專利名稱：具有單讀出的通用激酶/磷酸酶測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)激酶或磷酸酶活性的通用測(cè)定法及其在生命科學(xué)和藥物發(fā) 現(xiàn)中的用途。
背景技術(shù)：
在最近數(shù)年中，已經(jīng)開發(fā)出用于體外藥理學(xué)和高通量篩選(HTS)的檢測(cè)肽或蛋白 的磷酸化(激酶活性)或去磷酸化(磷酸酶活性)的數(shù)種方法。對(duì)于這些應(yīng)用而言，最吸 引人的是具有熒光讀出(readout)的檢測(cè)方法，它們?yōu)閯蛳嗟?、混合并度量的測(cè)定法，因此 適用于微型化。常用測(cè)定法基于特異性抗體與磷酸基團(tuán)的結(jié)合，但是由于針對(duì)磷酸絲氨酸 或磷酸蘇氨酸的抗體是序列特異性的，所以基于抗體的測(cè)定法不是通用性的?；诠潭ɑ?金屬離子親和力的測(cè)定法(IMAP)是無(wú)需抗體的，因此是通用性的。另一種用于檢測(cè)激酶活 性的通用測(cè)定法是測(cè)量ADP產(chǎn)量的Transcreener測(cè)定法。在所有這些測(cè)定法中，激酶/磷 酸酶活性的檢測(cè)是基于熒光偏振(FP)或熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET、TR-FRET、HTRF)。但是，這些熒光測(cè)量法需要有關(guān)不同光參數(shù)的多個(gè)讀出，所述光參數(shù)例如偏振、波 長(zhǎng)、延時(shí)型檢測(cè)(需要更復(fù)雜的儀器操作而不是簡(jiǎn)單的熒光強(qiáng)度測(cè)量)。ADP測(cè)定法僅適用 于高ATP/ADP濃度和高轉(zhuǎn)換的酶，并且可能很容易跑出線性的反應(yīng)范圍。而且，這種檢測(cè)僅 僅是間接的，因?yàn)楸O(jiān)控的是ATP/ADP消耗，而這種消耗可能不是特異性的，不是特定磷酸酶 或激酶底物的(去_)磷酸化。因此，需要改良的通用激酶和磷酸酶測(cè)定法，其允許激酶或磷酸酶活性的有效檢 測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)激酶活性或磷酸酶活性的方法，其通過穩(wěn)健且 可靠的熒光讀出實(shí)現(xiàn)這種需要。該方法包括以下步驟a)孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含具有可檢測(cè)讀出的熒光團(tuán)的激酶或磷酸酶 底物分子，b)孵育步驟a)的混合物與包含芳族基的檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體(binding partner)，其中磷酸化底物分子和檢測(cè)實(shí)體能與結(jié)合配偶體結(jié)合，并且底物分子和檢測(cè)實(shí) 體與結(jié)合配偶體的結(jié)合產(chǎn)生改變的熒光團(tuán)讀出，和c)測(cè)量步驟b)的混合物中的熒光團(tuán)讀出，其中與空白相比改變的熒光團(tuán)讀出指 示樣品中激酶或磷酸酶活性的存在。第二目的，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)激酶活性或磷酸酶活性的方法。所述方法包括以 下步驟a)孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含芳族基的底物分子，b)孵育步驟a)的混合物與包含具有可檢測(cè)讀出的熒光團(tuán)的檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶
4體，其中磷酸化底物分子和檢測(cè)實(shí)體可與結(jié)合配偶體結(jié)合，并且底物分子和檢測(cè)實(shí)體與結(jié) 合配偶體的結(jié)合產(chǎn)生改變的熒光團(tuán)讀出，和c)測(cè)量步驟b)的混合物中的熒光團(tuán)讀出，其中與空白相比改變的熒光團(tuán)讀出指 示樣品中激酶或磷酸酶活性的存在。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，熒光團(tuán)選自由熒光素(Fluorescein)、羅丹明 B (Rhodamine B)、四甲基羅丹明(Tetramethylrodamine)、ATTO 590、ATT0 655, ATTO 680、 Atto 700,MR 121、Bodipy 630/650和Bodipy FL組成的組。優(yōu)選的熒光團(tuán)選自由MR 121、 ATTO 590、ATT0 655、Atto 680和ATTO 700組成的組。用于本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的熒光 團(tuán)是MR 121和Atto 700。這些熒光團(tuán)中的一些的分子結(jié)構(gòu)可在Bioconjugate Chem. 2003, 14，1133-1139 中發(fā)現(xiàn)。ATT0 分子可商業(yè)得自 Atto-Tec GmbH, Siegen, Germany 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，芳族基選自由具有芳族系統(tǒng)的氨基酸組成的組，優(yōu) 選色氨酸。用于本發(fā)明方法的其他適合的芳族基選自如cGMP或cAMP衍生物的分子。底物分子優(yōu)選為包含至少一個(gè)酪氨酸和/或絲氨酸和/或蘇氨酸的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法用于檢測(cè)酪氨酸激酶活性且底物肽包含至少一個(gè)酪 氨酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該方法用于檢測(cè)絲氨酸激酶活性且底物肽包含至少一個(gè)絲氨酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該方法用于檢測(cè)蘇氨酸激酶活性且底物肽包含至少一個(gè)蘇氨酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法用于檢測(cè)磷酸酶活性且底物分子為包含磷酸基、 優(yōu)選磷酸酪氨酸或磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸的肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該檢測(cè)實(shí)體為包含磷酸酪氨酸和/或磷酸絲氨酸和/或 磷酸蘇氨酸的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物分子和檢測(cè)實(shí)體與結(jié)合配偶體的結(jié)合牽涉離子相互作 用。優(yōu)選地，結(jié)合配偶體選自硬路易斯酸金屬離子(例如In3+)或固體如在其表面具有離 子的珠子，例如IMAP珠子。第三目的，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)激酶或磷酸酶活性的試劑盒，其包括包含具有可 檢測(cè)讀出的標(biāo)記的激酶和/或磷酸酶活性底物、檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體。第四目的，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)激酶或磷酸酶活性的試劑盒，其包括包含芳族基 的激酶和/或磷酸酶活性底物、包含具有可檢測(cè)讀出的標(biāo)記的檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體。發(fā)明詳述如本文所用的術(shù)語(yǔ)“激酶活性”是指激酶對(duì)底物的磷酸化。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“磷酸酶活性”是指磷酸酶對(duì)底物的去磷酸化。如本文所用的“熒光團(tuán)”是指使分子具有熒光的分子的組分。它是分子中的官能 團(tuán)，可吸收特定波長(zhǎng)的能量并以不同(但同樣地為特定的)波長(zhǎng)再發(fā)射。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“底物分子”是指由激酶或磷酸酶修飾的分子。