專(zhuān)利名稱(chēng)：測(cè)量肝硬化的標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法和試劑盒。診斷測(cè)試以體液如血清中診斷碳水化合物的分布和鑒定為基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
大部分肝損傷的常見(jiàn)原因?qū)е赂斡不?。硬化是正常肝組織的損壞，在功能性肝組織周?chē)鷧^(qū)域留下無(wú)功能疤痕組織，伴隨著再生肝結(jié)形成。在美國(guó)，最常見(jiàn)的硬化原因是酗酒。在45到65歲的人中，硬化是第三大最普遍的死亡原因，僅次于心臟病和癌癥。在亞洲和非洲許多地方，慢性肝炎是硬化的主要原因。許多硬化輕微的人沒(méi)有癥狀且似乎健康好幾年。另外的人虛弱，食欲差，生病和體重下降。如果慢性阻斷膽汁流，人會(huì)患黃疸、搔癢和小黃皮膚結(jié)節(jié)(small yellow skinnodule)，特別是在眼瞼周?chē)?。營(yíng)養(yǎng)失調(diào)通常是由于自食欲差和膽汁鹽生成減少導(dǎo)致的脂肪與脂溶性維生素吸收受損。由于出血來(lái)自食管末端靜脈曲張(食管血管曲張)，人偶爾可能咳嗽或吐出大量血。從腸到肝的靜脈高血壓產(chǎn)生這些擴(kuò)大的血管。這種稱(chēng)為門(mén)高血壓的高血壓也能導(dǎo)致腹部液體積聚(腹水)。也可能發(fā)展腎衰竭和肝腦病?？赡馨l(fā)展其它長(zhǎng)期存在的肝病癥狀，如肌肉萎縮、手掌紅(掌紅斑)、手指卷起(Dupuytren掌攣縮)、皮膚的小蜘蛛樣靜脈、男性乳房增大(breastenlargement)(男子乳房發(fā)育癥)、頰部唾腺擴(kuò)大、脫發(fā)、睪丸收縮(睪丸萎縮)、外周(外周神經(jīng)病)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異常神經(jīng)功能。目前不能治愈硬化。治療包括停止使用毒性劑如酒精、接受適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)包括添加維生素、治療產(chǎn)生的并發(fā)癥。肝移植是目前唯一的療法且有助于患高度硬化的人。此外，硬化的存在增加發(fā)展肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，比一般人群高約40倍，在慢性肝炎和酒精中毒的病原背景中，硬化發(fā)展使已增大的病人患肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)分別從34.4增加到119倍和從2.4到22.4倍(Kuper等，2001)。通常進(jìn)行一些血液測(cè)試以測(cè)量肝功能并協(xié)助確定硬化的嚴(yán)重性和原因。指示肝損傷的最重要因素之一是膽紅素，它是肝中正常代謝且隨后在尿中分泌的紅黃色素。在肝炎病人中，肝不能加工膽紅素，此物質(zhì)的血液水平上升，有時(shí)導(dǎo)致黃疸。某些肝酶水平也能指示硬化(如天冬氨酸和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平和一些凝固酶)。然而，這些肝功能測(cè)試結(jié)果通常正常，因?yàn)橥瓿杀仨毣瘜W(xué)功能僅需要很少百分比的功能性肝細(xì)胞。另外，一些成像測(cè)試用于診斷可能的硬化和其并發(fā)癥。例如，超聲波掃描可顯示肝擴(kuò)大和存在特定損傷如再生結(jié)。其它貴許多的成像技術(shù)是磁共振成像(MRI)和計(jì)算層析X射照相術(shù)(CT)。在大部分存在一些慢性肝障礙形式的患者中，進(jìn)行肝活組織切片以評(píng)估纖維化程度和檢測(cè)硬化存在(Fracanzani等，2001)。肝活組織切片是侵入過(guò)程，它一般難以在正常臨床環(huán)境中的定期跟蹤(follow-up)基礎(chǔ)上進(jìn)行。因此檢測(cè)肝硬化的特定血清標(biāo)記可對(duì)腸胃病學(xué)實(shí)踐有很顯著的作用，能定期跟蹤慢性肝病患者和提供硬化發(fā)作的早期預(yù)警。在特定的慢性酒精中毒病例中，用于硬化的血清標(biāo)記能提供重要意見(jiàn)以說(shuō)服病人停止酗酒。
