專利名稱：一種新的檢測血清樣本中禽流感抗體的方法和產品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的檢測血清樣本中禽流感抗體的定量檢測方法和產, 其制備方法。
r及
背景技術：
禽流感病毒屬甲型流感病毒，甲型流感病毒多發(fā)于禽類， 一般來說，禽流 感病毒與人流感病毒存在受體特異性差異，禽流感病毒是不容易感染給人的。
個別造成人感染發(fā)病的禽流感病毒可能是發(fā)生了變異的病毒，但1997年香港禽
感病毒，其中6人死亡事件的發(fā)生，打破了人們對禽流感病毒的傳統(tǒng)認識模式，研 究表明，感染人的禽流感病毒亞型主要為H5N1、 H9N2、 H7N7，其中感染H5N1 的患者病情重，病死率高。
原或抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、竟爭法、間接法等。 間接法測抗體的原理是特異性抗原結合到固相載體上，然后和待檢血清中的相 應抗體結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記抗體與免疫復合物中的抗體結
合形成酶標記抗體-抗體-固相抗原復合物，加底物顯色，判斷抗體含量。
懸浮芯片(suspension array)^稱液相芯片，是20世紀70年代美國Luminex 公司研制出的新一代生物芯片技術，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞 儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規(guī)模測定。目前，該技術已 廣泛應用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分 析等領域。
目前發(fā)展的懸浮芯片主要是針對細胞因子的檢測。懸浮芯片是否能夠檢測 人血清中的禽流感抗體，其定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種新的檢測血清中禽流感菌抗體的蛋白懸浮芯片，該芯片包 括編碼微球，作為包被微球抗原是禽流感H5蛋白抗原，生物素標記的羊抗兔IgG和羊抗人IgG作為檢測抗體，鏈親和素-藻紅蛋白和適宜的緩沖溶液，所述 編碼微球可選擇任意編號的編碼微球。
本發(fā)明提供上述檢測禽流感抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，其特征在于， 在相關緩沖溶液中，編碼微球用禽流感H5蛋白抗原包被、用生物素標記的檢測 抗體為羊抗兔IgG和羊抗人IgG、用鏈親和素-藻紅蛋白作為信號檢測物。
本發(fā)明提供一種禽流感抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測方法，該方法采用間 接法檢測抗體的免疫學檢測原理，其特征在于，在檢測過程中所有反應可在96 孔濾板上或在微量離心管中進行，其中包括下列步驟(1)每孔或管中加入含 有已包被捕獲抗原，即禽流感H5蛋白抗原的編碼微球的工作溶液，用清洗液清 洗；(2)加入待測血清樣品，孵育后清洗；(3 )加入用生物素化的檢測抗體， 孵育后清洗；(4)加入鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(5)加 入檢測緩沖液后混勻，(6 )用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值(即平均熒光強度) 并分析數(shù)據(jù)判定檢測結果陰性或陽性。
本發(fā)明還提供一種檢測血清樣品中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測方 法，其特征在于，該方法包括下列步驟(1)加入的陽性;險測樣品或標準品經 4倍梯度倍比系列稀釋，(2)制作樣品濃度對應MFI值的劑量-反應標準曲線， (3 )用分析軟件擬合劑量-反應曲線和方程，(4 )可根據(jù)劑量-反應曲線判定方 法動態(tài)檢測范圍，未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應方程計算出檢測樣品的濃度。
懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不 同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特 的色彩編號，每顆微球大小約5.6pm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、 酶分析、受體和配體識別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標定特定抗體、核酸 探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應。反應后， 利用機器自動將反應液吸起并通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通 過檢測通道。