如本文所用的“檢測(cè)實(shí)體”是指攜帶具有可檢測(cè)讀出的標(biāo)記(例如熒光團(tuán))的分 子或包含芳族基、例如酪氨酸、色氨酸、cGMP、cAMP衍生物的分子。如本文所用的“結(jié)合配偶體”是指能結(jié)合磷酸化底物分子和檢測(cè)實(shí)體兩者的實(shí)體，例如分子。本發(fā)明描述了通用的激酶/磷酸酶測(cè)定法，其基于以下事實(shí)熒光團(tuán)如噁嗪染料MR121或Atto 700可以被含有芳族基如色氨酸的分子有效地淬滅，形成非熒光基態(tài)復(fù)合 物。觀點(diǎn)就是通過包含芳族基的實(shí)體和熒光團(tuán)實(shí)體與結(jié)合配偶體的結(jié)合，使含有芳族基的 實(shí)體和熒光團(tuán)緊靠，以致于可以通過分子軌道的直接相互作用一或者通過非熒光基態(tài)復(fù) 合物的形成(“靜態(tài)淬滅”)或通過碰撞淬滅(“動(dòng)態(tài)淬滅”)一而發(fā)生淬滅。與現(xiàn)有淬滅測(cè)定法比較，這種淬滅機(jī)制比偶極_偶極相互作用如熒光共振能量轉(zhuǎn) 移技術(shù)(FRET)的優(yōu)勢(shì)在于相互作用長(zhǎng)度短得多，淬滅僅在非常高的局部濃度(通常為 mM)發(fā)生。對(duì)于能量轉(zhuǎn)移，需要供體與受體之間的光譜重疊。當(dāng)受體游離于溶液中時(shí)，這意 味著具有兩個(gè)適宜分子的雙重標(biāo)記和對(duì)供體發(fā)射的剩余光吸收?？傮w上說，由此描述的更 有利的淬滅系統(tǒng)導(dǎo)致更少的非_特異性信號(hào)和更高的靈敏度。芳族基和熒光團(tuán)中的一個(gè)是所研究的激酶或磷酸酶活性的底物肽的一部分，而另 一個(gè)是檢測(cè)實(shí)體的一部分。結(jié)合配偶體結(jié)合磷酸化的底物肽和檢測(cè)實(shí)體但不結(jié)合未磷酸化 的底物肽，由此可以通過熒光團(tuán)讀出(熒光強(qiáng)度)的減少測(cè)量激酶活性，而磷酸酶活性導(dǎo)致 熒光團(tuán)讀出(熒光強(qiáng)度)的增加。熒光團(tuán)讀出可以是例如熒光強(qiáng)度、熒光偏振、發(fā)射波長(zhǎng)分 布或熒光壽命。結(jié)合配偶體是能夠結(jié)合磷酸基團(tuán)的實(shí)體，優(yōu)選硬路易斯酸金屬離子(例如In3+) 或在表面上具有離子的固體如珠子(例如IMAP珠子)，或類似物。

圖1針對(duì)用適宜的熒光團(tuán)(例如MR121或Atto 700)標(biāo)記的示例性激酶底物和包 含磷酸基和色氨酸的檢測(cè)實(shí)體，顯示了測(cè)定法原理。底物被激酶磷酸化。當(dāng)生物化學(xué)反應(yīng) 完成時(shí)，加入結(jié)合配偶體和檢測(cè)實(shí)體，然后測(cè)量熒光。被磷酸化的底物越多，檢測(cè)到的熒光 越少。穩(wěn)健且靈敏的熒光讀出和簡(jiǎn)單易行的操作方案使本發(fā)明的測(cè)定法也適于進(jìn)行測(cè) 定法的微型化(例如在高密度微量滴定板中)或適于在微流體系統(tǒng)中進(jìn)行處理和讀出。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了通用測(cè)定法的原理。熒光標(biāo)記的底物(用例如MR121或Atto 700標(biāo)記) 被激酶磷酸化。為了檢測(cè)磷酸化的底物，將結(jié)合配偶體和含有磷酸基和色氨酸的檢測(cè)實(shí)體 加入至底物。磷酸化底物和檢測(cè)實(shí)體都與結(jié)合配偶體結(jié)合，導(dǎo)致色氨酸對(duì)熒光的淬滅；圖2顯示了在InCl3的存在下MR121( □)和Atto 700(口)熒光的減少。將 20nM MR121-CGpY 或 Atto 700-CGpY 與 1 μ M WGpY 和不同濃度的 InCl3 混合，測(cè)量MR121 和 Atto 700熒光。對(duì)于MR121實(shí)體在40 μ Μ-60 μ MInCl3時(shí)達(dá)到最高淬滅(初始MR121熒光 的20%)，對(duì)于Atto 700實(shí)體則在10 μ Μ-100 μ M時(shí)達(dá)到最高淬滅(初始Atto 700熒光的 15% ) (b)；圖 3 顯示了在恒定的 MR121-CGpY 和 InCl3 濃度(20nMMR121_CGpY，50 μ M InCl3) 時(shí)WGpY的滴定。