專利名稱：用23s核糖體基因探針陣列檢測(cè)水生動(dòng)物病原菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)，具體地講是運(yùn)用核酸分子雜交反應(yīng)檢測(cè)致病細(xì)菌，特別是水生動(dòng)物病原菌(包括殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、鮰魚愛(ài)德華氏菌、殺魚腸球菌、鏈球菌、嗜冷屈撓桿菌、柱狀屈撓桿菌、多殺巴斯德氏菌、殺魚巴斯德氏菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、丁香組假單胞菌、霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23種細(xì)菌)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前，水生動(dòng)物病原微生物檢測(cè)方法基本上依靠生化鑒定和培養(yǎng)鑒定。這些鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且又是在種水平的鑒定上結(jié)果并不可靠。隨著分子生物學(xué)鑒定方法的發(fā)展，基于這些方法的細(xì)菌分類正在逐漸被修正。這一狀況從側(cè)面說(shuō)明了建立分子生物學(xué)鑒定方法的必要性。相關(guān)研究在國(guó)際上已廣泛開(kāi)展，國(guó)內(nèi)這方面研究也在逐漸興起。
在水生動(dòng)物病原微生物檢測(cè)方面，國(guó)內(nèi)基本上采用的是生化方法，鮮有芯片或微陣列應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道，國(guó)際上雖有水生動(dòng)物致病微生物檢驗(yàn)芯片的研究報(bào)道，但其檢測(cè)的范圍并不全面。從技術(shù)層面講，目前細(xì)菌分子檢測(cè)運(yùn)用最多DNA靶點(diǎn)是16S rRNA基因。但在許多情況下，相近種之間在16S rRNA基因序列上的差異非常有限(同屬的細(xì)菌16S rRNA基因序列差別基本上小于4％相似度)，并且有時(shí)候這些差別位點(diǎn)分布比較均勻。所以用16S rRNA基因上的差別位點(diǎn)設(shè)計(jì)相近種鑒別探針難度較大，而且鑒別效果往往不理想。23S rRNA可變區(qū)域多，分子量更大，與16S rRNA基因相比變異位點(diǎn)豐富而集中，但在種的水平上具有保守性。再加上一般細(xì)菌都有多個(gè)拷貝的rRNA操縱子，使得利用23S設(shè)計(jì)種特異性探針?lè)浅１憷⑶掖蟠筇岣吡颂结樀奶禺愋浴?br> DNA微陣列在水生動(dòng)物疫病檢測(cè)方面有廣泛的應(yīng)用前景，能夠大大提高檢驗(yàn)的效率，節(jié)省人力，時(shí)間。真正能夠做到一次檢驗(yàn)給出可能感染的病原微生物的感染狀況的全面信息，并且結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便快速。

發(fā)明內(nèi)容
目前我國(guó)尚沒(méi)有在水生動(dòng)物疫病檢測(cè)方面運(yùn)用寡核苷酸微陣列檢測(cè)病原菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，依然沿用了增菌法、PCR方法、熒光PCR方法檢測(cè)水生動(dòng)物疫病病原菌。增菌法需要經(jīng)過(guò)前增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等經(jīng)典的檢驗(yàn)方法檢測(cè)目標(biāo)菌。試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，處理樣品量小，而且靈敏度和特異性都相對(duì)較低。而PCR方法、熒光PCR方法檢測(cè)通量低，一次只能實(shí)現(xiàn)一種病原菌的檢驗(yàn)。
針對(duì)上述情況，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種運(yùn)用寡核苷酸微陣列檢測(cè)病原菌技術(shù)檢測(cè)水生動(dòng)物疫病病原菌的方法(包括殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、鮰魚愛(ài)德華氏菌、殺魚腸球菌、鏈球菌、嗜冷屈撓桿菌、柱狀屈撓桿菌、多殺巴斯德氏菌、殺魚巴斯德氏菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、丁香組假單胞菌、霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23種細(xì)菌)為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的首先用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)特異性探針序列如下序列一(氣單胞菌屬通用探針AFp1)CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG序列二(殺鮭氣單胞菌探針Asal1)TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG序列三(嗜水氣單胞菌探針Ahyr1)TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA
序列四(豚鼠氣單胞菌探針Acav1)TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA序列五(梭菌屬通用探針CloFp)CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA序列六(產(chǎn)氣莢膜梭菌探針Cper1)AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA序列七(肉毒梭菌探針Cbot1)GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC序列八(鮰魚愛(ài)德華氏菌探針Eict1)ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT序列九(殺魚腸球菌探針Eserp1)ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA序列十(鏈球菌屬通用探針Strp1)TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC序列十一(嗜冷屈撓桿菌探針FleFp)TAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG序列十二(柱狀屈撓桿菌探針1Fclup1)ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC序列十三(柱狀屈撓桿菌探針2Fclup2)ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC序列十四(多殺巴斯德氏菌探針1Pmulp1)AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG序列十五(多殺巴斯德氏菌探針2Pmulp2)GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC序列十六(殺魚巴斯德氏菌探針Ppisp)CTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC序列十七(惡臭假單胞菌探針1Pputp1)GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT序列十八(惡臭假單胞菌探針2Pputp2)CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG序列十九(熒光假單胞菌探針1Pflup1)GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT序列二十(熒光假單胞菌探針2Pflup2)CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG序列二十一(丁香組假單胞菌探針Psyrp2)ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA序列二十二(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1Vchmip11)ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG序列二十三(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2Vchmip12)GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT序列二十四(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3Vcmap13)GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG序列二十五(哈維弧菌探針1Vharp11)CