專利名稱：鈣結(jié)合蛋白s100a14抗體制備及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種鈣結(jié)合蛋白S100A14抗體制備及其用途的發(fā)明，涉及基因克隆、蛋白表達(dá)、抗體制備、純化，免疫細(xì)胞和組織化學(xué)染色多項技術(shù)。特別涉及鈣結(jié)合蛋白S100A14抗體制備及鑒別胃癌分化程度和臨床預(yù)后的用途。通過制備高度特異性的抗體，采用石蠟切片免疫組化和Western blot分析，鑒定S100A14在胃癌細(xì)胞和組織中的差異表達(dá)，利用S100A14抗體鑒別胃癌組織的分化程度和判斷臨床預(yù)后。
背景技術(shù)：
S100家族是一個有21個成員的鈣離子結(jié)合蛋白超家族，具有EF手形結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是一種鈣傳感器蛋白，轉(zhuǎn)導(dǎo)鈣依賴性的細(xì)胞調(diào)節(jié)信號。S100蛋白本身不具備內(nèi)源性的蛋白酶活性，與鈣結(jié)合之后，蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出疏水區(qū)，然后與不同的靶蛋白分子結(jié)合，傳遞鈣信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。通過鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞內(nèi)，主要是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞骨架裝配、基因轉(zhuǎn)錄及酶的活性。在細(xì)胞外，具有趨化活性，神經(jīng)營養(yǎng)活性，與糖基化受體RAGE結(jié)合分泌至細(xì)胞外。因此，在肌肉收縮、基因表達(dá)、激素分泌、細(xì)胞增殖、分化等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)S100家族成員在多種人類腫瘤(如乳腺癌、黑色素細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、胃癌)中表達(dá)異常，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、浸潤和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。
胃癌是我國最常見的消化道腫瘤之一，大多數(shù)就診患者為中晚期，現(xiàn)有的治療方法難以獲得滿意的療效。為了克服目前臨床上對腫瘤的盲目治療或不當(dāng)治療，建立和發(fā)展腫瘤個體化診治的新方法是改善和提高腫瘤診治水平的關(guān)鍵問題。建立胃癌的分子分型將對腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后判斷具有重要的意義。雖然有關(guān)腫瘤增殖、凋亡的標(biāo)志基因已有大量的報道，但標(biāo)志實體瘤細(xì)胞分化的基因及調(diào)控機(jī)理的報道仍然較少。
我們通過胃癌基因差異表達(dá)譜的建立和標(biāo)志基因的鑒定，發(fā)現(xiàn)S100鈣結(jié)合蛋白家族在胃癌組織中的表達(dá)有明顯的變化，其中，S100A14在胃癌組織中的表達(dá)有明顯的差異，表現(xiàn)為43.2％(16/37)的癌低表達(dá)，37.8％(14/37)的癌高表達(dá)，進(jìn)一步的實驗分析了S100A14在胃癌組織中mRNA的差異表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)S100A14在高分化癌組織的表達(dá)水平明顯高于低分化癌組織(P＝0.019)，據(jù)此，明確了S100A14在不同分化程度的胃癌組織中有明顯的差異表達(dá)，其表達(dá)水平與分化程度相關(guān)(表1)。在此基礎(chǔ)上，通過基因克隆，構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)S100A14融合蛋白并免疫動物得到S100A14多克隆抗體。采用免疫親和層析純化獲得了具有高度特異性抗體可用于石蠟切片免疫組化和Western blot。
通過大樣本的免疫組化分析，確定S100A14可用于鑒別胃癌的分化程度。進(jìn)一步對臨床資料分析結(jié)果表明，S100A14差異表達(dá)與臨床預(yù)后有關(guān)，S100A14高表達(dá)組病例5年生存率明顯高于低表達(dá)組(P＝0.02)。這一結(jié)果表明，S100A14可用于鑒別胃癌的分化程度和判斷臨床預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于確定S100A14在胃癌細(xì)胞系及組織中有明顯的差異表達(dá)，其中，S100A14的表達(dá)水平與高分化程度相關(guān)。提出鈣結(jié)合蛋白S100A14抗體制備及其鑒別胃癌分化程度和臨床預(yù)后的用途。
