專利名稱：：測定食品中鹽酸林可霉素含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種測定食品中鹽酸林可霉素(LIN)含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)，屬于食品安全監(jiān)督或食品分析的研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：鹽酸林可霉素(LIN)，俗稱潔霉素或林肯霉素，屬于林可胺類抗生素，是由美國人Mason等首先從鏈霉菌林可變種培養(yǎng)液中獲得的一種高效廣譜抗生素，對革蘭陽性球菌有較好作用。除了臨床主要用于敏感菌弓I起的各種感染外，其在動物飼養(yǎng)及動物疾病治療中也被廣泛使用，并能作為肉雞的生長促進(jìn)劑。雖然鹽酸林可霉素毒性不大，但對人畜仍具有潛在危害性，如會造成假膜性腸炎的發(fā)生及細(xì)菌耐藥性，其在動物組織中的殘留問題日漸受到重視。因此各國政府及相關(guān)組織都對鹽酸林可霉素作出限量要求，我國農(nóng)業(yè)部235號文件規(guī)定其在牛奶，肝臟中的殘留量分別為150g/L，500g/kg，美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定其在牛奶及豬，雞的可食用組織中的殘留限量為150i!g/L，100iig/kg。檢測鹽酸林可霉素的方法主要是高效液相色譜法(HPLC)，但是由于其在200-220nm處僅有較弱的紫外吸收，用紫外檢測器無法達(dá)到低含量檢測的要求。氣相色譜法(GC)往往需要衍生化，增加了操作的繁瑣性且靈敏度也不高。近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)用于鹽酸林可霉素的檢測，雖然靈敏度較高，但儀器昂貴，前處理復(fù)雜及需要專業(yè)人員操作等因素也局限了其在現(xiàn)場檢驗(yàn)，樣品篩選中的應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析快速的優(yōu)點(diǎn)，常被用于臨床、藥物、食品和環(huán)境等分析領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是在采用一種新穎的半抗原修飾方法基礎(chǔ)上，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的的測定鹽酸林可霉素的酶免疫分析方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種測定食品中鹽酸林可霉素含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特點(diǎn)是以多克隆抗體和抗原與之間特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)而建立的分析方法。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說明外均為重量份數(shù)。測定食品中鹽酸林可霉素含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法。(1)鹽酸林可霉素修飾物的制備步驟l:將35g鹽酸林可霉素(LIN)與58mL對甲氧基苯甲醛溶于1520mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，以苯作為帶水劑，在106t:下反應(yīng)，在苯不斷被蒸走后得到粗產(chǎn)物，再經(jīng)過NaHC03中和，二氯甲烷萃取，活性碳脫色以及乙醚-正己烷結(jié)晶后得到第一步產(chǎn)物2.5g，用紅外光譜(IR)確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。步驟2:將0.50.8g步驟1產(chǎn)物、12mL三乙胺和1.51.8g三苯氯甲烷溶解在58mL丙酮中，以CaCl2為干燥劑回流反應(yīng)24小時，將反應(yīng)液冷卻到5(TC，加入0.541.5g硅膠，混合物攪拌10分鐘，用丙酮熱過濾，濾液用環(huán)己烷_正己烷結(jié)晶得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物溶于丙酮中快速經(jīng)過硅膠柱，收集流出液，加熱回流，用5070mL55t:的水重結(jié)晶得到略黃有光澤的固體顆粒，IR確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。步驟3:將步驟2產(chǎn)物0.20.5g和0.10.18g丁二酸酐溶于1020mL新蒸吡啶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫反應(yīng)24小時，45t:真空旋干得到黃色油狀物，溶于乙酸乙酯中，依次用0.001mol/LHCL及純水洗滌。加入無水NaS04干燥過夜，真空旋干得白色固體，IR確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。步驟4:步驟3產(chǎn)物0.10.18g加入35mL80%乙酸溶液中，在90IO(TC加熱回流2030分鐘，充分冷卻，析出白色固體，過濾，濾液真空旋干得油狀物，用苯反復(fù)洗滌，旋干得到最終產(chǎn)物，IR確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。