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG序列二十六(哈維弧菌探針2Vharp12)GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA序列二十七(哈維弧菌探針3Vharp21)TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA序列二十八(創(chuàng)傷弧菌探針1Vvulp11)AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG序列二十九(創(chuàng)傷弧菌探針2Vvulp21)TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG序列三十(副溶血弧菌探針V.parp21)TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC序列三十一(河流弧菌及弗氏弧菌探針1Vflfup11)TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT序列三十二(河流弧菌及弗氏弧菌探針2Vflfup12)TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG序列三十三(溶藻弧菌探針Vflfup21)AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG序列三十四(溶藻弧菌探針Valgp21)AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT其中D代表堿基A或G或T中的任意一個(gè)；W代表堿基A或T中的任意一個(gè)。然后PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品中全部微生物的23S rRNA基因內(nèi)的部分DNA片斷，同時(shí)進(jìn)行地高辛標(biāo)記時(shí)所使用的PCR引物寡核苷酸序列如下
引物序列1(23S rRNA基因片段擴(kuò)增前引物P23forward)GCGATTTCYG AAYGGGGRAACCC引物序列2(23S rRNA基因片段擴(kuò)增后引物P23reverse)TTCGCCTTTCCCTCACGGTA CT其中Y代表堿基C或T中的任意一個(gè)；R代表堿基A或G中的任意一個(gè)。運(yùn)用寡核苷酸微陣列檢測(cè)多種水生動(dòng)物病原菌的方法包括以下步驟1.設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸探針，用于分子雜交-酶聯(lián)免疫顯色檢測(cè)；2.PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品中全部原核微生物的23S rRNA基因的部分DNA片斷，同時(shí)進(jìn)行地高辛標(biāo)記；3.將設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸基因探針點(diǎn)在帶有正電荷的尼龍膜(Amersham公司，美國(guó))上，組成探針微陣列，微陣列的點(diǎn)制按圖1中的順序和位置，在長(zhǎng)波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5-10分鐘；本專利申請(qǐng)書的所有附圖中的點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的探針均和圖1中所示一樣為1陽(yáng)性對(duì)照2陰性對(duì)照3氣單胞菌屬通用探針AFp1CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG4殺鮭氣單胞菌探針Asal1TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG5嗜水氣單胞菌探針Ahyr1TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA6豚鼠氣單胞菌探針Acav1TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA7梭菌屬通用探針CloFp CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA8產(chǎn)氣莢膜梭菌探針Cper1AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA9肉毒梭菌探針Cbot1GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC10鮰魚愛(ài)德華氏菌探針Eict1ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT11殺魚腸球菌探針Eserp1ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA12鏈球菌屬通用探針I(yè)IEser&Strp1TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC13嗜冷屈撓桿菌探針FleFpTAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG14柱狀屈撓桿菌探針1Fclup1ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC15柱狀屈撓桿菌探針2Fclup2ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC16多殺巴斯德氏菌探針1Pmulp1AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG17多殺巴斯德氏菌探針2Pmulp2GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC18殺魚巴斯德氏菌探針PpispCTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC19惡臭假單胞菌探針1Pputp1GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT20惡臭假單胞菌探針2Pputp2CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG21熒光假單胞菌探針1Pflup1GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT22熒光假單胞菌探針2Pflup2CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG23丁香組假單胞菌探針Psyrp2ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA24霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1Vchmip11ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG25霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2Vchmip12GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT26霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3Vcmap13GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG
27哈維弧菌探針1Vharp11CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG28哈維弧菌探針2Vharp12GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA29哈維弧菌探針3Vharp21TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA30創(chuàng)傷弧菌探針1Vvulp11AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG31創(chuàng)傷弧菌探針2Vvulp21TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG32副溶血弧菌探針Vparp21TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC33河流弗氏弧菌探針1Vflfup11TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT34河流弗氏弧菌探針2Vflfup12TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG35溶藻弧菌探針Vflfup21AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG36溶藻弧菌探針Valgp21AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT4.雜交和雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL0.3μL引物1 10mol/L 2μL序列三十六(引物) 10μmol/L 2μLdNTPs 每種 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水 33.1μL總體積 50μLPCR方法中擴(kuò)增程序?yàn)?)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重復(fù)5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重復(fù)25次9)72℃2min將濃度為1mmol/L的寡核苷酸探針溶液0.1μL點(diǎn)在帶有正電荷的尼龍膜上，在長(zhǎng)波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5-10分鐘。