本領(lǐng)域描述碳水化合物代謝病中診斷多糖的測(cè)量應(yīng)用(WO9219975)。在肝障礙領(lǐng)域中，已知單一糖基化酶活性在肝障礙中改變。例如，酶UDP-N-乙酰-葡糖胺糖蛋白N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(GnTIII)活性增加與肝病進(jìn)展相關(guān)(Ishibashi等，1989)，這是近來(lái)在診斷背景中闡明的一個(gè)發(fā)現(xiàn)(Mori等，1998)。然而，HPLC分離酶反應(yīng)產(chǎn)物使這些測(cè)定復(fù)雜。此外，在貯存條件下血清中酶的穩(wěn)定性未知且獲得用于血清GnTIII活性的值在硬化和慢性肝炎間有較大重疊。也研究純化蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的糖基化差異，這些差異用于檢測(cè)慢性酒精中毒(Matsumoto K.等，(1994)Clin.Chim.Acta 224(1)1-8)。單一純化蛋白碳水化合物部分的改變也在人肝硬化腹水中描述(Biou，D.等(1987)Biochimica et Biophysica Acta 913，308-312。專(zhuān)利EP0503886和DE3838718描述檢測(cè)肝病的方法。然而，后面的專(zhuān)利涉及尿中簡(jiǎn)單碳水化合物(巖藻糖)的定量?，F(xiàn)有領(lǐng)域目前沒(méi)有能簡(jiǎn)單測(cè)量、可靠的血清標(biāo)記來(lái)區(qū)分肝硬化和其它肝障礙。在本發(fā)明中，我們鑒定了多個(gè)診斷碳水化合物參數(shù)，碳水化合物獲自硬化病人血清中存在的蛋白庫(kù)。血清中存在糖基化和未糖基化蛋白的復(fù)雜混合物，它們獲自肝和血漿細(xì)胞。我們意外發(fā)現(xiàn)糖蛋白混合物上存在的相對(duì)量診斷碳水化合物用作診斷標(biāo)記，用于區(qū)分肝硬化病人與慢性肝炎病人以及區(qū)分肝硬化與其它非惡性和惡性肝障礙，糖蛋白存在于總血清。分析總血清糖蛋白庫(kù)的優(yōu)勢(shì)是制備樣品所需工作量減少到最小。這可分析臨床相關(guān)的病人數(shù)。
附圖和圖表的概述

圖1 分布例上圖包含葡聚糖水解產(chǎn)物且能用于分配葡萄糖單位值給各峰。第2幅圖顯示獲自對(duì)照血清樣品蛋白的N-多糖的典型電色譜。此檢測(cè)范圍中有9個(gè)明顯可見(jiàn)的峰且它們的高度用于獲得此發(fā)明所有樣品分布的數(shù)字描述。第3幅圖顯示獲自硬化病例的電色譜。額外峰10、11、12、13和14(見(jiàn)插入框)僅在10倍更高N-多糖濃度后的電色譜中可見(jiàn)，N-多糖獲自血清蛋白。一些分布改變明顯并形成診斷標(biāo)記的基礎(chǔ)。
圖2概括數(shù)據(jù)的框圖(boxplot)樣品分成圖1所示的7組(編號(hào)0到6)，第4列。對(duì)于9個(gè)峰，這7組值的中值由較粗黑線表示且四分位之間的范圍由框和誤差柱表示。對(duì)于峰1、2、3、7和8，樣品組0和2的內(nèi)部四分位數(shù)間范圍與另一邊的組1不重疊，計(jì)算峰1、2、7和峰8間的相對(duì)量以產(chǎn)生3個(gè)新變量，其性質(zhì)總結(jié)于圖右列。注意到縱座標(biāo)刻度是這3個(gè)新變量的對(duì)數(shù)。
圖3用接受操作曲線(ROC)分析和二元邏輯回歸評(píng)估3個(gè)變量的診斷效率第1部分進(jìn)行ROC分析以評(píng)估3個(gè)變量區(qū)分硬化樣品組與無(wú)硬化的慢性病毒性肝炎組的效率。從這些ROC曲線(最優(yōu)結(jié)合的敏感性和特異性)確定的截?cái)嘀涤糜诖藞D隨后的第2、3、4、5和6部分以分開(kāi)象限中的二維散射圖區(qū)域(右上側(cè)象限是肝硬化陽(yáng)性象限，另3個(gè)象限構(gòu)成陰性區(qū)域)。這些散射圖也顯示從二元邏輯回歸分析獲得的回歸線，每次有2個(gè)變量獨(dú)立。硬化樣品組在各散射圖中表示為黑三角。各部分的“陰性”組以圓或正方形表示。第7部分用ROC分析比較硬化樣品組和無(wú)硬化的慢性病毒性肝炎組間的分類(lèi)效率，用變量Log(峰7/峰8)和血清白蛋白濃度和總血清膽紅素濃度。結(jié)果顯示獲自血清N-多糖分布的標(biāo)記在錯(cuò)分類(lèi)病例中速度減少約5倍(約25分之一相對(duì)約4分之1(膽紅素)或5分之1(白蛋白)。第8部分確認(rèn)用于血清N-多糖分布獲得標(biāo)記的ROC獲得截?cái)嘀?，這些值用于分類(lèi)第2組有或沒(méi)有硬化的慢性肝炎病人的獨(dú)立組。此第2組獲得的分類(lèi)效率很類(lèi)似最優(yōu)組(見(jiàn)圖的第2部分)。