在700nM WGpY時(shí)達(dá)到最高淬滅；圖 4 顯示了在恒定的 WGpY 和 InCl3 濃度(800nM WGpY, 50 μ MInCl3)時(shí) MR121_CGpY 的滴定；圖5顯示了通過相應(yīng)地混合MR121-CGpY和MR121-CGY，MR121-CGY肽的O %至 100%磷酸化。800nM WGpY和50 μ M InCl3用作檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體。熒光強(qiáng)度隨著磷酸化的增加而減至初始熒光的20%。對(duì)于>20%的磷酸化，z'因子(十字形)高于0.5， 對(duì)于> 40%的磷酸化，高于0. 7 ；和圖6顯示了在恒定的MR121_CGpY濃度(20nM終濃度)時(shí)WGpY(a)和IMAP珠子(b) 的滴定。對(duì)于(a)，IMAP珠子的稀釋度為1 1000，對(duì)于(b)，WGpY的終濃度為80 y M。熒 光強(qiáng)度隨著WGpY濃度的增加而減至初始強(qiáng)度的20% (在80 y M WGpY時(shí))。珠子稀釋度為 1 500或1 1000時(shí)，熒光強(qiáng)度同等地被淬滅至初始強(qiáng)度的20%，珠子稀釋度更高，淬滅 效率越低。
實(shí)施例材料與方法所有肽底物由Biosyntan GmbH，Berlin合成，純度為95 %。熒光團(tuán)MR121的活 性形式由 Roche Diagnostics，Penzberg 提供，Atto 700 的活性形式由 Atto-Tec GmbH, Sieger^Germany提供。按照用馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記底物的標(biāo)準(zhǔn)操作方案，內(nèi)部完成MR121-馬來(lái) 酰亞胺和Atto 700-馬來(lái)酰亞胺與底物肽的半胱氨酸殘基的巰基的共價(jià)偶合，然后經(jīng)使用 C18 柱(Marchery-Nagel，ccl25/4，Nucleosil 100-5，保護(hù) 1)的分析型 HPLC (MerckHitachi D-6000)純化。當(dāng)InCl3(Sigma-AldriCh Co.，目錄號(hào)303440)用作結(jié)合配偶體時(shí)，反應(yīng)緩沖液為 pH 5. 2 的 lOOmM NaAc/HAc (無(wú)水 NaAc，> 99%，S8750，Sigma-Aldrich Co.)。當(dāng) IMAP 珠子 作為結(jié)合配偶體時(shí)，緩沖液為隨著IMAP試劑盒(Molecular Devices, 13110rleans Drive, Sunnyvale, CA 94089)提供的80% lx IMAP結(jié)合緩沖液A和20% lx IMAP結(jié)合緩沖液B。 對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)而言，將10 Pi色氨酸實(shí)體、10 yl熒光團(tuán)實(shí)體和20 yl結(jié)合配偶體混合，得到 40 u 1的總測(cè)定體積。在讀熒光強(qiáng)度之前，在RT將板于暗處孵育60分鐘。所有測(cè)量在384 孔微量滴定板(Cornig B. V.，Koolhovenlaan 12， 1119Schiphol-Rijk, Netherlands，編號(hào)3723，通用光學(xué)板，透明，非結(jié)合表面)中進(jìn)行。 借助于裝備有高壓Xe弧光燈的板視覺多功能讀出器(EvotecTechnologies GmbH, Schnackenburgallee 114，22525Hamburg，Germany)，對(duì)于 MR121 使用 630nm (帶寬 50nm)的 激發(fā)濾光片和695nm(帶寬55歷)的發(fā)射濾光片、對(duì)于Atto 700使用655nm(帶寬50歷)的 激發(fā)濾光片和710nm(帶寬40nm)的發(fā)射濾光片，進(jìn)行所有熒光強(qiáng)度測(cè)量。通過使用衰減濾 光片以及改變暴露時(shí)間，將熒光強(qiáng)度調(diào)至所用CCD照相機(jī)的最大信號(hào)的約60%。