檢測通道中設有兩道激光， 一道為紅色，激發(fā)微球基質中的顏色， 識別微球分類編碼以確定檢測項目； 一道為綠色，激發(fā)凈艮告分子的顏色，記錄 信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時， 兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中 的激發(fā)光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析兩道激光所激發(fā)的微 球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本 中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術由于利 用微球在溶液中反應，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，同時利用激光檢測技術，大大提高了樣品檢測的準確 性和重復性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。
本發(fā)明人經過大量和深入的研究，對禽流感抗體的蛋白懸浮芯片制備及其
檢測條件作了實質性的改進和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點
1、 抗原包被量的改進
禽流感H5蛋白的包被量是成功檢測的關鍵，本發(fā)明對包被微球的抗原包被 量進行實質性優(yōu)化使血清樣本的檢測效果非常良好，并且包被懸浮芯片所需的 抗原包被量很低，本發(fā)明的抗原包被量為3-9ng/1.25xl(f個微球，即 6-24ng/2500-5000個微球/測試， 一般的ELISA方法抗原包被量為5pg/測試。
2、 生物素標記的改進
通常，標記抗體需要使用過量的生物素。理i侖上講，在檢測過程中，過量 的生物素因未標記上抗體而不被微球上結合捕獲抗體的抗原連接，清洗時被抽 濾掉，不會與隨后加入的SA-PE反應，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶 爾遇到過檢測信號可能過高的現(xiàn)象，出現(xiàn)假陽性，因此建議生物素標記抗體后， 盡量去除多余的生物素。以標記2 mg/mL的IgG (分子量150,000) 1 mL溶液為 例，需加入10 mM生物素溶液約27 nL。
3 、 檢測的靈敏度及動態(tài)范圍
本發(fā)明的血清樣品禽流感抗體的定量檢測方法和芯片與經典的免疫學 ELISA檢測方法相比，結果有著很好的吻合性(相關系數(shù)R、0.9863)。同時， 懸浮芯片方法靈敏度為檢測滴度4.767 x l(T6，高于ELISA方法的檢測滴度l(T5， 靈每文度提高IO倍以上；并且懸浮芯片方法動態(tài);險測范圍為2 x io-7~2 x i(r2，高 于ELISA方法動態(tài)檢測范圍l(T5 ~10-2達1個數(shù)量級。
4、 方法的特異性
本發(fā)明通過選用禽流感H5蛋白為包被抗原，以兔抗禽流感H5N1抗體為待 測抗體，以生物素化的羊抗兔為4企測抗體。^研究試騶4正明，在存在鼠抗流感 NPIgG、兔抗結核血清、兔抗鼠疫菌F1抗原多克隆抗體、兔抗SARSIgG干擾 抗體存在條件下本方法具有良好的特異性。
5、 樣品的檢測能力
本發(fā)明評價了懸浮芯片方法對人血清的檢測能力。通過對人血清的檢測， 初步證實了該方法在4全測人血清中禽流感抗體的實用性。


圖1: 032號孩i球包被禽流感H5蛋白檢測禽流感抗體示意圖2:蛋白懸浮芯片方法檢測兔抗禽流感H5N1抗體的劑量-反應標準曲線
圖3: ELISA方法4企測兔抗禽流感H5N1血清標準曲線圖4:蛋白質懸浮芯片與ELISA方法才企測兔抗禽流感H5N1血清的相關性。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及的檢測禽流感抗體的蛋白懸浮芯片制備方法、檢測及定量方法 通過下面的具體實施方式
作進一步i兌明，^f旦本發(fā)明不以任何方式受該實施例的 限定。
一、材料
1. 蛋白懸浮芯片的相關緩沖液
(1 ) PBS纟爰沖'液(pH7.4) : NaCl 137mmol/L; KC1 2.7mmol/L; Na2HP04 10mmol/L; KH2P04 2mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4。用HC1調節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L。分裝后 在15psi (1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過濾除菌，保存于室溫。
(2)微球清洗液PBS (pH7.4) ， 0.05% TWEEN國20。
(3 )孩t球活化緩沖液100 mM NaH2P04: 3g NaH2P04, 5N NaOH 1.5 mL, 定容于250mL, pH6.2。
(4 )微球包被緩沖液0.05 M MES， pH 5.0: 2.44 g MES， 5N NaOH 0.15 mL， 定容于250mL。