其地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物與寡核苷酸探針雜交方法如下*預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把點(diǎn)入寡核苷酸探針的尼龍膜放入塑料袋，加入預(yù)雜交液，封好口。預(yù)雜交30min，50℃。
*擴(kuò)增PCR產(chǎn)物熱變性DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛標(biāo)記靶DNA分子與尼龍膜雜交把預(yù)雜交好的芯片裝入塑料袋，加入變性的DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10uL，再加入1mL雜交液，封好口。50℃，雜交1hr，溫和攪動(dòng)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是該方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確的鑒定特異的目標(biāo)細(xì)菌。首先，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時(shí)間；而且DNA-DNA的雜交鑒定方法較生理生化的鑒定方法更為準(zhǔn)確，不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，這將填補(bǔ)使用DNA分子雜交的鑒定方法進(jìn)行水生動(dòng)物疫病病原菌檢測(cè)的空白。


圖1微陣列的探針位置示意圖。
圖2實(shí)施例1某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出殺鮭氣單胞菌的結(jié)果。
圖3實(shí)施例2某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出嗜水氣單胞菌的結(jié)果。
圖4實(shí)施例3某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出豚鼠氣單胞菌的結(jié)果。
圖5實(shí)施例4某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌的結(jié)果。
圖6實(shí)施例5某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出肉毒梭菌的結(jié)果。
圖7實(shí)施例6某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出鮰魚愛(ài)德華氏菌的結(jié)果。
圖8實(shí)施例7某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出殺魚腸球菌的結(jié)果。
圖9實(shí)施例8某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出乙型溶血型鏈球菌的結(jié)果。
圖10實(shí)施例9某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出嗜冷屈撓桿菌的結(jié)果。
圖11實(shí)施例10某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出柱狀屈撓桿菌的結(jié)果。
圖12實(shí)施例11某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出多殺巴斯德氏菌的結(jié)果。
圖13實(shí)施例12某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出殺魚巴斯德氏菌的結(jié)果。
圖14實(shí)施例13某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出惡臭假單胞菌的結(jié)果。
圖15實(shí)施例14某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出熒光假單胞菌的結(jié)果。
圖16實(shí)施例15某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出霍亂弧菌的結(jié)果。
圖17實(shí)施例16某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出擬態(tài)弧菌的結(jié)果。
圖18實(shí)施例17某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出哈維弧菌的結(jié)果。
圖19實(shí)施例18某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出創(chuàng)傷弧菌的結(jié)果。
圖20實(shí)施例19某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出副溶血弧菌的結(jié)果。
圖21實(shí)施例20某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出河流弧菌的結(jié)果。
圖22實(shí)施例21某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出弗氏弧菌的結(jié)果。
圖23實(shí)施例22某批次活魚的微陣列檢測(cè)檢出溶藻弧菌的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出殺鮭氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提取樣品魚鱗片下表皮、腎組織、肝組織、心臟各一克，勻漿后混合振蕩，取勻漿液1mL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液500μl，振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚pH值8.0，強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，吸取上清液，重復(fù)酚抽提。吸取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。棄去上清，加70％冰乙醇振蕩洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清。加入50μLTE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴(kuò)增23S基因片段成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL0.3μL引物1 10μmol/L 2μL引物2 10μmol/L 2μLdNTPs 每種 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水3 3.1μL總體積 50μLPCR方法中擴(kuò)增程序?yàn)?)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重復(fù)5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重復(fù)25次9)72℃2min3.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交*預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把點(diǎn)入寡核苷酸探針的尼龍膜放入塑料袋，加入預(yù)雜交液，封好口。預(yù)雜交30min，50℃。
*擴(kuò)增PCR產(chǎn)物熱變性DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛標(biāo)記靶DNA分子與尼龍膜雜交把預(yù)雜交好的芯片裝入塑料袋，加入變性的DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10uL，再加入1mL雜交液，封好口。50℃，雜交1hr，溫和攪動(dòng)。