步驟l-4的反應(yīng)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(2)免疫原和包被抗原的制備將3050mg鹽酸林可霉素衍生物，1518mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，8lOmgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，溶解于400600yL的匿F中，室溫?cái)嚢柽^夜，將混合物離心520分鐘，取上層清液，緩慢加入0.010.02%的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，攪拌反應(yīng)24小時，離心分離，取上層清液，透析數(shù)天，獲得林可霉素_蛋白質(zhì)溶液，冷凍干燥，于溫度-2(TC保存待用。其中，LIN-OVA為免疫原，LIN-BSA為包被抗原。(3)鹽酸林可霉素多克隆抗體的制備用免疫原LIN-OVA免疫兩只兔子將14mg免疫原溶解于0.54mL的生理鹽水中，加入0.53mL完全福氏佐劑，混合成油包水的乳濁液，每只兔子每次吸取0.52.OmL乳濁液，多次皮下注射入兔子背部，15周后，對兔進(jìn)行加強(qiáng)免疫，使用不完全福氏佐劑，其余與第一次免疫相同，第二次免疫后，25周進(jìn)行下一次免疫，第三次、第四次免疫后，57天抽取0.10.5mL耳血，檢測抗體產(chǎn)生的情況，第五次免疫后，515天處死兔子，取全血，將血液在冰箱中放置過夜，吸取上層清液，分裝，于溫度-2(TC保存。(4)建立測定鹽酸林可霉素含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法對所得抗體性能進(jìn)行表征，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，建立測定鹽酸林可霉素含量的ELISA。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.采用新穎的半抗原修飾方法對鹽酸林可霉素的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理修飾。2.成功制備出抗鹽酸林可霉素的多克隆抗體并建立測定食品中鹽酸林可霉素含量的ELISA。3.靈敏度高、特異性強(qiáng)。4.樣品處理簡單、測試量大、測試費(fèi)用低。5.對樣品的測定，ELISA與HPLC有很好的相關(guān)性。圖1為測定鹽酸林可霉素的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線包被抗原LIN-BSA1:50，000(e.g.20ng/well);抗體I，1:50，000;羊抗兔lgG-辣根過氧化物酶(GaRIgG-HRP)，1:20，000由圖1得知，9次ELISA測定的平均標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC5。值(標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度降低50%所對應(yīng)的鹽酸林可霉素的濃度，IC5。值越小，靈敏度越高)為23.729.3g/mL，檢出限(LOD)為00.150.98ng/mL.圖2.為ELISA和HPLC對7個加標(biāo)樣品中鹽酸林可霉素的檢測結(jié)果的相關(guān)曲線由圖2得知，兩種方法相關(guān)性較好，回歸方程為Y=1.022x-0.9995(R2=0.9756，n=7).具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施只用于對發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例1.鹽酸林可霉素修飾物的制備林可霉素為小分子半抗原，不能直接免疫動物產(chǎn)生抗體，但可對其進(jìn)行化學(xué)修飾，使修飾物帶有端基為活性基團(tuán)的連接橋，以便與載體蛋白相連制備免疫原。為了最大程度地保持林可霉素分子的特征結(jié)構(gòu)，本發(fā)明采用了一種新穎的半抗原修飾方法，在對3，4，7位上的羥基進(jìn)行保護(hù)的基礎(chǔ)上，讓2位上的羥基參與修飾反應(yīng)，最終得到僅在林可霉素分子2位連接上一個終端帶羧基手臂的半抗原衍生物。鹽酸林可霉素修飾物的制備步驟l:將35g鹽酸林可霉素(LIN)與58mL對甲氧基苯甲醛溶于1520mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，以苯作為帶水劑，于溫度106t:下反應(yīng)，在苯不斷被蒸走后得到粗產(chǎn)物，再經(jīng)過NaHC03中和，二氯甲烷萃取，活性碳脫色以及乙醚-正己烷結(jié)晶后得到第一步產(chǎn)物2.5g，用紅外光譜(IR)確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。步驟2:將0.50.8g步驟1產(chǎn)物、12mL三乙胺和1.51.8g三苯氯甲烷溶解在58mL丙酮中，以CaCl2為干燥劑回流反應(yīng)24小時，將反應(yīng)液冷卻到5(TC，加入0.51.5g硅膠，混合物攪拌10分鐘，用丙酮熱過濾。濾液用環(huán)己烷-正己烷結(jié)晶得到粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物溶于丙酮中快速經(jīng)過硅膠柱，收集流出液，加熱回流，用5070mL55t:的水重結(jié)晶得到略黃有光澤的固體顆粒，IR確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。