專利名稱：堆肥中過氧化物酶活性的電化學(xué)測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種過氧化物酶活性的測定方法，具體涉及堆肥復(fù)雜系統(tǒng)中過氧化物酶活性的電化學(xué)測定。
背景技術(shù)：
黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是一種白腐真菌，在降解城市生活垃圾堆肥中的木質(zhì)素及多種有機(jī)污染物方面具有重要作用。該菌在一些主要營養(yǎng)物質(zhì)(如氮、碳、硫)受到限制時形成的木質(zhì)素降解酶系對各種異生物質(zhì)具有獨(dú)特的降解能力，它能降解木材中的木質(zhì)素而使木材呈白色，20世紀(jì)80年代以來的研究表明，該菌對底物的氧化具有非特異性的特點(diǎn)，可以降解多種有機(jī)物，包括天然高聚物、還原型化合物、氧化型化合物、有毒化合物等。黃孢原毛平革菌合成的木質(zhì)素降解酶體系中起主要作用的有兩種酶木素過氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)和錳過氧化物酶(manganeseperoxidase，MnP)，它們合成后被分泌到胞外，經(jīng)過氧化氫啟動一系列自由基鏈反應(yīng)，依靠氧化還原反應(yīng)降解各種結(jié)構(gòu)各異的有機(jī)物。
在堆肥復(fù)雜系統(tǒng)中降解木質(zhì)素的過氧化物酶類的活性增加意味著堆肥穩(wěn)定性的提高，這是因為當(dāng)大量的簡單有機(jī)化合物已被消耗殆盡時，木質(zhì)素成為微生物群落主要碳源之一。這樣LiP和MnP的酶活成為檢測堆肥腐熟度的重要指標(biāo)。
目前，對于LiP和MnP活性的測定普遍采用分光光度法，如測定LiP活性的藜蘆醇法及用某些染料(RB亮蘭、苯胺蘭、天青等)來作為LiP活性的指示劑都受到底物濁度的限制和光干擾物質(zhì)的影響；而KMB(2-keto-4-methiolbutyric acid)-乙烯分析法較慢，且除了LiP還有許多氧化劑能夠氧化KMB，產(chǎn)生乙烯，選擇性不好。一般采用的酚紅法、二價錳氧化分光光度法、愈創(chuàng)木酚法測定MnP活性同樣對底物濁度要求比較苛刻，受光干擾物質(zhì)影響，測定的精確度不高。堆肥浸出液濁度過大，阻礙了分光光度法測定過氧化物酶活的應(yīng)用。因此研究一種適合在堆肥過程控制中的過氧化物酶活測定是極需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在運(yùn)用電化學(xué)原理，提供一種過氧化物酶活性的測定方法，提高測定的靈敏性和抗干擾能力，以便更好地應(yīng)用到城市生活垃圾堆肥處理中，解決堆肥過程控制系統(tǒng)中的實時監(jiān)測問題。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述發(fā)明目的的。
堆肥中過氧化物酶活性的電化學(xué)測定方法，在接有三電極的電解池中進(jìn)行，本方法以玻碳電極為基底電極，以過氧化氫、對苯二酚為底物，用計時電流法測定堆肥浸出液中加入過氧化氫后電流變化斜率，用線性回歸方程計算木素過氧化物酶和錳過氧化物酶的總酶活，測定條件為還原電位+0.06V酒石酸緩沖溶液 pH3～5對苯二酚濃度0.2～0.6mM過氧化氫濃度0.05～0.3mM木素過氧化酶和錳過氧化物酶活性與電流變化斜率關(guān)系的三維線性回歸方程為V＝8.82×10-3(X+20.61Y)-0.07V為斜率(μAs-1)X為木素過氧化物酶活(U/L)，Y為錳過氧化物酶活(U/L)，(X+20.61Y)為總酶活(U/L)其中木素過氧化物酶活范圍為2.27～29.79U/L錳過氧化物酶活范圍為0.085～1.37U/L。
測定酶活的最佳條件如下還原電位 +0.06V酒石酸緩沖溶液 pH4.2對苯二酚濃度 0.25mM過氧化氫濃度 0.19mM


圖1 MnP和LiP氧化還原對苯二酚的機(jī)制；其中QH2代表對苯二酚，Q*代表對苯二酚的氧化物自由基。
圖2四種含不同濃度的木質(zhì)素降解酶的黃孢原毛平革菌粗酶液的電流響應(yīng)；圖3反映LiP和MnP的活性與電流變化斜率關(guān)系的三維線性回歸模型。