(5 )微球保存液PBS-TBN: PBS， 0.1%BSA， 0.02% TWEEN， 0.05%疊氮 化物，pH7.4。
(6) 孩t球封閉液PBS-BN: PBS， 1%BSA, 0.05%疊氮化物，pH7.4。
(7) 檢觀'J緩沖液PBS, 1%BSA, pH7.4。 (8 )抗體稀釋液PBS, pH7.4。
(9) 微球稀釋液PBS， 1%BSA, pH7.4。
(10) 樣品稀釋液PVX: PBS， 0.5%PVA, 0.8%PVP;
(11 )生物素化抗體稀釋液PBS-TBN(PBS， 0.1%BSA, 0.02% TWEEN-20, 0.05%NaN3， pH7.4)。
(12) SA-PE稀釋液:PBS (pH7.4) ， 1%BSA。
2. 抗原與抗體本發(fā)明所使用抗原重組禽流感病毒H5蛋白作為檢測抗原。 本發(fā)明所使用待測抗體為兔抗禽流感H5N1血清，4企測抗體可為生物素化 羊抗兔IgG和生物素化羊抗人IgG。 二、待測樣品的制備
1、 目標分析物樣品的制備
目標分析物為兔抗禽流感H5N1 IgG，干護L樣品或作為方法特異性測試的樣 品是目標檢測物外的其它抗體或其它蛋白質，包括兔抗結核血清、兔抗SARS IgG 、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將 上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液中，fC保存。兔抗禽流感H5N1 IgG的儲備 液濃度為0.2mg/mL 。比較實驗中，相同樣品用于ELISA和懸浮芯片的檢測。
將待分析的兔抗禽流感H5N1 IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同 濃度樣品，以繪制樣品檢測劑量-反應的標準曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測 的敏感度，高濃度樣品應使編碼微球的結合位點處于飽和狀態(tài)。
2、 人血清樣本的處理
將人血清樣本用樣品稀釋1: 10稀釋，例如人血清樣本5jiL加樣品稀釋液 50pL混勻后，作為待檢樣品進行懸浮芯片方法的檢測。
實施例l、檢測禽流感抗體的蛋白質懸浮芯片的制備 1、捕獲抗原包被編碼微球
本發(fā)明采用的032號編碼微球購自美國BIO-RAD公司，編碼微球用于標記 可以捕獲禽流感抗體的禽流感H5蛋白抗原，即利用禽流感H5蛋白包被微球。
A、 編碼微球的活化
取100|iL ( 1.25xl()6個)編碼微球到1.5mL離心管中，14000 x g離心，小 心吸出并棄去上清液。加入100pL的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100jxL的微球活化緩沖液，接著先加入 lO[iL新鮮配置的EDC ( 50mg/mL)，再加入10pL新鮮配置的50mg/mL的 Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20分鐘。加入150|iL的 PBS (pH7.4),震蕩后，14000xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100pL 的PBS (pH7.4)懸浮編碼微球。
B、 用抗原包凈皮編碼孩O求
取捕獲抗原禽流感H5蛋白抗原4-50嗎加入到活化后的編碼微球中，用PBS 緩沖液定容至500(aL,室溫震搖2小時。14000xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500pL的PBS緩沖液洗一次，14000xg離心，小心吸出并棄去上清液。 加入250|iL的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 x g離心， 小心吸出并棄去上清液。加入500pL的微球保存液洗滌編碼孩i球，16000 x g離 心，小心吸出并棄去上清液。最后用150pL的微球保存液懸浮編碼微球，于4。C 避光保存?zhèn)溆谩?br> C、包被微球的計數(shù)
吸取適量微球，稀釋后，用血球計數(shù)板(0.10mm; 1/400mm、在普通顯微鏡 下計數(shù)。根據(jù)公式(每個大格數(shù)xlO、稀釋倍數(shù)x體積(mL))計算微球數(shù)量。 2、檢測抗體標記生物素
A、 生物素的標記
分別配制好濃度為10mM生物素溶液和2mg/mL的待標記抗體溶液，將計 算好體積的生物素加入到待標記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小 時)，過柱脫鹽后分裝，-20°。凍存?zhèn)溆谩?br> B、 抗體的用量
以標記2 mg/mL的IgG (分子量150，000) 1 mL溶液為例，需加入IO mM生物 素溶液約27 |il。
實施例2、懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化
1、 微球包被抗原包被量的選擇
