專(zhuān)利名稱(chēng)：甲醛測(cè)定試劑(盒)及甲醛濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲醛測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定甲醛濃度的方法，屬
于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甲醛測(cè)定的測(cè)定方法主要有分光光度法、色譜法、電化學(xué)法、化學(xué)滴定法等
分光光度法測(cè)定的主要方法有乙酰丙酮法、鉻變酸法、MBTH法、付品紅法、AHMT法 等幾種。分光光度法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便；缺點(diǎn)是靈敏度較低，有污染介質(zhì)，對(duì)測(cè)定有干擾。
色譜法主要有氣相色譜、高效液相色譜法、離子色譜法等，直接利用色譜法較少， 一般是和其它分析儀器相連用，如GC-MS、HPLC-UV等。色譜法方法簡(jiǎn)單、快速、直接，但是操 作繁瑣、試劑消耗量大、方法選擇性差等缺點(diǎn)。 電化學(xué)法包括示波極譜法、吸附伏安法和哥臘衍生試劑法，該法空氣中甲醛的靈 敏度和準(zhǔn)確度都很高，適合于測(cè)定室內(nèi)空氣中微量甲醛。 熒光分析法因具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)而受到人們廣泛的重
視，尤其是用于室內(nèi)空氣環(huán)境中痕量甲醛的分析監(jiān)測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)更為突出?；瘜W(xué)發(fā)光分析法具
有靈敏度高，線性范圍寬，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。 化學(xué)滴定法主要包括電位滴定法、碘量法及酸堿滴定法。 綜合上述，沒(méi)有一個(gè)方法可以使用自動(dòng)化儀器檢測(cè)甲醛的，酶法檢測(cè)甲醛的試劑， 酶法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高不受干擾、操作方便、成本低廉、可以大批量檢測(cè)，方法靈敏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出 一 種利用酶倍增法(Enzymatic
DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法
(CoupleReaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度
的變化，得以測(cè)定甲醛濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的甲醛測(cè)定試劑
(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行甲醛濃
度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明甲醛濃度測(cè)定方法如下 甲醛+輔酶+水甲醛脫氡酶甲酸+還原型輔酶 甲酸+乙酰-輔酶A甲酸C-乙酰某轉(zhuǎn)移酶輔酶A+丙酮酸 2輔酶A+輔酶輔酶A-二硫還原酶輔酶A- 二硫+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase ;EC 1. 2. 1. 46)酶(偶)
聯(lián)甲酸C-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(formate C-acetyltransferase ;EC 2. 3. 1. 54)、輔酶A_ 二硫還
原酶(CoA-disulfide reductase ;EC 1.8. 1. 14)酶促反應(yīng)比色終點(diǎn)法。甲醛脫氫酶酶解甲
醛反應(yīng)產(chǎn)生甲酸，再通過(guò)(偶)聯(lián)合甲酸C-乙酰基轉(zhuǎn)移酶、輔酶A-二硫還原酶的作用，最
終二次將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的程 度，可以測(cè)算甲醛的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性?xún)煞矫婢C合考慮，無(wú)論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明甲醛測(cè)定試劑(盒)較為理想 本發(fā)明的甲醛測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A-二硫還原酶、乙 酰-輔酶A。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定齊U、輔酶、乙酰_輔酶A。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙酰基轉(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶。 輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶、乙酰_輔酶A在試
劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定齊U、輔酶、乙酰_輔酶A。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶。 輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶、乙酰_輔酶A在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無(wú)論是單齊U、雙劑還是三齊U，本發(fā)明測(cè)定甲醛濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。





緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
甲醛脫氫酶 甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶 輔酶A- 二硫還原酶 乙酰_輔酶A
實(shí)施例一 本實(shí)施例的甲醛測(cè)定試劑為單試劑，包括 [OO44]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
甲醛脫氫酶 10000U/L
甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶 12000U/L
輔酶A-二硫還原酶 12000U/L
乙酰-輔酶A 4mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)
試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)甲醛樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)?br> 正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出甲醛的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的甲醛測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
乙酰-輔酶A 4mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 甲醛脫氫酶 10000U/L 甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶 12000U/L 輔酶A-二硫還原酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. 1，測(cè)
試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)甲醛樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，
反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出甲醛的濃度大小。 實(shí)施例三 本實(shí)施例的甲醛測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3,1/L
乙酰-輔酶A 4mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶 12000U/L
輔酶A-二硫還原酶 12000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 甲醛脫氫酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定甲醛濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始
吸光度《0. 1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)甲醛樣品與試劑1、試劑2、試劑3
的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)
時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出甲醛的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類(lèi)同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0007 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)15mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確 度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±3% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 180±0. 009 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本 發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法的甲醛的濃度測(cè)定方法，其方法如下甲醛+輔酶+水 甲醛脫氫酶 甲酸+還原型輔酶甲酸+乙酰-輔酶A甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶輔酶A+丙酮酸2輔酶A+輔酶輔酶A-二硫還原酶輔酶A-二硫+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，測(cè)算出甲醛的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種甲醛測(cè)定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶甲醛脫氫酶 甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶 輔酶A- 二硫還原酶 乙酰_輔酶A-500,1/L20——1-4000mmol/L1-6mmol/L1000-80000U/L1000-80000U/L1000-80000U/L1--50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲醛測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶、乙 酰-輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲醛測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶、乙酰_輔酶A組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰_輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶組成。輔酶、甲醛脫 氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶、乙酰_輔酶A在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲醛測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶、乙酰_輔酶A組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰_輔酶A組成；試劑2，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、甲酸C-乙酰基轉(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 甲醛脫氫酶組成。輔酶、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙?；D(zhuǎn)移酶、輔酶A- 二硫還原酶、乙酰-輔 酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲醛測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmo1/ L或O. 1%_100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙 二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的甲醛測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定甲醛濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、乙酰-輔酶A、甲醛脫氫酶、甲酸C-乙酰基轉(zhuǎn)移酶、輔酶A-二硫還原酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度，從而測(cè)算出甲醛的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N35/00GK101793786SQ20091002855
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司