步驟3:將步驟2產(chǎn)物0.20.5g和0.10.18g丁二酸酐溶于1020mL新蒸吡啶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫反應(yīng)24小時，于溫度45t:真空旋干得到黃色油狀物，溶于乙酸乙酯中，依次用0.001mol/LHCL及純水洗滌。加入無水NaS04干燥過夜，真空旋干得白色固體，IR確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。步驟4:步驟3產(chǎn)物0.10.18g加入35mL80^乙酸溶液中，于溫度9010(TC加熱回流2030分鐘，充分冷卻，析出白色固體，過濾，濾液真空旋干得油狀物，用苯反復(fù)洗滌，旋干得到最終產(chǎn)物，IR確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。鹽酸林可霉素半抗原衍生物的表征由于保護(hù)基團(tuán)都帶有苯環(huán)的結(jié)構(gòu)，所以通過苯環(huán)的紅外特征峰(o=1613,1587，1516cm—0，再輔以熔點(diǎn)的測試，就能判斷保護(hù)基連接或脫去是否成功。最終產(chǎn)物的紅外圖譜與林可霉素的紅外圖譜作比較，差別僅在前者出現(xiàn)了羰基的紅外特征峰(o=1733cm—0，譜圖信息符合目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。2.免疫原和包被抗原的制備將3050mg鹽酸林可霉素衍生物、1518mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和810mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解于400600yL的N，N-二甲基甲酰胺，室溫?cái)嚢柽^夜，將混合物離心520分鐘，取上層清液，緩慢加入0.010.02%的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，攪拌反應(yīng)24小時，離心分離，取上層清液，透析數(shù)天，獲得林可霉素_蛋白質(zhì)溶液，冷凍干燥，于溫度-2(TC保存待用。其中，LIN-OVA為免疫原，LIN-BSA為包被抗原。3.鹽酸林可霉素多克隆抗體的制備用免疫原LIN-OVA免疫兩只兔子將14mg免疫原溶解于0.54mL的生理鹽水中，加入0.53mL完全福氏佐劑，混合成油包水的乳濁液，每只兔子每次吸取0.52.OmL乳濁液，多次皮下注射入兔子背部，15周后，對兔進(jìn)行加強(qiáng)免疫，使用不完全福氏佐劑，其余與第一次免疫相同，第二次免疫后，25周進(jìn)行下一次免疫，第三次、第四次免疫后，57天抽取0.10.5mL耳血，檢測抗體產(chǎn)生的情況，第五次免疫后，515天處死兔子，取全血，將血液在冰箱中放置過夜，吸取上層清液，分裝，于溫度-2(TC保存。4.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立測定鹽酸林可霉素的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)對所得抗體性能進(jìn)行表征，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，建立測定食品中鹽酸林可霉素含量的ELISA。(1)溶液配制(a)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液稱取2.606gNa2C0310H20，3.434gNaHC03，用800mL超純水混勻溶解后，調(diào)節(jié)pH值，加水至1L，配成0.05mol/L，pH=9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液;(b)磷酸緩沖液(儲備液，PBSX10)稱取21.961gNa2HP0412H20，6.031gNaH2P04*2H20，87.666gNaCl，加800mL超純水混合，加熱溶解；用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH二7.5，加超純水至IL，配成含O.15mol/LNaCl，pH=7.5的0.lmol/L磷酸緩沖液(儲備液)；[OO53](c)酪蛋白溶液稱取酪蛋白加熱溶解于0.01mol/L的PBS中，配成1.0%酪蛋白溶液；(d)磷酸緩沖液_吐溫儲備液(含1%Tween20的0.lmol/L磷酸緩沖儲備液，PBSTXIO，pH=7.5);(e)鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(lmg/mL)稱取0.005gLIN溶解于5mL超純水；(f)LIN-OVA和LIN-BSA交聯(lián)物的配制(lmg/mL)用微量天平稱LIN-OVA或LIN-BSA交聯(lián)物5mg，加入5mL超純水溶解；(g)底物溶液(20mL純水;lmL醋酸鈉緩沖液；200yL四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(1%);20iiL過氧化氫(5%);1)醋酸鈉緩沖液稱取3.450gCH3COONa*31120，用lOOmL超純水溶解，再用lmol/L擰檬酸(21'031gC6H807H20溶解于lOOmL水中)調(diào)節(jié)pH=5.8后，再用水定容到250mL，配成0.lmol/L醋酸鈉緩沖液；2)TMB:稱取0.0717gTMB，用7.17mL二甲基亞砜溶解混勻，配成1%，w/v;3)過氧化氫取20iiL30X的過氧化氫加入100iiL超純水中，混勻，配成5X;(h)H2S04溶液移取25mL濃H2S04，溶解于475mL的超純水中，配成5%H2S04溶液。