分另'J以lpg、 3fig、 6jag、 9pg、 12pg、 15pg、 20|ig的量包4皮lOO(iL編石馬為 027號的孩i球。經檢測效果比較，以6jag/1.25xl06個微球即12-24ng/2500~5000 個微球/測試包被效果最好，顯微鏡下計數(shù)后避光冷藏保存待用。如圖l所示， 包被禽流感H5蛋白抗原的032號微球均落在其正確檢測區(qū)域內，并且獲得高信 噪比結果(MFI值遠大于2000),說明優(yōu)化的懸浮芯片檢測系統(tǒng)可成功用于禽 流感纟元體的檢測。
2、 生物素化抗體的優(yōu)化
本發(fā)明分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧 基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標記檢測抗體， 經質控過程檢測效果比較，本實驗中羧基活性的生物素標記檢測抗體檢測效果 較好，檢測效果的方法采用本領域的常規(guī)方法或安裝制造商的產品說明書所述 的方法。本發(fā)明人經過試驗驗證，發(fā)現(xiàn)2mg/mL生物素化的羊抗兔抗體以1: 250稀 釋作為檢測抗體進行檢測兔血清中禽流感抗體，檢測結果顯示生物素化4企測抗 體Bio-羊抗兔抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果；2mg/mL生物素化的 抗體羊抗人以l: 2500稀釋作為檢測人血清中禽流感抗體，檢測結果顯示生物 素化檢測抗體Bio-羊抗人抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果。
實施例3、樣品的制備、檢測及結果判定
1、 待測樣品制備
用樣品稀釋液將待測樣本配置為不同濃度樣本進行蛋白懸浮芯片檢測。
2、 樣品的檢測及結果判定
檢測過程全部反應均在96孔濾板上進行，檢測過程如下
1) 每孔加入50|iL含相應編碼孩t球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽
濾；
2) 加入50 檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽
濾；
3) 加入50 ]iL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；
4) 加入50jiL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵 抽濾；
5) 加入125(xL的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；
6) 用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。
3、 檢測結果判定
根據(jù)試驗研究結果與相關研究報道，本發(fā)明定義蛋白懸浮芯片方法檢測禽 流感抗體的最低檢出限(LOD值)為檢測熒光強度臨界值(Cutoff)對應的檢測 物濃度。其中，Cutoff的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI 均值加3倍標準差(SD )，即Cutoff值為=MFI(空白對照)+3倍標準差。若檢 測結果高于Cutoff對應焚光強度值則判定為禽流感抗體檢測結果陽性；若檢測 結果低于Cutoff對應熒光強度值則判定為禽流感抗體檢測結果陰性。
實施例4、懸浮芯片對禽流感H5蛋白抗原的特異性試驗
應用懸浮芯片^r測方法分別對兔抗結核IgG 、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG 、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進行檢測，根據(jù)實施例3中檢測結果判定標準，僅兔抗禽流感H5NlIgG為陽性，其 余干擾抗體或蛋白均為陰性。說明本發(fā)明所建立的禽流感抗體的懸浮芯片檢測 方法與其它測試抗體均不發(fā)生交叉反應或非特異反應。
實施例5、對血清樣品中禽流感抗體的懸浮芯片定量檢測
1 、兔抗禽流感H5NlIgG標準曲線樣品制備
用樣品稀釋液將兔抗禽流感H5N1 IgG標準品由20(ig/mL以4倍倍比梯度 稀釋至191pg/mL成系列濃度樣品。
2 、劑量-反應標準曲線的繪制
按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng) 檢測結果繪制劑量-反應標準曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗體的濃度 (ng/mL) , Y軸代表懸浮芯片儀檢測的熒光值(MFI)。每個數(shù)據(jù)代表3次的 檢測結果平均值，坐標軸以對數(shù)-對數(shù)關系設定，圖2中鼠抗禽流感H5N1血清的 濃度(ng/mL)分別為Sl: 0.191， S2: 0.763， S3: 3,052， S4: 12.207， S5: 48.828， S6: 195.312， S7: 781.25， S8: 3125.0， S9: 12500.0 ， S10: 50000.0。
懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測結果擬合兔抗禽流感H5NlIgG劑量-反應標準曲線 方程為
FI = -1.31918 + (13360.5 + 1.31918) / [1 + (Cone / 3.93 3 28)-0 957367]0 953689
3、本發(fā)明懸浮芯片法檢測血清中兔抗禽流感H5NlIgG的靈敏度和動態(tài)范圍
根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應標準曲線方程，本發(fā)明即蛋白質懸浮芯片 方法;險測兔抗禽流感H5NlIgG的靈每文度為0.0015ng/mL ( Cutoff =8.6213 ， MFI (空白對照)=6.5,標準差=0.7071 )。
本發(fā)明定義最高檢出限為使編碼微球的結合位點處于飽和狀態(tài)的檢測物濃 度。根據(jù)標準曲線隨著兔抗禽流感H5NlIgG濃度的升高，其對應的MFI值也隨 之遞增，當兔抗禽流感H5NlIgG濃度達到0.05mg/mL時，抗原抗體的免疫反應 即將達到飽和狀態(tài)，MFI值也將進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度還可以 更高，需要將高濃度樣品再檢測。
因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即懸浮芯片定量檢測 兔抗禽流感H5N1 IgG的動態(tài)范圍為48.828 ~ 50000ng/mL。
實施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測禽流感抗體的比較1、 生物素-親和素ELISA (BAS-ELISA)檢測方法
作為對比，生物素-親和素ELISA采用包括下列步驟
1) 向普通ELISA微孔板每孔加入50(iL用PBS緩沖液稀釋的禽流感H5蛋 白5-50ng， 4。C靜止過夜；
2) 加入封閉液，在37。C封閉2小時；
3) 洗液洗3次，拍干；
4) 加入檢測樣品，每孔50jxL，室溫;改置40分鐘；洗液洗3次，拍干；
5) 加入適量生物素化檢測抗體，每孔50jaL,室溫力t置30分鐘；洗液洗3次， 拍干；
6) 加入適量SA/HRP (辣根酶標記鏈霉親和素)，50nL/孔，室溫放置3分 鐘；洗液洗3次，拍干；
7) 加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50pL/孔，室溫 放置IO分鐘；
8) 用2M H2S04終止反應；
9) 應用酶標4義測讀A450nm數(shù)值。
2、 樣品的懸浮芯片檢測方法
采用間接法測抗體的免疫學檢測模式，檢測過程中全部反應均在96孔濾板 上進行。
1) 每孔加入50pL含相應編碼孩i球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵才由濾2
次；
2) 加入50 檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽 濾3次；
3) 加入50 適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵才由濾3次；
4) 加入50|iL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。用清洗液洗滌并真 空泵抽濾3次；
5) 加入125pL的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；
6) 用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。
3、 兩種檢測方法的靈敏度和動態(tài)范圍及相關性的比較
制備的相同一組兔抗禽流感H5N1血清樣品用樣品稀釋液IO倍比稀釋同時 應用懸浮芯片和ELISA方法進行檢測。繪制ELISA方法檢測兔抗禽流感H5N1血清的標準曲線(圖中橫坐標為樣品濃度，縱坐標為吸光度值，坐標軸取對數(shù)-對數(shù)關系)，并與懸浮芯片方法結果進行比較。
根據(jù)兩種方法標準曲線懸浮芯片方法如圖2所示的靈敏度為4.767xl(T6 (血清滴度)，線性檢測范圍2xl(T7 2xl{r2; ELISA方法如圖3所示的靈壽丈度 為10-5 (血清滴度)，線性檢測范圍l(T5~10-2?？梢缘贸鼋Y論檢測相同兔抗禽 流感H5N1血清樣品，蛋白懸浮芯片方法比ELISA方法具有更高的檢測靈敏度， 即高10倍；并且具有更寬的動態(tài);險測范圍，即高2個數(shù)量級。
另外，如圖4所示，將兩種方法檢測結果在10-5~10-2范圍內進行比較可以 判定蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關性，相關系數(shù)為0.9863。
實施例7、 Ajfc清樣品的檢測
1、 人血清樣品的準備
將人血清樣品用樣品稀釋液1: 10稀#(人血清樣本5|iiL加樣品稀釋液50|uL 混勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測。
2、 人血清樣品的4企測