結(jié)果A. InCl3作為結(jié)合配偶體P032_是硬路易斯堿，并與硬路易斯酸金屬離子形成復(fù)合物。磷酸基的氧可與單個(gè) 金屬離子配位或與一些金屬離子交聯(lián)以形成聚合物型復(fù)合物。因此，硬路易斯酸金屬離子 可用作結(jié)合配偶體，使熒光團(tuán)實(shí)體和色氨酸實(shí)體密切靠近以形成非熒光基態(tài)復(fù)合物。對(duì)于 原理的驗(yàn)證，使用分別含有磷酸酪氨酸、酪氨酸和/或色氨酸的短肽作為熒光團(tuán)_和色氨酸 實(shí)體。使用在Cys殘基用MR121和Atto 700標(biāo)記的序列Cys-Gly-Tyr的磷酸化和未磷酸化 肽作為熒光團(tuán)實(shí)體(此后稱為 MR121-CGY，MR121-CGpY, Atto700_CGY 和 Atto 700-CGpY)， 檢測(cè)實(shí)體為序列Trp-Gly-pTyr的肽(此后稱為WGpY)，其中pTyr為磷酸化酪氨酸。圖2 顯示了在固定的 MR121-CGpY 或 Atto 700-CGpY 和 WGpY 濃度(終濃度MR121_CGpY 20nM,
7Atto700-CGpY 20nM, WGpY 1 u M)時(shí)對(duì) InCl3 作為結(jié)合配偶體的滴定。在 50 ii M-100ii M InC13的存在下MR121的熒光發(fā)射被淬滅至初始MR121熒光(在缺少InC13時(shí)的熒光)的 20%。隨著更高的InCl3濃度，MR121熒光增至初始MR121熒光的70% (圖2a)，表明MR121 實(shí)體和色氨酸實(shí)體不再與相同的In-復(fù)合物結(jié)合。圖2b顯示了對(duì)10 ii M至140 ii M InCl3 的放大，以尋找最佳InCl3濃度。在10iiM 11^13時(shí)々《0 700熒光已經(jīng)被淬滅至其初始熒光 的15%。與MR121實(shí)體相同，Atto 700熒光隨著更高的InCl3濃度而再次增加。用50 y M InCljnMR121實(shí)體進(jìn)行所有隨后的試驗(yàn)。在下一步驟，對(duì)WGpY濃度進(jìn)行優(yōu)化。圖3顯示了 在 20nM MR121-CGpY (終濃度)禾口 50 ii M InCl3 (終濃度)時(shí) WGpY 的滴定。在 700nM WGpY 時(shí) 熒光強(qiáng)度達(dá)到其最小值(圖3b)。隨著MR121-CGpY濃度升高，熒光強(qiáng)度略微增加(從20nM 時(shí)的30%初始強(qiáng)度至lOOnm時(shí)的45% )(圖4)。在終實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量0% -100%底物磷酸化 的熒光強(qiáng)度(圖5)。將MR121-CGpY和MR121-CGY相應(yīng)地混合，以隨著磷酸化肽的增加，得 到20nMMR121-CG(p)Y終濃度。800nM WGpY用作檢測(cè)實(shí)體，50 ii M InC13用作結(jié)合配偶體。 熒光強(qiáng)度隨著磷酸化增加而線性減少，從初始強(qiáng)度的100%至20%。作為該測(cè)定法的質(zhì)量 的量度，計(jì)算了 z'因子。自20%磷酸化起z'因子高于0.5 (理論最大值1)，自40%起高 于 0. 7。B. IMAP珠子作為結(jié)合配偶體對(duì)于IMAP珠子作為結(jié)合配偶體的實(shí)驗(yàn)而言，與InCl3作為結(jié)合配偶體時(shí)相同的短 模型肽用作MR121和色氨酸實(shí)體。IMAP珠子具有 lOOnM的直徑，顯著大于In3+離子，因 此必需高4倍的WGpY濃度以實(shí)現(xiàn)MR121實(shí)體的良好淬滅。盡管在需要更高試劑濃度這一 意義上IMAP珠子不如InCl3，但是此新的靈敏測(cè)定法允許該系統(tǒng)用作結(jié)合配偶體。圖6a顯 示了在IMAP珠子稀釋成1 1000時(shí)20nM MR121_CGpY的強(qiáng)度隨著WGpY濃度升高而減少。 在80iiM WGpY時(shí)，MR121熒光淬滅至初始強(qiáng)度的20%。