[OO65](2)主要儀器洗板機(jī)A5082，Tecan，Austria;酶標(biāo)儀A2082，Tecan，Austria;酶標(biāo)板costar;高效液相色譜儀Alltech-OOl(3)間接競爭ELISA步驟1)用包被抗原包板，每孔200iiL，4t:過夜；2)PBST緩沖液(PBST儲備液1:10稀釋)滿孔洗滌三次；3)加入酪蛋白溶液封阻，每孔280iiL，室溫放置1小時；4)PBST緩沖液洗板三次；5)依次每孔加入100iiL的標(biāo)準(zhǔn)溶液和100yL的一定稀釋度的多克隆抗體，室溫放置1小時；6)PBST緩沖液洗板三次；7)加入酶標(biāo)二抗(羊抗兔lgG-辣根過氧化物酶，GaRIgG-HRP)，每孔200yL，室溫放置1小時；8)PBST緩沖液洗板三次；9)加入底物液顯色，每孔200iiL，振搖1520分鐘；10)加入5%H2S04溶液，每孔80iiL，終止反應(yīng);11)用酶標(biāo)儀測定吸光度值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行結(jié)果分析與討論。(4)ELISA實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化本發(fā)明對包被抗原的濃度、抗體的稀釋度、酶標(biāo)二抗的稀釋度等作了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為包被抗原的濃度為20ng/mL，抗體的稀釋度為1:50，000，酶標(biāo)二抗的稀釋度為1:20，000，實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。以后的實(shí)驗(yàn)均在此條件下進(jìn)行。(5)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0，1，3，10，30，100,300，1000ng/mL，由鹽酸林可霉素的儲備液lmg/mL經(jīng)過純水稀釋而得。以鹽酸林可霉素濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以相對信號B/B。X100X為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(B。鹽酸林可霉素標(biāo)液濃度為Ong/mL所對應(yīng)的吸光度值；B:其他各濃度對應(yīng)的吸光度值)。圖1為9次ELISA測定的平均標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC5。在23.7-29.3ng/mL之間。(6)ELISA的特異性ELISA特異性可用交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率(CR%)=(鹽酸林可霉素的IC5。/測試物質(zhì)的IC5。)X100%。交叉反應(yīng)率越小，ELISA的特異性越高。在本發(fā)明選擇鹽酸克林霉素及其他7種用于動物飼養(yǎng)及動物疾病治療的藥物進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，交叉反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)及交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)如表1所示?？贵w與鹽酸克林霉素的交叉反應(yīng)率為18.9%，與其他7種藥物的交叉反應(yīng)率均小于0.01%，說明所得抗體對鹽酸林可霉素的特異性較高。5.ELISA對加標(biāo)樣品中鹽酸林可霉素含量的測定隨機(jī)選擇了6種食品牛奶I，牛奶11，豬肝I，豬肝11，雞肉I，雞肉11，經(jīng)ELISA檢測，均沒有檢出林可霉素，為陰性樣品。對所選樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，豬肝及雞肉樣品需切碎勻漿，牛奶樣品可直接用于加標(biāo)。稱取15g，加入不同濃度鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，震蕩20分鐘，4t:靜止過夜，加入0.Olmol/LHCL溶液，水浴振蕩半小時，超聲20分鐘，離心，取上層清液，用2mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值到6.0左右，離心，上清液用超純水稀釋2050倍后ELISA直接測定，結(jié)果如表2所示，回收率在76.6-117.6.%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7-34.6%，說明該ELISA方法的準(zhǔn)確性和精密度都較好。6.ELISA和HPLC的比較鹽酸林可霉素的HPLC條件為HypersilGold柱，柱溫為室溫，流動相為用H3P04調(diào)節(jié)pH至6.0的O.Olmol/L硼砂溶液甲醇=80::20，流量lmL/min，進(jìn)樣20yL，紫外檢測波長215nm，鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為1、5、10、20、40、60、80、100yg/mL，樣品萃取液用0.45iim濾膜過濾后直接測定。