的肌體已經(jīng)被病毒感染(陽性，請同時參考圖2)；若硝 酸纖維素膜3的檢測區(qū)5未出現(xiàn)一條肉眼可見的深色線，即表明樣品中未含有大量的HIV 抗體，說明受檢驗者未被病毒感染(陰性，請同時參考圖3)；當(dāng)樣品通過硝酸纖維素膜3的 檢測區(qū)5移動至控制區(qū)6時，無論樣品中有沒有HIV抗體，控制區(qū)6都會有一條深色線(C 線)；若控制區(qū)6無色線出現(xiàn)，說明試紙條已經(jīng)過期或操作有誤；(4)測試結(jié)束后，將使用后的試紙條、樣本提取管和口腔取樣器按生物醫(yī)療廢棄物 進(jìn)行處理。MM采用中國藥品生物制品檢定所HIV抗體參考品(唾液快速試劑)檢定HIV患者， 結(jié)果如表1。表1結(jié)果表明，使用實施例1的試劑條檢測唾液HIV抗體的靈敏度為100%， 特異性達(dá)到99. 9%以上。表 權(quán)利要求
一種檢測唾液中HIV抗體的試紙條，其特征在于，包括樣品墊(1)、與所述樣品墊(1)一端緊密相連的含有膠體金顆粒標(biāo)記物的玻璃纖維膜(2)、與所述玻璃纖維膜(2)另一端緊密相連的硝酸纖維素膜(3)、以及與所述纖維素膜(3)的另一端緊密相連的吸水紙(4)，所述樣品墊(1)、玻璃纖維膜(2)、硝酸纖維素膜(3)和吸水紙(4)均設(shè)置于底板(7)上，所述硝酸纖維素膜(3)包括包被有HIV重組抗原的檢測區(qū)(5)和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)(6)，所述膠體金顆粒標(biāo)記物包括微信號放大系統(tǒng)和膠體金標(biāo)記兔IgG抗體，所述微信號放大系統(tǒng)為膠體金顆粒 親和素 生物素 抗人IgG抗體復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測唾液中HIV抗體的試紙條，其特征在于，所述膠體金顆 粒_親和素_生物素_抗人IgG抗體復(fù)合物的用量為0. 65-0. 9 μ g/cm2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測唾液中HIV抗體的試紙條，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記 兔IgG抗體的用量為0. 25-0. 45 μ g/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測唾液中HIV抗體的試紙條，其特征在于，所述HIV重組抗 原為gp41和gp36，所述HIV重組抗原的用量為0. 054-0. 08 μ g/mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測唾液中HIV抗體的試紙條，其特征在于，所述羊抗 兔抗體為羊抗兔IgG抗體，所述羊抗兔抗體的濃度為4mg/ml，所述羊抗兔抗體的用量為 0. 09-0. 22 μ g/mmο
6.一種檢測唾液中HIV抗體的試劑卡，其特征在于，包括權(quán)利要求1-4任一項所述的試 紙條。
7.一種制備權(quán)利要求1所述的檢測唾液中HIV抗體的試紙條的方法，其特征在于，包括 以下步驟(1)按常規(guī)方法制備抗人IgG抗體、HIV重組抗原、以及膠體金標(biāo)記兔IgG抗體；(2)制備微信號放大系統(tǒng)a、制備膠體金標(biāo)記親和素將待標(biāo)記親和素預(yù)先在0. 001 0. 01mol/L的NaCl溶液中透析過夜，離心，調(diào)節(jié)膠體 金液的PH值至9 10，標(biāo)記親和素以形成膠體金標(biāo)記親和素；b、按常規(guī)方法制備生物素化抗人IgG抗體C、完成微信號放大系統(tǒng)將步驟a得到的膠體金標(biāo)記親和素和步驟b得到的生物素化抗人IgG抗體混合，連接 得到膠體金_親和素_生物素_抗人IgG抗體復(fù)合物，洗滌，即得微信號放大系統(tǒng)；(3)按稀釋參數(shù)20cm2/ml 40cm2/ml，將步驟(2)的膠體金-親和素-生物素-抗人 IgG抗體復(fù)合物、以及步驟(1)的膠體金標(biāo)記兔IgG抗體噴灑到玻璃纖維膜上，干燥12個小 時以上，備用；(4)用包被緩沖液稀釋HIV重組抗原，使其濃度為0.8mg/ml 1. 5mg/ml,按膜液量 0. 16 μ 1/mm 0. 2 μ 1/mm,將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個小時以上，備 用；用包被緩沖液稀釋羊抗兔抗體，使其濃度為1. Omg/ml 2. Omg/ml，按膜液量0. 18 μ 1/ mm 0. 22 μ 1/mm，將其細(xì)致均勻的噴到硝酸纖維素膜上，干燥12個小時以上，備用；(5)將樣品墊、步驟(3)的玻璃纖維膜、步驟(4)的硝酸纖維素膜、吸水紙按序粘貼于底 板上，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測唾液中HIV抗體的試紙條的方法，其特征在于，所述步驟(3)中膠體金-親和素-生物素-抗人IgG抗體復(fù)合物的用量為0. 65-0. 9 μ g/cm2,所述膠 體金標(biāo)記兔IgG抗體的用量為0. 25-0. 45 μ g/cm2。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測唾液中HIV抗體的試紙條的方法，其特征在于，所述步 驟(4)中HIV重組抗原的用量為0. 054-0. 08 μ g/mm ；所述羊抗兔抗體的濃度為4mg/ml，用 量為 0. 09-0. 22 μ g/mm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測唾液中HIV抗體的試劑條及其制備方法，試劑條包括樣品墊、與所述樣品墊一端緊密相連的含有膠體金顆粒標(biāo)記物的玻璃纖維膜、與所述玻璃纖維膜另一端緊密相連的硝酸纖維素膜、以及與所述纖維素膜的另一端緊密相連的吸水紙，所述樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙均設(shè)置于底板上，所述硝酸纖維素膜包括包被有HIV重組抗原的檢測區(qū)和包被有羊抗兔抗體的控制區(qū)，所述膠體金顆粒標(biāo)記物包括膠體金顆粒-親和素-生物素-抗人IgG抗體復(fù)合物微信號放大系統(tǒng)和膠體金標(biāo)記兔IgG抗體。本發(fā)明采用了生物素-親和素微信號放大系統(tǒng)，擴(kuò)大了目標(biāo)抗體的信號，增加檢測靈敏度，避免因信號太弱而出現(xiàn)假陰或者漏檢。
文檔編號G01N33/544GK101943699SQ201010270359
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)有限公司