本發(fā)明是通過構(gòu)建了原核表達(dá)載體并獲得可溶性的S100A14融合蛋白，經(jīng)免疫動物得到高滴度的抗S100A14抗體，經(jīng)過純化獲得了具有高度特異性抗體。
進(jìn)一步，S100A14抗體可用于石蠟切片免疫組化和Western blot分析，S100A14抗體在石蠟切片免疫組化和Western blot分析中均表現(xiàn)出高度特異性，并能驗證S100A14在胃癌細(xì)胞系和組織中的差異表達(dá)。免疫組化顯示S100A14蛋白在上皮細(xì)胞膜呈強(qiáng)陽性染色，在正常胃粘膜陽性染色為48/67(71.6％)，在胃癌中陽性染色為60/125(48.0％)。Western blot結(jié)果顯示，S100A14蛋白僅在細(xì)胞系A(chǔ)GS，PAMC82和N87中表達(dá)。
進(jìn)一步，S100A14抗體可用于鑒別胃癌組織的分化程度。通過大樣本胃癌組織的免疫組化和Western blot分析，確定S100A14在高分化癌組織中表達(dá)明顯高于低分化癌組織，確定S100A14在高分化癌組織表達(dá)高，在低分化癌組織中表達(dá)低(77.5％，31/40vs 34.1％，29/85，P＜0.001)。組織Western blot結(jié)果顯示S100A14在高分化癌中的表達(dá)水平明顯高于低分化癌。
進(jìn)一步，S100A14抗體可用于判斷胃癌臨床預(yù)后。S100A14高表達(dá)組病例中位生存時間32個月(95％CI，11.95～52.05)，低表達(dá)13個月(95％CI，10.66～15.34)，S100A14高表達(dá)組病例5年生存率明顯高于低表達(dá)組。S100A14高表達(dá)組的病例5年生存率高于低表達(dá)組(log rank test，x2＝5.24，P＝0.02)。
這一發(fā)現(xiàn)表明，S100A14可作為鑒別胃癌組織的分化程度和判斷臨床預(yù)后的分子標(biāo)志。其重要意義在于我們首次獲得的抗S100A14抗體可用于鑒別胃癌組織的分化程度和判斷臨床預(yù)后。


圖1A-B是重組蛋白S100A14/His的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。A1誘導(dǎo)前的菌體蛋白；A2加IPTG誘導(dǎo)4hr后的菌體蛋白；A3誘導(dǎo)后的菌體超聲破碎后的沉淀；A4誘導(dǎo)后菌體超聲破碎后的上清。B純化的重組蛋白S100A14/His為15.4kDa，B1純化后的重組蛋白S100A14；圖2是Western blot檢測S100A14在胃癌細(xì)胞系及胃癌組織中的表達(dá)。a.內(nèi)對照actin；b.未純化抗體檢測結(jié)果12KDa帶為S100A14，15KDa帶為非特異帶；c.純化后抗體檢測結(jié)果，僅出現(xiàn)12KDa特異性條帶，S100A14在細(xì)胞系中出現(xiàn)明顯差異表達(dá)，僅在細(xì)胞系A(chǔ)GS，PAMC82及N87中表達(dá)，而且以N87的表達(dá)水平最高；圖3是Western blot對S100A14抗體的驗證A2μg S100A14/His蛋白出現(xiàn)抗體雜交信號；B2μg N2蛋白未出現(xiàn)雜交信號；C4μg S100A14/His蛋白出現(xiàn)抗體結(jié)合信號；D2μg CKB蛋白未見雜交信號；圖4是S100A14在胃癌及其配對正常組織中的差異表達(dá)。高分化癌Case12和15癌中的表達(dá)水平明顯高于低分化癌Case1和3；
圖5是IHC檢測S100A14蛋白在胃癌中表達(dá)A正常胃粘膜組織中S100A14呈強(qiáng)陽性染色，B低分化胃癌中S100A14呈陰性染色C中分化胃癌中S100A14呈弱陽性染色，D高分化胃癌中S100A14呈強(qiáng)陽性染色。箭頭所指為膜陽性著色，放大倍數(shù)200×.右下角400×；圖6是S100A14高表達(dá)與低表達(dá)兩組病例生存率比較(Kalpan-Meier生存曲線)。S100A14高表達(dá)組病例中位生存時間為32個月(95％CI，11.95～52.05)，低表達(dá)組為13個月(95％CI，10.66～15.34)，高表達(dá)組生存率高于低表達(dá)組(log ranktest，x2＝5.24，p＝0.02)。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和具體的實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