在80 y M WGpY的恒定濃度時(shí)，稀釋 度更高的IMAP珠子不導(dǎo)致更好的淬滅(圖6b)，最佳稀釋度在1 500與1 1000之間。結(jié)論用本文所述的實(shí)施例，我們論述了激酶或磷酸酶活性可通過測(cè)量適宜熒光團(tuán)(例 如MR121，Atto 700)的熒光強(qiáng)度的減少(激酶)或增加(磷酸酶)而進(jìn)行檢測(cè)。色氨酸對(duì) 熒光團(tuán)的淬滅是通過非熒光基態(tài)復(fù)合物的形成而發(fā)生的靜態(tài)淬滅或碰撞淬滅，該淬滅是一 個(gè)短程相互作用，其確保只有在熒光團(tuán)實(shí)體和色氨酸實(shí)體與結(jié)合配偶體結(jié)合時(shí)才發(fā)生。這 與常規(guī)FRET測(cè)量相反，F(xiàn)RET測(cè)量中在高濃度的熒光團(tuán)時(shí)未與結(jié)合配偶體結(jié)合也可發(fā)生受 體對(duì)供體發(fā)射的吸收。類似于FP測(cè)量，此處描述的淬滅測(cè)定法需要僅一個(gè)標(biāo)記，但是在FP 中需要兩個(gè)讀出，而該熒光淬滅測(cè)量?jī)H需要單讀出。穩(wěn)健且靈敏的熒光讀出和操作方案的 簡(jiǎn)單易行使本測(cè)定法還適用于例如在高密度微量滴定板中進(jìn)行或在微流體系統(tǒng)中的處理 和讀出。因?yàn)樗玫臒晒鈭F(tuán)例如MR121和Atto 700在紅光中激發(fā)，而在近紅外中熒光發(fā) 射，所以它已被證明非常靈敏并顯示受到例如化合物、生物材料和塑料的自身熒光的干擾 最低。三種組分_熒光團(tuán)實(shí)體、色氨酸實(shí)體和結(jié)合配偶體_可彼此滴定以找到每一測(cè)定試 驗(yàn)的最佳條件，從而提供獨(dú)特的靈活性。盡管已經(jīng)列出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是應(yīng)清楚地理解，本發(fā)明并不 限于此，而是可在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)另外進(jìn)行各種變更和實(shí)踐。
權(quán)利要求
檢測(cè)激酶活性或磷酸酶活性的方法，其包括以下步驟a)孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含具有可檢測(cè)讀出的熒光團(tuán)的激酶或磷酸酶底物分子，b)孵育步驟a)的混合物與包含芳族基的檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體，其中磷酸化底物分子和檢測(cè)實(shí)體能與結(jié)合配偶體結(jié)合，并且底物分子和檢測(cè)實(shí)體與結(jié)合配偶體的結(jié)合導(dǎo)致改變的熒光團(tuán)讀出，和c)測(cè)量步驟b)的混合物中的熒光團(tuán)讀出，其中與空白相比改變的熒光團(tuán)讀出指示樣品中激酶或磷酸酶活性的存在。
2.檢測(cè)激酶活性或磷酸酶活性的方法，其包括以下步驟a)孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含芳族基的底物分子，b)孵育步驟a)的混合物與包含具有可檢測(cè)讀出的熒光團(tuán)的檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體， 其中磷酸化底物分子和檢測(cè)實(shí)體能與結(jié)合配偶體結(jié)合，并且底物分子和檢測(cè)實(shí)體與結(jié)合配 偶體的結(jié)合導(dǎo)致改變的熒光團(tuán)讀出，和c)測(cè)量步驟b)的混合物中的熒光團(tuán)讀出，其中與空白相比改變的熒光團(tuán)讀出指示樣 品中激酶或磷酸酶活性的存在。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中熒光團(tuán)選自由熒光素、羅丹明B、TMR、ATT0590、ATT0 655、ATT0 680、Atto 700、MR 121、Bodipy 630/650 和 Bodipy FL 組成的組，更優(yōu)選選自由 ATTO 590、ATT0 655、ATT0 680、Atto 700 和 MR 121 組成的組。
