專利名稱：用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測微生物的引物和探針。
背景技術(shù)：
硫酸鹽還原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)是一類與硫酸鹽還原反應(yīng)相關(guān)的細(xì)菌的總稱。由革蘭氏陰性菌(如脫硫弧菌屬Desulfovibrio，脫硫桿菌屬Desulfobacterium)、革蘭氏陽性菌(脫硫腸狀菌屬Desulfotomaculum)、嗜熱細(xì)菌(熱脫硫菌屬Thermodesulfobacterium)和嗜熱古細(xì)菌(古生球菌屬Archaeoglobus)等多種微生物構(gòu)成。
SRB菌通過一系列復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)將硫酸鹽還原成H2S和大量的硫化物，硫化物和H2S不僅腐蝕油田生產(chǎn)設(shè)備；而且其腐蝕產(chǎn)物(金屬硫化物)不溶于水，導(dǎo)致污水發(fā)黑、懸浮固體含量增加，使處理后水中懸浮固體含量超標(biāo)，嚴(yán)重的危害了油田的正常生產(chǎn)。因此，快速定量檢測硫酸鹽還原菌對(duì)于油田水質(zhì)檢測和地面系統(tǒng)殺菌劑濃度的合理調(diào)節(jié)具有重要的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。但是，目前SRB菌的定量檢測方法(如絕跡稀釋法等)存在檢測時(shí)間長、非特異性高、檢測結(jié)果偏低的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前SRB菌的定量檢測方法存在檢測時(shí)間長、非特異性高、檢測結(jié)果偏低的缺陷，而提供的用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針。
用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針由報(bào)告熒光基團(tuán)、淬滅熒光基團(tuán)和探針基因序列組成；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)是FAM，探針基因序列3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)是TAMRA。
SO42-/SO32-的氧化還原電位太低，致使硫酸根(或亞硫酸根)不能直接接受電子，因此硫酸根(或亞硫酸根)離子的還原首先需要硫酸根(或亞硫酸根)離子活化。在硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的作用下硫酸鹽還原菌以ATP為代價(jià)將硫酸根離子激活，經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)生成H2S。所以，腺苷酰硫酸還原酶(adenosine-5′-phosphosulfate reductase，APS)是硫酸鹽還原菌還原硫酸鹽生成H2S的關(guān)鍵酶。腺苷酰硫酸還原酶是一種寡聚鐵硫黃素蛋白，含有一分子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和12個(gè)原子的鐵和不穩(wěn)定硫；APS基因在硫酸鹽還原菌中具有保守性結(jié)構(gòu)框架，APS蛋白結(jié)構(gòu)中包含有典型的硫酸鹽-亞硝酸鹽還原酶的保守框架CP-Xn-C-X2-C-X2-C框架，能與[4Fe4S]結(jié)合，是SRB菌共有的一個(gè)穩(wěn)定靶位點(diǎn)；所以，本發(fā)明根據(jù)腺苷酰硫酸還原酶基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了具有特異性的引物和熒光探針。本發(fā)明引物和熒光探針特異性高，在引物和熒光探針的雙重作用下假陽性大幅降低。使用本發(fā)明的引物和熒光探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測硫酸鹽還原菌，檢測時(shí)間短、從樣本的模板DNA提取到熒光定量PCR檢測全過程僅需6h。


圖1是具體實(shí)施方式
四中以pGEM-T-DSR為底物的PCR擴(kuò)增曲線圖，圖1中曲線①模板濃度為5.65×107copies/μL的PCR擴(kuò)增曲線，②模板濃度為5.65×106copies/μL的PCR擴(kuò)增曲線，③模板濃度為5.65×105copies/μL的PCR擴(kuò)增曲線，④模板濃度為5.65×104copies/μL的PCR擴(kuò)增曲線，⑤模板濃度為5.65×103copies/μL的PCR擴(kuò)增曲線，⑥模板濃度為0 copies/μL的PCR擴(kuò)增曲線；圖2是具體實(shí)施方式
四中硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列(FP)為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列(RP)為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