圖4差異調(diào)節(jié)的N-多糖的部分結(jié)構(gòu)分析此圖中的3列代表對(duì)獲自3個(gè)血清樣品糖蛋白的N-多糖進(jìn)行外切糖苷酶陣列測(cè)序的結(jié)果。選擇這些樣品以反映此研究中觀察到的變化的定量范圍。最左邊的測(cè)序列從慢性肝炎樣品分析中獲得且不能與健康對(duì)照分布相區(qū)分。中間列代表輕微變化，已違反本文所述全部3個(gè)變量的截?cái)嘀怠Ｓ覀?cè)列來(lái)自影響最壞樣品之一的分析。比較本文所述峰和這3列有用，此比較可能大幅簡(jiǎn)化外切糖苷酶測(cè)序圖中的峰追蹤。以黑色表示的峰不攜帶對(duì)分的GlcNAc殘基。在此方面，能認(rèn)為它們是三甘露糖基-GlcNAc2核心寡糖的衍生物。發(fā)現(xiàn)以灰色表示的峰都用對(duì)分GlcNAc殘基修飾并因此都能認(rèn)為是對(duì)分GlcNAc取代的三甘露糖基-GlcNAc2核心寡糖的衍生物。中間測(cè)序列下的參考圖集合自6個(gè)不同電色譜，各色譜包含對(duì)具已知結(jié)構(gòu)的參考多糖的特異外切糖苷酶消化。所用參考多糖是1)三唾液酸(trisialo)，三半乳糖三觸角(trigalacto triantennary)；2)二唾液酸，二半乳糖二觸角，有核心-α-1，6-連接巖藻糖(中間列下的參考圖)和3)脫唾液酸，二半乳糖二觸角，有核心-α-1，6-連接巖藻糖和對(duì)分GlcNAc(最右列下的參考圖)。
圖5核心-巖藻糖基化變量特征為評(píng)估硬化組的核心-α-1，6-巖藻糖基化是否增加，通過(guò)總和所有攜帶此修飾的鑒定峰的正常峰高來(lái)建立新變量。顯示與圖2類(lèi)似的框圖以及NOVA和隨后posthoc測(cè)試的結(jié)果。再次留出硬化組作為同型亞組，因此確認(rèn)這些疾病中的核心-巖藻糖基化增加。
圖6區(qū)分有和沒(méi)有肝細(xì)胞癌的硬化病例有和沒(méi)有肝細(xì)胞癌的硬化病例散射圖描繪峰7相對(duì)峰14的高度(見(jiàn)圖1)，此圖關(guān)于血清蛋白N-多糖分布的總測(cè)量峰高標(biāo)準(zhǔn)化。僅有硬化的病例表示為空心三角。有硬化和HCC的病例表示為黑色頂向下三角。二元邏輯回歸可鑒定HCC病例，其敏感性為71％且特異性為90％。該模型的邏輯函數(shù)是Z＝-0.649[％峰7]+5.722[％峰14]+2.967。圖中的對(duì)角線是截?cái)嗑€，線上各點(diǎn)是屬于兩個(gè)區(qū)別組中任一一組可能性相等的病例。
發(fā)明的目標(biāo)和詳細(xì)描述復(fù)雜多糖研究(糖生物學(xué)(Kobata，2000；Roseman，2001))開(kāi)始發(fā)展成一種更全面的方法，可稱(chēng)為糖組學(xué)(glycomics)(Hirabayashi等，2001；Taniguchi等，2001)。與蛋白質(zhì)組學(xué)類(lèi)似，糖組學(xué)能定義為在定量基礎(chǔ)上研究生物樣品中所有或特定糖綴合物種類(lèi)中存在的多糖并比較所得分布以獲得生物信息。在基礎(chǔ)研究方面，功能糖(蛋白)組學(xué)想要通過(guò)檢測(cè)糖組(glycome)變化來(lái)闡明糖綴合物多糖部分在不同生理過(guò)程范圍中的作用并隨后確定攜帶改變多糖的非多糖部分(大部分是蛋白)特性。在此方面，其方法與基礎(chǔ)蛋白質(zhì)組學(xué)研究類(lèi)似，但所用技術(shù)一般對(duì)于發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室外的應(yīng)用過(guò)于復(fù)雜和/或費(fèi)時(shí)。特別是在需要分析數(shù)百個(gè)樣品以獲得有意義信息的臨床領(lǐng)域，目前的糖組學(xué)方法由于其復(fù)雜性有顯著的缺點(diǎn)。