圖4最佳條件下用分光光度法和電流法測得的粗酶液中的總酶活比較。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明在堆肥中，黃孢原毛平革菌分泌的MnP和LiP被過氧化氫氧化成高價態(tài)，再通過催化芳香族酚類底物的氧化反應(yīng)得到相應(yīng)陽離子自由基而獲取一個電子。LiP能在低pH值、有過氧化氫存在的條件下獨(dú)立氧化對苯二酚；MnP必須在有Mn2+做還原劑的條件下才能完成催化循環(huán)，而三價的錳離子作為一個擴(kuò)散性強(qiáng)的氧化劑，可以更有效地氧化對苯二酚。上述反應(yīng)機(jī)制見圖1。對苯二酚的氧化物在電極上還原產(chǎn)生可以測定的電流信號。
本發(fā)明電化學(xué)測定采用美國Princeton Applied Research生產(chǎn)的VMP2多通道電化學(xué)系統(tǒng)與25ml電解池中的三電極系統(tǒng)相連接，進(jìn)行控制與監(jiān)測。該三電極系統(tǒng)以玻碳電極(直徑3mm)作為工作電極(即基底電極)，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑片電極作為對電極，進(jìn)行穩(wěn)定的測量。所有工作均在室溫(25℃)下完成。本方法以過氧化氫、對苯二酚為底物，測試了接種有黃孢原毛平革菌的堆肥浸出液中過氧化物酶的活性，建立了加入過氧化氫后電流變化斜率與酶活之間的線性關(guān)系。
考察了LiP和MnP的測定反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)在還原電位+0.06V下，在酒石酸緩沖溶液pH值范圍為3～5，對苯二酚濃度為0.2～0.6mM和過氧化氫濃度為0.05～0.3mM時，電流對酶活的響應(yīng)比較顯著。最佳條件是在酒石酸緩沖溶液(pH4.2)中，對苯二酚濃度為0.25mM時，加入0.19mM過氧化氫，通過電流變化斜率測定LiP和MnP的酶活。將本測定方法運(yùn)用到堆肥處理當(dāng)中，可以簡便、高效地獲得目的信息。
把用分光光度法測定的具有不同LiP活性的黃孢原毛平革菌培養(yǎng)所得的粗酶液放進(jìn)電化學(xué)元件中。其中底物對苯二酚濃度為0.25mM，過氧化氫濃度為0.125mM，LiP的活性分別為a)0，b)0.65U/L，c)6.67U/L和d)30.86U/L，還原電位為+0.1V，采用計時電流法，如圖2所示。由圖可見，我們可以使用電流變化的斜率(Δ電流/Δ時間)作為木質(zhì)素降解酶活性的指標(biāo)。
采用計時電流法測定一系列不同酶活的粗酶液中LiP和MnP的總酶活，在最佳條件緩沖溶液為酒石酸緩沖液(pH4.2)，還原電位為+0.06V，對苯二酚濃度(0.25mM)時，加入過氧化氫濃度(0.19mM)?？偯富钆c加入過氧化氫后電流變化斜率呈線性關(guān)系的范圍為LiP為2.27～29.79U/L，MnP為0.085～1.37U/L，回歸方程V＝8.82×10-3(X+20.61Y)-0.07其中，V為斜率(μAs-1)，X為LiP酶活(U/L)、Y為MnP酶活(U/L)，(X+20.61Y)為總酶活(U/L)，相關(guān)系數(shù)為0.9825，見圖3。
具體實施例方式1、玻碳電極的預(yù)處理用0.5μm Al2O3粉末進(jìn)行拋光至電極表面光潔，然后用水沖洗電極表面，再依次用1∶1的HNO3、丙酮、水超聲波清洗、最后再用水沖洗，自然晾干即可。
2、菌種培養(yǎng)將黃孢原毛平革菌接種至PDA培養(yǎng)基，在37℃條件下靜置培養(yǎng)4天用于菌的擴(kuò)增。將其孢子接種至Kirk液體培養(yǎng)基，在37℃下以120r/min的速率振蕩培養(yǎng)8天，過濾得粗酶液。
PDA培養(yǎng)基組成土豆40克，瓊脂4g，葡萄糖4g，水200ml。
Kirk液體培養(yǎng)基組成葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.2g/L，吐溫80lg/L，苯甲醇0.54g/L，KH2PO42.56g/L，MgSO40.71g/L，VB1 0.001g/L，鄰苯二甲酸緩沖液10mmol/L，微量元素液70ml/L；最終pH4.5。
其中微量元素液(g/L)氨基乙酸0.6，MnSO4·H2O 0.5，NaCl 1，F(xiàn)eSO4·7 H2O 0.1，CoSO4·7 H2O 0.22，CaCl2·2 H2O 1.56，Zn SO4·7 H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.1，AlK(SO4)2·12H2O 0.01，HBO30.01，Na2MoO4·2H2O 0.01。