所建立的ELISA的可靠性用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。7種加標(biāo)樣品，即牛奶I，加標(biāo)濃度5iig/mL和10iig/mL;牛奶II，加標(biāo)濃度20yg/mL;豬肝I，加標(biāo)濃度40yg/g;豬肝11，加標(biāo)濃度50iig/g:雞肉1，加標(biāo)濃度80iig/g;雞肉II，加標(biāo)濃度lOOiig/g。加標(biāo)樣品用0.lmol/L鹽酸萃取并用ELISA和HPLC測定，測定結(jié)果以ELISA為橫坐標(biāo)，HPLC為縱坐標(biāo)作圖得兩者的相關(guān)曲線，如圖2所示，回歸方程為Y=1.022x-0.9995.，相關(guān)系數(shù)為0.9756，n二7，說明二者的相關(guān)性很好。表1抗體與其他8種藥物的交叉反應(yīng)率9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>樣品加標(biāo)濃度稀釋度檢出濃度回收率RSD_ug/g(ml)_Pg/g(ml)__(%，n=3)0.12.08±0.33103.815.9牛奶I0.2504.70±0.75117.615.9116.96±3.8984.823.0_^_41.27±7.43_103.2_18.00.12.30±0.14115.06.3牛奶II0.24.60±0.63115.013.615017.58±1.8788.010.7_^_46.91±1.65__3.50.12.44±0.1297.54.8豬肝I0.2404.90±1.6498.033.4125.20±4.93100.819.6_^_57.31±5.84_115.0_10.20.12.22±0.4488.719.7豬肝II0.24.63±1.2092.725.914020.76±1.3883.16.7_^_44.04±3.75__8.50.14.62±1.6092.534.6雞肉I0.2209.26±0.1692.61.7153.71±2.03107.43.8_^_93.39±13.86__14.80.12.23±0.4489.119.9雞肉II0.24.63±0.3892.68.214022.85±4.4579.019.5_^_38.33±3.65_^_9.5加標(biāo)樣品均為陰性樣品加標(biāo)。1權(quán)利要求測定食品中鹽酸林可霉素含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)鹽酸林可霉素修飾物的制備步驟1將3～5g鹽酸林可霉素與5～8mL對甲氧基苯甲醛溶于15～20mLN，N-二甲基甲酰胺中，以苯作為帶水劑，在溫度96～106℃下反應(yīng)，在苯不斷被蒸走后得到粗產(chǎn)物，再經(jīng)過NaHCO3中和至中性，二氯甲烷萃取，活性碳脫色以及乙醚-正己烷結(jié)晶后得到第一步產(chǎn)物2.5g，用紅外光譜確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)；步驟2將0.5～0.8g步驟1產(chǎn)物、1～2mL三乙胺和1.5～1.8g三苯氯甲烷溶解在5～8mL丙酮中，以CaCl2為干燥劑回流反應(yīng)24小時，將反應(yīng)液冷卻到50℃，加入0.5～1.5g硅膠，混合物攪拌10分鐘，用丙酮熱過濾，濾液用環(huán)己烷-正己烷結(jié)晶得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物溶于丙酮中快速經(jīng)過硅膠柱，收集流出液，加熱回流，用50～70mL55℃的水重結(jié)晶得到略黃有光澤的固體顆粒，用紅外光譜確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)；步驟3將步驟2產(chǎn)物0.2～0.5g和0.1～0.18g丁二酸酐溶于10～20mL新蒸吡啶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫反應(yīng)24小時，在溫度45℃真空旋干得到黃色油狀物，溶于乙酸乙酯中，依次用0.001mol/LHCL及純水洗滌，加入無水Na2SO4干燥過夜，真空旋干得白色固體，用紅外光譜確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)；步驟4將步驟3產(chǎn)物0.1～0.18g加入3～5mL80％乙酸溶液中，在溫度90～100℃加熱回流20～30分鐘，充分冷卻，析出白色固體，過濾，濾液真空旋干得油狀物，用苯反復(fù)洗滌，旋干得到最終產(chǎn)物，用紅外光譜確證產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)；步驟1-4的反應(yīng)如下(2)免疫原和包被抗原的制備將30～50mg鹽酸林可霉素衍生物、15～18mg二環(huán)己基碳二亞胺和8～10mgN-羥基琥珀酰亞胺溶解于400～600μL的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫?cái)嚢柽^夜，將混合物離心5～20分鐘，取上層清液，緩慢加入0.01～0.02％的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，攪拌反應(yīng)24小時