在本發(fā)明中，我們發(fā)展了技術(shù)平臺(tái)用于檢測(cè)肝硬化的臨床糖組學(xué)研究。我們獲得碳水化合物結(jié)構(gòu)分布，碳水化合物來(lái)自血清中存在的糖蛋白，且鑒定患肝硬化病人和無(wú)肝硬化病人間多糖分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)差異。換句話說(shuō)，本發(fā)明鑒定診斷碳水化合物量或所述碳水化合物間的相對(duì)量與肝硬化存在相關(guān)。能完成本發(fā)明肝硬化診斷測(cè)試所用的碳水化合物分布，例如用Applied Biosystems 377凝膠-基礎(chǔ)DNA測(cè)序儀(Callewaert等，2001)。
因此，用本發(fā)明診斷方法能可靠區(qū)分肝硬化和并發(fā)肝細(xì)胞癌的肝硬化病人與(1)健康供體、(2)患慢性乙肝或丙肝的病人、(3)患風(fēng)濕癥的病人、(4)懷疑慢性酗酒的病人和(5)無(wú)HCC轉(zhuǎn)移到肝的病人。另外，發(fā)明的診斷方法也能診斷肝硬化背景中肝細(xì)胞癌(HCC)的傾向性和存在。我們能區(qū)分肝硬化病人與上述5個(gè)敏感性和特異性從不低于90％的組，在最相關(guān)診斷中(硬化與健康志愿者間的區(qū)別和硬化與患慢性肝炎病人間的區(qū)別)，敏感性和特異性的值高于95％。
由于目前沒(méi)有用于硬化的容易測(cè)量和特異血清診斷標(biāo)記，使用此非侵入性診斷測(cè)試可包括硬化治療中的治療決定指導(dǎo)(當(dāng)前僅肝移植能治愈)、接近監(jiān)控硬化陽(yáng)性病人的肝細(xì)胞癌發(fā)展和評(píng)估呈現(xiàn)慢性酒精消耗病人的肝損壞程度。此硬化的血清標(biāo)記也能用于非侵入性研究在疫苗臨床試驗(yàn)中慢性感染丙肝病毒的病人轉(zhuǎn)變成硬化的速度，肝硬化發(fā)病率減少和/或發(fā)作延遲構(gòu)成重要的臨床終點(diǎn)，此終點(diǎn)目前很難估定，因?yàn)樾枰秩胄曰罱M織切片技術(shù)。
在第1個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法，包括a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和b)在步驟a)的分布中測(cè)量至少1種碳水化合物或其衍生片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或所述碳水化合物分布中存在的至少1種碳水化合物或其衍生片段的特征的量，和c)比較步驟b)獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)和從無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物分布獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)，以及d)將步驟c)所得偏差歸于肝硬化。措詞‘檢測(cè)肝硬化的方法’可廣泛理解為篩選方法、診斷方法或預(yù)測(cè)肝硬化的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，碳水化合物分布用于產(chǎn)生檢測(cè)肝硬化的診斷測(cè)定，所述診斷測(cè)定包括下列步驟a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和b)在步驟a)的分布中測(cè)量至少1種碳水化合物或其衍生片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或所述碳水化合物分布中存在的至少1種碳水化合物或其衍生片段的特征的量，和c)比較步驟b)獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)和從無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物分布獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)，以及d)將步驟c)所得偏差歸于肝硬化。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法，包括(a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，并比較所述分布的定量和定性方面與從1個(gè)或多個(gè)所述哺乳動(dòng)物種類(lèi)個(gè)體獲得的所述分布的定量或定性方面。