一、實驗材料1、胃癌細(xì)胞系BGC823、MGC803、SGC7901、PAMC82、MKN45、AGS、N87培養(yǎng)于含5％FBS(Hyclone公司)的DMEM(Gibco公司)培養(yǎng)液，常規(guī)置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗。
2、胃癌組織標(biāo)本標(biāo)本來源于北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院組織標(biāo)本庫。手術(shù)切除的新鮮癌組織與癌旁正常組織在停止血供30分鐘內(nèi)放入液氮。標(biāo)本均經(jīng)病理證實，并有患者知情同意。
3、組織陣列由本室自己制備。組織陣列包括含125例胃癌組織標(biāo)本(高分化40例，低分化85例)，67例配對的正常組織標(biāo)本，每個標(biāo)本含2個重復(fù)點陣，具備相應(yīng)的臨床病理資料。其中79例具備隨訪資料。
4、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a由中科院基因研究所，北京華大蛋白質(zhì)研究中心惠贈。
5、菌株宿主菌株DH5α為Invitrogen公司產(chǎn)品，表達(dá)菌株BL-21(DE3)由北京華大蛋白質(zhì)研究中心惠贈。
6、免疫動物新西蘭白兔由北京大學(xué)第一醫(yī)院實驗動物中心提供。
7、蛋白純化及抗體純化膠Ni2+-NTA agarose蛋白純化膠，購自Qigen公司，CNBR sepharose抗體純化膠，購自Pharmacia公司。
二、實驗步驟1、原核表達(dá)載體pET/S100A14的構(gòu)建實驗以已構(gòu)建好的含S100A14 CDS基因片斷的pGEM-T Easy重組質(zhì)粒為模板(經(jīng)測序三次以上序列正確)，通過設(shè)計引物在基因的兩端引入了BamH(5’端)和Hind(3’端)酶切位點，PCR擴(kuò)增S100A14基因全長CDS的片斷并定向克隆至pET-28a原核表達(dá)載體，陽性重組質(zhì)粒采用BamHI和HindIII雙酶切及測序驗證。
2、重組蛋白S100A14/His的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將測序鑒定無誤后的pET/S100A14重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL-21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生S100A14-His融合蛋白，S100A14 CDS全長編碼104AA，分子量為11.662KDa，約等于12KDa，S100A14-His融合蛋白分子量約為15.4kDa。經(jīng)SDS-PAGE驗證該蛋白表達(dá)存在于上清中，為可溶性蛋白(圖1A)。通過對融合蛋白的純化，得到高純度的S100A14/His融合蛋白(圖1B)。采用Bradford法測定蛋白濃度后，-20℃保存。
3、免疫動物抗血清的制備、鑒定及純化選取健康成年新西蘭大白兔2只(體重在2～2.5kg)，將含200μg融合蛋白和等體積的完全佛氏佐劑充分乳化后背部脊柱兩側(cè)皮下多點注射，經(jīng)初次免疫和4次加強(qiáng)免疫后，當(dāng)血清效價達(dá)到10-5時，收集抗血清，-70℃分裝凍存。
采用Western blot檢測胃癌細(xì)胞系中S100A14的表達(dá)，在分子量12KDa大小相符的位置出現(xiàn)清晰的條帶，說明抗血清中含有抗S100A14抗體。但同時出現(xiàn)明顯的15KDa非特異性條帶(圖2b)，石蠟組織切片的免疫組化出現(xiàn)非特異性染色?？贵w經(jīng)過CNBR sepharose免疫親和層析純化，用于Western blot鑒定胃癌細(xì)胞系中S100A14的表達(dá)出現(xiàn)單一條帶(圖2c)，進(jìn)一步采用重組蛋白S100A14/His(15.4KDa)、N2/His(26KDa)和CKB/His(48KDa)對其進(jìn)行鑒定，只有2μg和4μg重組蛋白S100A14/His泳道出現(xiàn)與抗體的結(jié)合信號(圖3)。石蠟切片免疫組化結(jié)果染色特異性強(qiáng)，提示抗體制備獲得具有高度特異性的S100A14抗體。
4、S100A14在胃癌細(xì)胞系和組織蛋白表達(dá)水平的鑒定純化的S100A14抗體用于IHC及Western blot檢測胃癌細(xì)胞及組織中S100A14蛋白的差異表達(dá)，獲得了高度特異性的結(jié)果。IHC顯示S100A14蛋白在上皮細(xì)胞膜呈強(qiáng)陽性染色，在正常胃粘膜陽性染色為48/67(71.6％)，在胃癌中陽性染色為60/125(48.0％)。Western blot結(jié)果顯示，S100A14蛋白僅在細(xì)胞系A(chǔ)GS，PAMC82和N87中表達(dá)(圖2c)。