4.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)三(3氣單胞菌屬通用探針3AFp1)探針位點(diǎn)四(殺鮭氣單胞菌探針4)均深藍(lán)色點(diǎn)即為陽(yáng)性雜交結(jié)果，表明樣品中含有殺鮭氣單胞菌，見(jiàn)圖2。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有殺鮭氣單胞菌。這說(shuō)明殺鮭氣單胞菌寡核苷酸探針的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例2樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出嗜水氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)三(氣單胞菌屬通用探針AFp1)、探針位點(diǎn)五(嗜水氣單胞菌探針Ahyr1)均為深藍(lán)色點(diǎn)即為陽(yáng)性雜交結(jié)果，表明樣品中含有嗜水氣單胞菌探針，見(jiàn)圖3。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有嗜水氣單胞菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)三、探針位點(diǎn)五陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例3樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出豚鼠氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)三(氣單胞菌屬通用探針AFp1)、探針位點(diǎn)六(豚鼠氣單胞菌探針Acav1)均深藍(lán)色點(diǎn)即為陽(yáng)性雜交結(jié)果，表明樣品中含有豚鼠氣單胞菌，見(jiàn)圖4。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有豚鼠氣單胞菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)三、探針位點(diǎn)六的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例4樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出產(chǎn)氣莢膜梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)七(梭菌屬通用探針CloFp)、探針位點(diǎn)八(產(chǎn)氣莢膜梭菌探針Cper1)均深藍(lán)色點(diǎn)即為陽(yáng)性雜交結(jié)果，表明樣品中含有產(chǎn)氣莢膜梭菌，見(jiàn)圖5。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有產(chǎn)氣莢膜梭菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)七、探針位點(diǎn)八的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例5樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出肉毒梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)七(梭菌屬通用探針CloFp)、探針位點(diǎn)九(肉毒梭菌探針Cbot1)均深藍(lán)色點(diǎn)即為陽(yáng)性雜交結(jié)果，表明樣品中含有肉毒梭菌，見(jiàn)圖6。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有肉毒梭菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)七、探針位點(diǎn)九的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例6樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出鮰魚愛(ài)德華氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)十(鮰魚愛(ài)德華氏菌探針Eict1)表明樣品中含有肉毒梭菌，見(jiàn)圖7。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有鮰魚愛(ài)德華氏菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)十的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例7樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出殺魚腸球菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)十一(殺魚腸球菌探針Eserp1)表明樣品中含有殺魚腸球菌，見(jiàn)圖8。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有殺魚腸球菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)十一的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例8樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出乙型溶血型鏈球菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)十二(鏈球菌屬通用探針I(yè)IEser&Strp1)表明樣品中含有鏈球菌，見(jiàn)圖9。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有鏈球菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)十二的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例9樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出嗜冷屈撓桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)十三(嗜冷屈撓桿菌探針FleFp)表明樣品中含有嗜冷屈撓桿菌，見(jiàn)圖10。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含有嗜冷屈撓桿菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)十三的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例10樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出柱狀屈撓桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)十四(柱狀屈撓桿菌探針1Fclup1)十五(柱狀屈撓桿菌探針2Fclup2)表明樣品中含有柱狀屈撓桿菌，見(jiàn)圖11。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含柱狀屈撓桿菌菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)十四，十五的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例11樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出多殺巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)十六(多殺巴斯德氏菌探針1Pmulp1)探針位點(diǎn)十七(多殺巴斯德氏菌探針2Pmulp2)表明樣品中含有多殺巴斯德氏菌菌，見(jiàn)圖12。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含多殺巴斯德氏菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)十四的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例12樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出殺魚巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)十八(殺魚巴斯德氏菌探針Ppisp)表明樣品中含有殺魚巴斯德氏菌，見(jiàn)圖13。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含殺魚巴斯德氏菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)十八的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例13樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出惡臭假單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)十九(惡臭假單胞菌探針1Pputpl)探針位點(diǎn)二十(惡臭假單胞菌探針2Pputp2)表明樣品中含有惡臭假單胞菌，見(jiàn)圖14。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含惡臭假單胞菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)十九，二十的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例14樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出熒光假單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例1