，離心分離，取上層清液，透析數(shù)天，獲得林可霉素-蛋白質(zhì)溶液，冷凍干燥，于溫度-20℃保存待用，其中，LIN-OVA為免疫原，LIN-BSA為包被抗原；(3)鹽酸林可霉素多克隆抗體的制備用免疫原LIN-OVA免疫兩只兔子將1～4mg免疫原溶解于0.5～4mL的生理鹽水中，加入0.5～3mL完全福氏佐劑，混合成油包水的乳濁液，每只兔子每次吸取0.5～2.0mL乳濁液，多次皮下注射入兔子背部，1～5周后，對兔進(jìn)行加強(qiáng)免疫，使用不完全福氏佐劑，其余與第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周進(jìn)行下一次免疫，第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，檢測抗體產(chǎn)生的情況，第五次免疫后，5～15天處死兔子，取全血，將血液在冰箱中放置過夜，吸取上層清液，分裝，于溫度-20℃保存；(4)建立測定鹽酸林可霉素含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法對所得抗體性能進(jìn)行表征，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，建立測定鹽酸林可霉素含量的ELISA；(5)ELISA對加標(biāo)樣品中鹽酸林可霉素含量的測定隨機(jī)選擇了6種食品牛奶I，牛奶II，豬肝I，豬肝II，雞肉I，雞肉II，經(jīng)ELISA檢測，均沒有檢出林可霉素，為陰性樣品，對所選樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，豬肝及雞肉樣品需切碎勻漿，牛奶樣品可直接用于加標(biāo)，稱取1～5g，加入不同濃度鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，震蕩20分鐘，4℃靜止過夜，加入0.01mol/LHCL溶液，水浴振蕩半小時，超聲20分鐘，離心，取上層清液，用2mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值到6.0左右，離心，上清液用超純水稀釋20～50倍后ELISA直接測定，回收率在76.6-117.6％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7-34.6％，說明該ELISA方法的準(zhǔn)確性和精密度都較好；(6)ELISA和HPLC的比較鹽酸林可霉素的HPLC條件為HypersilGold柱，柱溫為室溫，流動相為用H3PO4調(diào)節(jié)pH至6.0的0.01mol/L硼砂溶液∶甲醇＝80∶∶20，流量1mL/min，進(jìn)樣20μL，紫外檢測波長215nm，鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL，樣品萃取液用0.45μm的濾膜過濾后直接測定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，7種加標(biāo)樣品，即牛奶I，加標(biāo)濃度5μg/mL和10μg/mL；牛奶II，加標(biāo)濃度20μg/mL；豬肝I，加標(biāo)濃度40μg/g；豬肝II，加標(biāo)濃度50μg/g；雞肉I，加標(biāo)濃度80μg/g；雞肉II，加標(biāo)濃度100μg/g，加標(biāo)樣品用0.1mol/L鹽酸萃取并用ELISA和HPLC測定，測定結(jié)果以ELISA為橫坐標(biāo)，HPLC為縱坐標(biāo)作圖得兩者的相關(guān)曲線，回歸方程為Y＝1.022x-0.9995，相關(guān)系數(shù)為0.9756，n＝7，說明二者的相關(guān)性很好。F2009102163182C0000011.tif全文摘要本發(fā)明公開了測定食品中鹽酸林可霉素含量的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)，其特點(diǎn)是采用新穎的半抗原修飾方法，合成鹽酸林可霉素的修飾物并將其與蛋白聯(lián)接，制得免疫原及包被抗原。通過免疫動物獲得兔抗鹽酸林可霉素的多克隆抗體?？贵w用于鹽酸林可霉素的免疫分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為1～1000ng/mL，IC50為23.7～29.3ng/mL；抗體與鹽酸克林霉素的交叉反應(yīng)率為18.9％，與其它7種常用抗生素或激素幾乎沒有交叉反應(yīng)。6種市售食品加標(biāo)后用0.01mol/LHCL萃取，萃取液經(jīng)適當(dāng)稀釋用ELISA測定，加標(biāo)回收率為76.6～117.6％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7～34.6％。用HPLC和ELISA對7種加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，兩種方法相關(guān)性較好(R2＝0.9756，n＝7)。本發(fā)明建立的ELISA可靠，靈敏度高，特異性強(qiáng)，可用于食品中鹽酸林可霉素含量檢測。文檔編號G01N21/31GK101726590SQ200910216318公開日2010年6月9日申請日期2009年11月25日優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日發(fā)明者楊紅,王悅秋,鄧安平申請人:四川大學(xué)