5、S100A14抗體用于鑒別胃癌的分化程度進(jìn)一步對S100A14在胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)S100A14在細(xì)胞系N87中的表達(dá)水平明顯高于其它細(xì)胞系，該細(xì)胞系為高分化來源(圖2c)。組織Western blot結(jié)果也顯示S100A14在高分化癌中的表達(dá)水平明顯高于低分化癌(圖4)。
分析組織微陣列的IHC的結(jié)果表明，S100A14蛋白在77.5％(31/40)高分化癌組織中和34.1％(29/85)的低分化癌組織中表達(dá)陽性，即在高分化癌組織中的表達(dá)明顯高于低分化組織(x2＝20.51，P＜0.001)。根據(jù)著色的強(qiáng)度及面積，將S100A14蛋白表達(dá)分為陰性(-)，陽性(+)，中等強(qiáng)度陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)表達(dá)，經(jīng)過統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)高低分化癌中S100A14的表達(dá)水平在強(qiáng)度上有差別(表2，圖5)，中等強(qiáng)度陽性與強(qiáng)度陽性表達(dá)在高分化癌中明顯高于低分化癌(x2＝28.09，p＜0.001)，其中，中等強(qiáng)度陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)在高分化癌組織中的陽性率分別為低分化癌組織中的3.3和6.9倍。
6、S100A14抗體用于判斷胃癌臨床預(yù)后在確定S100A14表達(dá)與分化程度相關(guān)的基礎(chǔ)上，根據(jù)S100A14蛋白水平的表達(dá)情況將病例分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，利用Kaplan-Meier法生存曲線和Log-rank檢驗，分析了S100A14表達(dá)變化與胃癌病例生存時間的關(guān)系。結(jié)果表明，S100A14表達(dá)不同的兩組病例生存率有差別，S100A14高表達(dá)組的病例5年生存率高于低表達(dá)組(Log-rank test，x2＝5.24，P＝0.02)(圖6)。但同樣對S100A6蛋白表達(dá)的生存曲線分析后發(fā)現(xiàn)，S100A6高表達(dá)和低表達(dá)的兩組生存率沒有差別(Log-rank test，x2＝0.29，P＝0.58)。
表1 S100A14 mRNA在胃癌及配對正常組織中的差異表達(dá)的定量PCR結(jié)果比較

表2 S100A14蛋白在胃癌及配對正常組織中表達(dá)的IHC結(jié)果比較

權(quán)利要求
1.一種鈣結(jié)合蛋白S100A14抗體制備方法，其特征在于通過構(gòu)建了原核表達(dá)載體并獲得可溶性的S100A14融合蛋白，經(jīng)免疫動物得到高滴度的抗S100A14抗體，經(jīng)過純化獲得了具有高度特異性抗體。
2.一種鈣結(jié)合蛋白S100A14抗體的用途，其特征在于S100A14抗體可用于石蠟切片免疫組化和Western blot分析，S100A14抗體在石蠟切片免疫組化和Western blot分析中均表現(xiàn)出高度特異性，并能驗證S100A14在胃癌細(xì)胞系和組織中的差異表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鈣結(jié)合蛋白S100A14抗體的用途，其特征在于S100A14抗體可用于鑒別胃癌組織的分化程度，通過大樣本胃癌組織的免疫組化和Western blot分析，確定S100A14在高分化癌組織中表達(dá)明顯高于低分化癌組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鈣結(jié)合蛋白S100A14抗體的用途，其特征在于S100A14抗體可用于判斷胃癌臨床預(yù)后，S100A14高表達(dá)組病例5年生存率明顯高于低表達(dá)組。
全文摘要
一種鈣結(jié)合蛋白S100A14抗體制備及其用途的發(fā)明是通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET－28/S100A14并獲得高效表達(dá)的S100A14－h(huán)is融合蛋白，經(jīng)免疫動物得到S100A14抗血清，通過免疫親和層析純化獲得了具有高度特異性抗體，可用于石蠟切片免疫組化和Western blot分析。通過鑒定S100A14在胃癌組織中的差異表達(dá)，確定S100A14在高分化癌組織中表達(dá)明顯高于低分化癌組織(χ
文檔編號G01N33/574GK101037684SQ20061005751
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
發(fā)明者呂有勇, 張慶英, 李文梅, 趙敏, 劉斯奇 申請人:北京市腫瘤防治研究所