2.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)二十一(熒光假單胞菌探針1Pflup1)二十二(熒光假單胞菌探針2Pflup2)表明樣品中含有熒光假單胞菌，見(jiàn)圖15。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含熒光假單胞菌菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)二十一，二十二的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例15樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出霍亂弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)二十三(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1Vchmip11)探針位點(diǎn)二十四(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2Vchmip12)探針位點(diǎn)二十五(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3Vchmip13)表明樣品中含有霍亂弧菌，見(jiàn)圖16。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含霍亂弧菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)二十三，二十四，二十五的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例16樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出擬態(tài)弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)二十三(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1Vchmip11)探針位點(diǎn)二十四(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2Vchmip12)探針位點(diǎn)二十五(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3Vchmip13)表明樣品中含有擬態(tài)弧菌，見(jiàn)圖17。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含擬態(tài)弧菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)二十三，二十四，二十五的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例17樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出哈維弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例1
3.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)二十七(哈維弧菌探針1Vharp11)探針位點(diǎn)二十八(哈維弧菌探針2Vharp12)探針位點(diǎn)二十九(哈維弧菌探針3Vharp13)表明樣品中含有擬態(tài)弧菌，見(jiàn)圖18。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含哈維弧菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)，二十七，二十八，二十九的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例18樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出創(chuàng)傷弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)三十(創(chuàng)傷弧菌探針1Vvulp11)探針位點(diǎn)三十一(創(chuàng)傷弧菌探針2Vvulp 21)表明樣品中含有創(chuàng)傷弧菌，見(jiàn)圖19。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含創(chuàng)傷弧菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)，三十，三十一的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例19樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出副溶血弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)三十二(副溶血弧菌探針Vparp 21)表明樣品中含有副溶血弧菌，見(jiàn)圖20。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中含副溶血弧菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)，三十二的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例20樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出河流弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)三十三(河流弗氏弧菌探針1Vflfup11)探針位點(diǎn)三十四(河流弗氏弧菌探針2Vflfup12)表明樣品中含有河流弧菌，見(jiàn)圖21。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中河流弧菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)，三十三，三十四的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例21樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出弗氏弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)三十三(河流弗氏弧菌探針1Vflfup11)探針位點(diǎn)三十四(河流弗氏弧菌探針2Vflfup12)表明樣品中含有弗氏弧菌，見(jiàn)圖22。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中弗氏弧菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)，三十三，三十四的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
實(shí)施例22樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出溶藻弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實(shí)施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實(shí)施例14.雜交陽(yáng)性斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點(diǎn)的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點(diǎn)三十五(溶藻弧菌探針Vflfup 21)探針位點(diǎn)三十六(溶藻弧菌探針Valgp21)表明樣品中含有溶藻弧菌，見(jiàn)圖23。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測(cè)儀得出結(jié)論被測(cè)樣品中溶藻弧菌。這說(shuō)明寡核苷酸探針位點(diǎn)，三十五，三十六的陽(yáng)性結(jié)果是有效的。