l傳孔加入50pL含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽
濾；
2) 加入50 待檢測人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液 洗滌并4由濾；
3) 加入50 pL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人抗體，混勻 后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；
4) 加入50pL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵 抽濾；
5) 力口入125pL的^r測緩沖液，經蝸S走重懸混勻；
6) 用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標準曲線，確定待^r測人血清中禽 流感抗體的濃度。
經過多次重復試驗，生物素化羊抗人IgG稀釋比例優(yōu)選用1: 2500稀釋， SA-PE稀釋比例優(yōu)選用1: 300稀釋，通過對94份人血清的檢測，所得的MFI 值的均值與其標準差的3倍之和為作為判斷陰陽性的界值，即C utoff值為2286, 換算為濃度值是0.68ng/mL，檢測得到的MFI值如果大于2286,即血清中的禽 流感抗體濃度超過0.68ng/mL可一見為禽流感抗體陽性可能^皮禽流感病毒感染，如果MFI值小于2286,即血清中的禽流感抗體濃度低于0.68ng/mL可判斷為禽流 感抗體陰性，未感染禽流感病毒。
權利要求
1、一種采用蛋白懸浮芯片檢測血清樣品中禽流感抗體的間接免疫學定量檢測方法，其特征在于，檢測過程中全部反應可在96孔濾板或者微量離心管中進行，該方法包括下列步驟(1)包被微球的捕獲抗原為禽流感H5蛋白抗原，(2)向孔入加入含已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待測血清樣品，孵育后清洗；(4)加入用生物素化的檢測抗體，孵育后清洗；(5)加入鏈親和素-藻紅蛋白，孵育后清洗；(6)加入檢測緩沖液后混勻；(7)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強度(MFI)數(shù)值并分析數(shù)據(jù)判定檢測結果。
2、 如權利要求1所述的方法，其特征在于，采用生物素標記的羊抗人IgG 作為檢測抗體，并且其與抗原禽流感H5蛋白組合組成間接法檢測體系。
3、 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的包被孩i球的捕獲抗原 禽流感H5蛋白抗原用量為3-9pg /1.25x106個編碼《效球或 6 24ng/2500"5000個微球/測試。
4、 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法中的標記沖企測抗體 羊抗人IgG的生物素為羧基活性的生物素。
5、 如權利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的檢測抗 體Bio-羊抗人IgG以1: 2500稀釋作為檢測抗體進行;險測。
6、 一種定量檢測血清樣品中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片方法，其特征在 于，該方法包括下列步驟(1 )加入的陽性檢測樣品或標準品經梯度倍比稀釋，所述梯度倍比稀釋 為4倍；(2 )將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統(tǒng)中沖全測讀取對應熒光值(MFI); (3 )制作樣品濃度對應MFI值的劑量-反應曲線； (4)用分析軟件擬合劑量-反應曲線和方程；(5 )未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應曲線和方程判斷未知樣本中禽流感抗 體的濃度其特征在于，加入的陽性;險測樣品為兔抗禽流感H5N1 IgG。
7、 一種檢測血清樣品中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片，該芯片包括編碼 微球，作為包被微球抗原是禽流感H5蛋白抗原，生物素標記的羊抗人IgG 作為檢測抗體，鏈親和素-藻紅蛋白和適宜的緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的檢測血清樣本中禽流感抗體的定量檢測方法和產品及其制備方法。本發(fā)明的方法檢測能力好、靈敏度高、特異性強、動態(tài)范圍寬，并建立了以禽流感抗體為代表的病毒抗體蛋白質懸浮芯片檢測的開放性檢測模式化平臺。
文檔編號G01N21/64GK101533023SQ20091008300
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權日2009年4月28日
發(fā)明者孫肖紅, 宇 楊, 楊永莉, 靜 王, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院