4.權(quán)利要求3的方法，其中熒光團(tuán)為MR121或Atto 700。
5.權(quán)利要求1-4的方法，其中芳族基選自由氨基酸——色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸組 成的組，優(yōu)選色氨酸。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其中底物分子和檢測(cè)實(shí)體與結(jié)合配偶體的結(jié)合涉及離子相互 作用。
7.權(quán)利要求1-6的方法，其中結(jié)合配偶體選自硬路易斯酸金屬離子或在其表面具有離 子的固體如珠子。
8.權(quán)利要求1-7的方法，其中檢測(cè)實(shí)體為包含磷酸酪氨酸和/或磷酸絲氨酸和/或磷 酸蘇氨酸的肽。
9.權(quán)利要求1-8的方法，其中底物分子為包含至少一個(gè)酪氨酸和/或色氨酸和/或蘇 氨酸的肽。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述方法用于檢測(cè)酪氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一個(gè)酪氨酸。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述方法用于檢測(cè)色氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一個(gè)色氨酸。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述方法用于檢測(cè)蘇氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一個(gè)蘇氨酸。
13.權(quán)利要求1-9的方法，其中所述方法用于檢測(cè)磷酸酶活性且所述底物分子為包含 磷酸基、優(yōu)選磷酸酪氨酸或磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸的肽。
14.權(quán)利要求1-13的方法，其中所述熒光團(tuán)讀出為熒光強(qiáng)度。
15.用于檢測(cè)激酶或磷酸酶活性的試劑盒，其包括包含具有可檢測(cè)讀出的熒光團(tuán)的激酶和/或磷酸酶活性底物、檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體。
16.用于檢測(cè)激酶或磷酸酶活性的試劑盒，其包括包含芳族基的激酶和/或磷酸酶活 性底物、包含具有可檢測(cè)讀出的熒光團(tuán)的檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體。
17.基本上如前文所述、尤其參考前面的實(shí)施例描述的方法和試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)激酶或磷酸酶活性的通用方法。該方法包括以下步驟孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含具有可檢測(cè)讀出的熒光團(tuán)或具有充當(dāng)熒光團(tuán)淬滅劑的芳族基的分子的激酶或磷酸酶底物分子，孵育步驟a)的混合物與包含熒光團(tuán)或具有芳族基的分子的檢測(cè)實(shí)體和結(jié)合配偶體，其中底物分子和檢測(cè)實(shí)體能與結(jié)合配偶體結(jié)合，并且底物分子和檢測(cè)實(shí)體與結(jié)合配偶體的結(jié)合導(dǎo)致改變的熒光團(tuán)讀出，以及測(cè)量步驟b)的混合物中的熒光團(tuán)讀出，其中與空白相比改變的熒光團(tuán)讀出指示樣品中激酶或磷酸酶活性的存在。
文檔編號(hào)G01N33/542GK101802214SQ200880106373
公開日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2008年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月10日
發(fā)明者D·羅特, T·恩德勒 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司