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<212>DNA<213>氣單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<400>1ctcagtagcg gcgagcgaac g21<210>2<211>30<212>DNA<213>殺鮭氣單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<400>2tatcgttaca tgaatacata gtgtaacgag 30<210>3<211>28<212>DNA<213>嗜水氣單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<400>3taagtgaata catagcttaa cgaggcga 28<210>4<211>28<212>DNA<213>豚鼠氣單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<400>4ttactgaata cataggtaat agaggcga 28<210>5<211>25<212>DNA<213>梭菌
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<400>5ccagagtacc acgagacacg tgaaa25<210>6<211>28<212>DNA<213>產(chǎn)氣莢膜梭菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<400>6aagtggaggc tattgtaact gaagagaa 28<210>7<211>27<212>DNA<213>肉毒梭菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>7gagaaattat ggttaaccga acacaac 27<210>8<211>23<212>DNA<213>鮰魚愛(ài)德華氏菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(23)<400>8acgaaggtgc acagctgtga gtt 23<210>9<211>30<212>DNA<213>殺魚腸球菌<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)<400>9actatgttat gcatagtatc cgtaagtgaa 30<210>10<211>28<212>DNA<213>鏈球菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<400>10tatagaagaa ttacctggga aggtaagc 28<210>11<211>24<212>DNA<213>嗜冷屈撓桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<400>11tagcccaaac cdawgttgtt acgg 24<210>12<211>29<212>DNA<213>柱狀屈撓桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<400>12actttccagt aaattctaat tctatccgc29<210>13<211>32<212>DNA<213>柱狀屈撓桿菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<400>13
ataagtaata gaagataacg atagtggtat cc32<210>14<211>32<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<400>14agtaagtttt agctagcata ttagaggaat tg32<210>15<211>30<212>DNA<213>多殺巴斯德氏菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<400>15gtactcgaaa gtatgttagt ggaactaagc 30<210>16<211>27<212>DNA<213>殺魚巴斯德氏菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>16cttaagctaa tcttgcgtta ggtgaac 27<210>17<211>26<212>DNA<213>惡臭假單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>17gaccagccct taagttgatt tgagat 26<210>18
<211>26<212>DNA<213>惡臭假單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>18ccgtacacga aaatctcttg tcaatg 26<210>19<211>26<212>DNA<213>熒光假單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>19gactagccct taagtggctt tgagat 26<210>20<211>27<212>DNA<213>熒光假單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>20cctgtacgcg aaaatctctt agtcatg 27<210>21<211>24<212>DNA<213>丁香組假單胞菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(24)<400>21acgcgaaaat ccctttgcaa tgaa 24<210>22<211>27<212>DNA
<213>霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>22actcggtgaa gtaggtgaac aagctgg 27<210>23<211>26<212>DNA<213>霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>23gaagyaggtg aacaagctgg aaagct 26<210>24<211>22<212>DNA<213>霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<400>24gctggaaagc ttggcgatac ag 22<210>25<211>27<212>DNA<213>哈維弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>25ctttttatgc gtcaggtgaa acttctg 27<210>26<211>27<212>DNA<213>哈維弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<400>26gtgaaacttc tggaaagttg tgcgata 27<210>27<211>25<212>DNA<213>哈維弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<400>27taaccggcaa cgcatataaa gtgaa25<210>28<211>26<212>DNA<213>創(chuàng)傷弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>28aagctttaca tgtgttagac gaacgg 26<210>29<211>26<212>DNA<213>創(chuàng)傷弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>29ttgtagatgc atgttcagtg aaatcg 26<210>30<211>25<212>DNA<213>副溶血弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)
<400>30ttgacgacgt gtgttcagtg aaatc25<210>31<211>25<212>DNA<213>河流弧菌及弗氏弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<400>31tttacatgcg tcaggtgaag gttct25<210>32<211>22<212>DNA<213>河流弧菌及弗氏弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<400>32tctggaaagg accgcgaaac ag 22<210>33<211>22<212>DNA<213>溶藻弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<400>33agccgacagc gcatgttcag tg 22<210>34<211>26<212>DNA<213>溶藻弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>34aactgacgac gcatattcag tgaaat 26
<210>35<211>23<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(23)<400>35gcgatttcyg aayggggraa ccc 23<210>36<211>22<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(22)<400>36ttcgcctttc cctcacggta ct 2權(quán)利要求