3、堆肥條件A、B、C、D共4個好氧堆肥罐，堆料組成如下，其中土壤為岳麓山東側(cè)表層以下1m處，具體堆料組成見如下編號 堆料組成A 土壤600g，稻草180g，食堂殘余物300g，麩皮100g，含水率75％，接種黃孢原毛平革菌質(zhì)量比為0.8％。
B 土壤600g，稻草180g，食堂殘余物300g，麩皮100g，含水率75％，投加了Pb(NO3)280mg/kg。
C 土壤600g，稻草180g，食堂殘余物300g，麩皮100g，含水率75％，投加了Pb(NO3)280mg/kg，接種黃孢原毛平革菌質(zhì)量比為0.8％。
D 土壤600g。
A、B、C環(huán)境溫度保持在30℃(水浴恒溫)，通風(fēng)量為0.033m3/h，發(fā)酵40天；D置于自然通風(fēng)處，靜置40天。
4、堆肥浸出液制備取A、B、C、D樣各10g置于4個錐形瓶中，各加入一定體積蒸餾水，在37℃下振蕩120min，速度200r/min，過濾后將濾液離心5min，10000r/min，上清液過濾即得到堆肥浸出液。
5、酶活測定采用計時電流的方法，以玻碳電極為基底電極，在酒石酸緩沖溶液4mL(pH4.2)和浸出液4mL的混合溶液中，還原電位為+0.06V，對苯二酚濃度為0.25mM時，加入過氧化氫濃度為0.19mM的電流變化斜率測定A、B、C和D四個好氧堆肥罐中以不同浸取比例浸取的堆肥浸出液中LiP和MnP的總酶活(見下表)。由表可見，本發(fā)明所采用的電化學(xué)測定結(jié)果與浸取比例呈線性關(guān)系。
堆肥浸出液 浸取比例 計時電流法測定的(g∶mL 堆肥∶水) 總酶活(U/L)A1∶1054.09A1∶1244.97A1∶1437.98A1∶1633.05A1∶1829.25A1∶2027.14B1∶1019.02C1∶1023.61D1∶1015.43由于本實驗中黃孢原毛平革菌的培養(yǎng)條件有限，產(chǎn)生的LiP和MnP的活性不高，故而所建立的回歸模型的酶活線性范圍受到限制，在大規(guī)模的黃孢原毛平革菌的培養(yǎng)和堆肥實驗中，該線性范圍應(yīng)該有所擴(kuò)展。
從上述測定結(jié)果和圖4的兩種方法比較的結(jié)果可以清楚地看出，本方法不僅測定結(jié)果與分光光度法非常相近而且操作快速、簡便，靈敏度高，選擇性好，解決了復(fù)雜系統(tǒng)中酶活測定的靈敏度以及濁度和光干擾物質(zhì)的干擾問題，使本方法可以成為在城市生活垃圾堆肥控制系統(tǒng)中一套快速、低成本的堆肥腐熟度檢測技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種堆肥中過氧化物酶活性的電化學(xué)測定方法，測定在接有三電極的電解池中進(jìn)行，其特征在于本方法以玻碳電極為基底電極，以過氧化氫、對苯二酚為底物，用計時電流法測定堆肥浸出液中加入過氧化氫后電流變化斜率，用線性回歸方程計算木素過氧化物酶和錳過氧化物酶的總酶活，測定條件為還原電位 +0.06V酒石酸緩沖溶液pH3～5對苯二酚濃度 0.2～0.6mM過氧化氫濃度 0.05～0.3mM總酶活性與電流變化斜率關(guān)系的三維線性回歸方程為V＝8.82×10-3(X+20.61Y)-0.07V為斜率(μAs-1)X為木素過氧化物酶活(U/L)，Y為錳過氧化物酶活(U/L)，(X+20.61Y)為總酶活(U/L)其中木素過氧化物酶活范圍為2.27～29.79U/L；錳過氧化物酶活范圍為0.085～1.37U/L。
2.按權(quán)利要求1所述的堆肥中過氧化物酶活性的測定方法，其特征在于上述方法測定酶活的最佳條件如下還原電位 +0.06V酒石酸緩沖溶液pH4.2對苯二酚濃度 0.25mM過氧化氫濃度 0.19mM。
全文摘要
本發(fā)明涉及過氧化物酶活性的電化學(xué)測定。本方法以過氧化氫、對苯二酚為酶的底物，測定了接種有黃孢原毛平革菌的堆肥浸出液中過氧化物酶的活性，建立了加入過氧化氫后電流變化斜率與酶活之間的線性關(guān)系。通過建立回歸模型，快速、靈敏地測定總過氧化物酶的活性。總酶活與加入過氧化氫后電流變化斜率呈線性關(guān)系的范圍是木質(zhì)素過氧化物酶為2.27～29.79U/L，錳過氧化物酶為0.085～1.37U/L。本方法應(yīng)用到堆肥中酶活的測定，能夠排除堆肥浸出液中濁度和光干擾物質(zhì)的干擾，較傳統(tǒng)的分光光度法更加快速、靈敏和精確，可成為在城市生活垃圾堆肥控制系統(tǒng)中一套快速、低成本的堆肥腐熟度檢測技術(shù)。
文檔編號G01N27/416GK1632551SQ20041004708
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者湯琳, 曾光明, 黃國和, 章毅 申請人:湖南大學(xué)