本實(shí)施方式檢測引物根據(jù)APS基因在硫酸鹽還原菌中具有的保守性結(jié)構(gòu)框架而特異性設(shè)計(jì)、合成。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針由報(bào)告熒光基團(tuán)、淬滅熒光基團(tuán)和探針基因序列組成；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)是FAM，探針基因序列3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)是TAMRA。
本實(shí)施方式熒光探針的基因序列根據(jù)APS基因在硫酸鹽還原菌中具有的保守性結(jié)構(gòu)框架而特異性設(shè)計(jì)、合成。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式采用熒光定量PCR法檢測硫酸鹽還原菌1、設(shè)計(jì)、合成檢測引物和熒光探針根據(jù)APS基因在硫酸鹽還原菌中具有的保守性結(jié)構(gòu)框架設(shè)計(jì)、合成特異性引物和熒光探針。上游引物基因序列(FP)為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列(RP)為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)是FAM，探針基因序列3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)是TAMRA。引物和熒光探針的合成由生物工程公司完成。
2、引物和熒光探針檢驗(yàn)(1)制備標(biāo)準(zhǔn)品(硫酸鹽還原菌)基因片段。標(biāo)準(zhǔn)品基因片段PCR反應(yīng)體系(20μL)為硫酸鹽還原菌模板基因20ng，TagDNA聚合酶終濃度為0.3U，4種dNTP各0.3mmol/L，標(biāo)準(zhǔn)品上游引物(基因序列為5’-GGGYCTKTCCGCYATCAAYAC-3’)0.1μmol/L，標(biāo)準(zhǔn)品下游引物(基因序列為5’-GCACATGTCGAGGAAGTCTTC-3’)0.1μmol/L和余量的去離子水。標(biāo)準(zhǔn)品PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)熱5min，94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。
TagDNA聚合酶購自于寶生物工程(大連)有限公司。
(2)連接、轉(zhuǎn)化。將上一步(步驟2(1))得到的PCR產(chǎn)物(標(biāo)準(zhǔn)品基因片段)用明膠回收試劑盒(寶泰克)切膠回收，然后與pGEM-T載體連接，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中。
pGEM-T購自于美國Promega公司，大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自于北京天為時(shí)代科技有限公司。
(3)藍(lán)白斑篩選。在加入氨芐青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。
(4)檢測陽性質(zhì)?；蛐蛄小Ｌ崛“咨|(zhì)?；?，再用pGEM-T載體引物T7和SP6擴(kuò)增，并測序。質(zhì)?；蛱崛∈褂蒙虾ＨA舜生物有限公司出品的DNA小量細(xì)菌提取試劑盒，基因測序工作由生物工程公司完成，質(zhì)粒中插入序列為921bp，如SEQ ID NO4所示。
3、硫酸鹽還原菌熒光定量檢測靈敏度檢測和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(1)檢測pGEM-T-DSR的濃度。
(2)換算為拷貝數(shù)。拷貝數(shù)換算公式為

拷貝數(shù)換算公式中C為pGEM-T-DSR的濃度，單位μg/μL；載體和目的片段的單位bp。
(3)質(zhì)粒溶液(10×)梯度稀釋。以稀釋后的質(zhì)粒溶液為模板，以水為對(duì)照組，以FP、RP為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測。在實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的40個(gè)循環(huán)結(jié)束后，利用分析軟件Opticon Monitor2.02，根據(jù)輸入的模板量和產(chǎn)生的熒光信號(hào)，計(jì)算出硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、硫酸鹽還原菌實(shí)時(shí)檢測(1)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系(25μL)，如表1所示。
表1

并在孔板上設(shè)陰性對(duì)照，以水為對(duì)照樣。
(2)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)程序95℃預(yù)變性5min，94℃變性5s，60℃退火溫度30s，72℃延伸45s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸2min；溫度轉(zhuǎn)換率為20℃/s。在每個(gè)循環(huán)的60℃(退火)時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測。
(3)檢測結(jié)果判定陽性對(duì)照中CT值(域值循環(huán)數(shù))小于28，陽性樣品中擴(kuò)增曲線明顯；陰性對(duì)照CT值大于35，陰性對(duì)照中無擴(kuò)增曲線。