1.一種用23S核糖體基因探針陣列檢測(cè)水生動(dòng)物病原菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸探針，用于寡核苷酸微陣列檢測(cè)檢測(cè)，所設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸探針序列如下序列一(氣單胞菌屬通用探針AFp1)CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG序列二(殺鮭氣單胞菌探針Asal1)TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG序列三(嗜水氣單胞菌探針Ahyr1)TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA序列四(豚鼠氣單胞菌探針Acav1)TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA序列五(梭菌屬通用探針CloFp)CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA序列六(產(chǎn)氣莢膜梭菌探針Cper1)AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA序列七(肉毒梭菌探針Cbot1)GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC序列八(鲴魚愛(ài)德化氏菌探針Eict1)ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT序列九(殺魚腸球菌探針Eserp1)ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA序列十(鏈球菌屬通用探針Strp1)TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC序列十一(嗜冷屈撓桿菌探針FleFp)TAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG序列十二(柱狀屈撓桿菌探針1 Fclup1)ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC序列十三(柱狀屈撓桿菌探針2 Fclup2)ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC序列十四(多殺巴斯德氏菌探針1 Pmulp1)AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG序列十五(多殺巴斯德氏菌探針2 Pmulp2)GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC序列十六(殺魚巴斯德氏菌探針Ppisp)CTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC序列十七(惡臭假單胞菌探針1 Pputp1)GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT序列十八(惡臭假單胞菌探針2 Pputp2)CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG序列十九(熒光假單胞菌探針1 Pflup1)GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT序列二十(熒光假單胞菌探針2 Pflup2)CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG序列二十一(丁香組假單胞菌探針Psyrp2)ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA序列二十二(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1 Vchmip11)ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG序列二十三(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2 Vchmip12)GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT序列二十四(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3 Vcmap13)GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG序列二十五(哈維弧菌探針1 Vharp11)CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG序列二十六(哈維弧菌探針2 Vharp12)GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA序列二十七(哈維弧菌探針3 Vharp21)TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA序列二十八(創(chuàng)傷弧菌探針1 Vvulp11)AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG序列二十九(創(chuàng)傷弧菌探針2 Vvulp 21)TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG序列三十(副溶血弧菌探針V.parp 21)TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC序列三十一(河流弧菌及弗氏弧菌探針1 Vflfup11)TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT序列三十二(河流弧菌及弗氏弧菌探針2 Vflfup12)TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG序列三十三(溶藻弧菌探針Vflfup 21)AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG序列三十四(溶藻弧菌探針Valgp21)AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT(2)PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品中全部原核微生物的23s rRNA基因內(nèi)的DNA片段，同時(shí)進(jìn)行地高辛標(biāo)記；(3)將寡核苷酸微陣列和地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交；(4)雜交結(jié)果通過(guò)酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)顯色；(5)顯色結(jié)果用肉眼觀察，可發(fā)現(xiàn)進(jìn)行雜交的特異性探針位點(diǎn)顯色。
2.運(yùn)用23S核糖體基因探針陣列檢測(cè)多種水生動(dòng)物病原菌的方法在檢測(cè)水生動(dòng)物病原菌方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用23S核糖體基因探針陣列檢驗(yàn)多種能夠?qū)е滤鷦?dòng)物傳染病病原菌的方法，其技術(shù)原理為分子雜交——酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)，屬于細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)，其技術(shù)方案是用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)特異性探針，包括設(shè)計(jì)篩選的34條用作探針的寡核苷酸序列以及與之配套的PCR和雜交反應(yīng)條件。通過(guò)PCR擴(kuò)增并用地高辛標(biāo)記細(xì)菌23srRNA基因內(nèi)部分序列，并用該P(yáng)CR產(chǎn)物和一組特異性的寡核苷酸探針雜交，經(jīng)酶聯(lián)免疫顯色顯色后，可以從待測(cè)樣品中，精確檢測(cè)出是否存在水生動(dòng)物傳染病病原菌。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，省去了重復(fù)的細(xì)菌培養(yǎng)篩選環(huán)節(jié)，節(jié)約時(shí)間；分子雜交鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01N21/77GK1877328SQ20061001476
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者黃熙泰, 侯艷梅, 劉寅, 張立懷, 鄭澤軍, 高旗利, 周浩, 董志珍, 李永君, 王玉玲, 魏曉娜, 霍蕾 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué), 中華人民共和國(guó)天津出入境檢驗(yàn)檢疫局