本實(shí)施方式步驟4中油田污泥或污水污泥樣品按以下步驟獲得(一)1mL污泥震蕩5min，然后在3000r/min的條件下離心3～5min，留上清液；(二)加入上清液2倍體積的10×PBS進(jìn)行洗滌，震蕩5min，然后在12000r/min的條件下離心5min，去掉上清液；(三)加入10×PBS緩沖液100μL，然后超聲波40s；(四)用上海華舜生物有限公司出品的DNA小量細(xì)菌提取試劑盒進(jìn)行后續(xù)的DNA提取。
本實(shí)施方式陽性質(zhì)粒中插入的基因序列中589bp～608bp與本實(shí)施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列一致；陽性質(zhì)粒中插入的基因序列中805bp～821bp與本實(shí)施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的下游引物基因序列一致；陽性質(zhì)粒中插入的基因序列中734bp～753bp與本實(shí)施方式用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針的基因序列一致。
本實(shí)施方式采用美國MJ公司生產(chǎn)的MJResearch Opticon TM2實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR。
根據(jù)熒光定量PCR儀測出的數(shù)據(jù)和硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線可以定量的計(jì)算出樣品中硫酸鹽還原菌的數(shù)量。本實(shí)施方式檢測記數(shù)更加準(zhǔn)確，假陽性大幅降低。本實(shí)施方式檢測結(jié)果僅需要6個(gè)小時(shí)，大大節(jié)省了檢測時(shí)間，在油田實(shí)際生產(chǎn)中更具有實(shí)際指導(dǎo)意義。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式采用熒光定量PCR法檢測硫酸鹽還原菌，與具體實(shí)施方式
三的不同點(diǎn)是步驟3(1)中經(jīng)檢測pGEM-T-DSR的濃度為5.65×107copies/μL。
步驟3(3)質(zhì)粒溶液(10×)梯度稀釋。以稀釋后的質(zhì)粒溶液為模板，以水為對(duì)照組，以FP、RP為引物，進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，并由計(jì)算機(jī)繪制出以pGEM-T-DSR為底物的PCR擴(kuò)增曲線圖(如圖1所示)。圖1中從左至右6條曲線依次是模板濃度為5.65×107copies/μL、5.65×106copies/μL、5.65×105copies/μL、5.65×104copies/μL、5.65×103copies/μL和0 copies/μL(對(duì)照組)的PCR擴(kuò)增曲線。在實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的40個(gè)循環(huán)結(jié)束后，利用分析軟件Opticon Monitor2.02，根據(jù)輸入的模板量和產(chǎn)生的熒光信號(hào)，計(jì)算出硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式三相同。
本實(shí)施方式硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線公式Y(jié)＝-0.30X+11.21；相關(guān)系數(shù)為r2＝0.999。結(jié)果表明，樣品拷貝數(shù)與其相應(yīng)的CT值具有良好的相關(guān)性，可用于硫酸鹽還原菌的定量檢測。
本實(shí)施方式與常規(guī)檢測方法絕跡稀釋法(most probable number，MPN)-Griess法檢測結(jié)果進(jìn)行比較，兩種檢測方法的檢測結(jié)果如表2所示。
表2

檢測結(jié)果說明本實(shí)施方式檢測方法的檢測精度比常規(guī)方法(絕跡稀釋法)提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
序列表<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物，根據(jù)APS基因在硫酸鹽還原菌中的保守性結(jié)構(gòu)框架而設(shè)計(jì)。
<400>1cgctgaaatg accatgatgg 20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于檢測硫酸鹽還原菌的下游引物，根據(jù)APS基因在硫酸鹽還原菌中的保守性結(jié)構(gòu)框架而設(shè)計(jì)。
<400>2cgcgcatttc acgaagc 17<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測硫酸鹽還原菌的探針基因序列，根據(jù)APS基因在硫酸鹽還原菌中的保守性結(jié)構(gòu)框架而設(shè)計(jì)。
<400>3ctgaagcctt acgaagatcg 20<210>4<211>921<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽性質(zhì)粒中插入的基因序列。
<400>4gggtctgtcc gccatcaaca cctacctggg tgaaaacgac gccgacgact acgtccgcat 60ggtccgcacc gaccttatgg gcctggttcg cgaagacctt atcttcgacg taggccgtca 120cgttgacgac tccgtgcatc tatttgaaga ttggggcctt ccctgctgga tcaagggcga 180agacggccac aacctgaacg gcgctgccgc caaggctgct ggcaagagcc tgcgcaaggg 240cgatgcccct gtgcgttccg gccgctggca gatcatgatc aacggtgaat cctacaagtg 300catcgtggcc gaagctgcca agaatgccct gggtgaagac cgcatcatgg aacgtatctt 360catcgtgaag ctgcttctcg ataagaacac ccccaaccgc atcgccggcg ccgtgggctt 420caacctgcgc gccaacgaag tgcacatctt caaagccaac accatcatgg tggccgctgg 480cggtgccgtt aacgtgtacc gtccccgctc caccggtgaa ggcatgggcc gtgcatggta 540tcctgtgtgg aacgctggtt ctacctacac catgtgcgct caggttggcg ctgaaatgac 600catgatggaa aaccgcttcg tgcccgcccg cttcaaggac ggttacggcc ccgtgggtgc 660gtggttcctc ctgttcaagg ccaaagccac taactccaag ggtgaagatt attgcgccac 720caaccgcgcc atgctgaagc cttacgaaga tcgcggctac gccaagggcc atgtcattcc 780gacctgcctg cgtaaccaca tgatgcttcg tgaaatgcgc gaaggccgcg gccccatcta 840catggacacc aagagcgccc tgcagaacac cttcgcgacc ctgaacgaag aacagcagaa 900ggatcttgaa tccgaagctt g 921<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>硫酸鹽還原菌標(biāo)準(zhǔn)品的上游引物。
<220>
<221>misc_feature<222>(4，7，13，19)<223>k＝g或t/u；y＝t/u或c<400>5gggyctktcc gcyatcaaya c 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>硫酸鹽還原菌標(biāo)準(zhǔn)品的下游引物。
<400>6gcacatgtcg aggaagtctt c 2權(quán)利要求
1.用于檢測硫酸鹽還原菌的引物，其特征在于用于檢測硫酸鹽還原菌的上游引物基因序列為5’-CGCTGAAATGACCATGATGG-3’；下游引物基因序列為5’-CGCGCATTTCACGAAGC-3’。
2.用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針，其特征在于用于檢測硫酸鹽還原菌的熒光探針由報(bào)告熒光基團(tuán)、淬滅熒光基團(tuán)和探針基因序列組成；探針基因序列為5’-CTGAAGCCTTACGAAGATCG-3’，探針基因序列5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)是FAM，探針基因序列3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)是TAMRA。
全文摘要
用于檢測硫酸鹽還原菌的引物和熒光探針，它涉及用于檢測微生物的引物和探針。它解決了目前SRB菌的定量檢測方法存在檢測時(shí)間長、非特異性高、檢測結(jié)果偏低的缺陷。上游引物5’－CGCTGAAATGACCATGATGG－3’；下游引物5’－CGCGCATTTCACGAAGC－3’。熒光探針由報(bào)告熒光基團(tuán)、淬滅熒光基團(tuán)和探針基因序列組成；探針基因序列為5’－CTGAAGCCTTACGAAGATCG－3’，探針基因序列5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)是FAM，探針基因序列3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)是TAMRA。本發(fā)明引物和熒光探針特異性高，使用本發(fā)明的引物和熒光探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測硫酸鹽還原菌，檢測時(shí)間短、從樣本的模板DNA提取到熒光定量PCR檢測全過程僅需6h。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101089195SQ20071007233
公開日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者魏利, 馬放, 李維國 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)