措詞‘存在的糖綴合物’指糖綴合物上檢測(cè)到的碳水化合物，沒(méi)有任何分離所述碳水化合物的步驟；因而樣品如此使用且不含任何分離碳水化合物的步驟，其中措詞‘或分離自體液樣品’指碳水化合物從樣品中存在的糖綴合物分離。
在特定實(shí)施方案中，發(fā)明方法能用于監(jiān)控施用給患肝硬化哺乳動(dòng)物的療法效果。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明方法特定檢測(cè)肝硬化。術(shù)語(yǔ)‘特定’指能差異診斷肝硬化和其它肝障礙，包括患乙肝或丙肝感染的哺乳動(dòng)物。
術(shù)語(yǔ)‘碳水化合物’可理解為糖綴合物結(jié)構(gòu)中存在或獲自糖綴合物的多糖，包括本領(lǐng)域已知多糖類(lèi)別如蛋白的天冬酰胺-連接多糖(也名為N-多糖)或絲氨酸/蘇氨酸-連接多糖(也名為O-多糖)或來(lái)自多糖的粘多糖或蛋白多糖，多糖存在于或獲自糖脂和GPI-錨獲得碳水化合物。單詞“多糖”和“碳水化合物”可互換。‘糖綴合物’指任何含碳水化合物部分的化合物(如蛋白或脂類(lèi))。措詞‘糖綴合物混合物’所指組合物含至少2種(至少3種、至少4種、至少5種或更多)所述糖綴合物，可能也包括非糖綴合物質(zhì)如蛋白、脂類(lèi)、鹽和水。措詞‘碳水化合物或其片段’指碳水化合物可片段化以在產(chǎn)物片段化過(guò)程中產(chǎn)生至少1種寡糖或其衍生物。此片段化方法的其它產(chǎn)物可包括單糖和寡糖或其衍生物。寡糖是碳水化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由至少2個(gè)本領(lǐng)域已知作為單糖的化學(xué)相連單位組成。所述片段化方法能包括酶、化學(xué)和物理處理。例如，處理(或消化)碳水化合物可用糖苷酶(如用于從碳水化合物中取出唾液酸殘基的唾液酸酶，或從碳水化合物中取出巖藻糖殘基的巖藻糖苷酶)，因此所得分布由碳水化合物片段組成。例如能完成糖苷酶消化以獲得更簡(jiǎn)單的碳水化合物分布。唾液酸也可以化學(xué)方式通過(guò)溫和酸水解碳水化合物取出。在質(zhì)譜分析方法中，單詞‘片段’指碳水化合物常在分析方法中片段化(例如在碰撞誘導(dǎo)的分離中)，其中產(chǎn)物片段化也能產(chǎn)生寡糖衍生物，它由與1個(gè)或多個(gè)單糖剩余物化學(xué)相連的寡糖組成，這些單糖在片段化發(fā)生前是碳水化合物的部分結(jié)構(gòu)。這種寡糖衍生物的例子在本領(lǐng)域已知作為交叉環(huán)切割產(chǎn)物離子，此衍生物是質(zhì)譜片段化方法的產(chǎn)物?！鎏妓衔锾卣鳌溉魏慰蓽y(cè)量參數(shù)，其性質(zhì)和/或量由碳水化合物結(jié)構(gòu)確定。例如這些可測(cè)量參數(shù)的例子是核磁共振參數(shù)如化學(xué)位移、同核和異核偶聯(lián)常數(shù)、核極化效應(yīng)和剩余偶極偶聯(lián)。另外，這些可測(cè)量參數(shù)可以是所述碳水化合物與其它分子如凝集素和抗體的結(jié)合程度，抗體識(shí)別碳水化合物中的特定結(jié)構(gòu)決定簇或其組合。其它這類(lèi)可測(cè)量參數(shù)可以是碳水化合物發(fā)揮作為酶底物功能的能力，酶特異修飾某些碳水化合物如糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶。
措詞‘存在于或獲自糖綴合物混合物的所述碳水化合物或所述片段’指‘分布，分布含碳水化合物或其片段或者所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或者所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征，特征由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定’可獲自仍與混合物中糖綴合物化學(xué)相連的碳水化合物或來(lái)自通過(guò)酶、化學(xué)或物理方式從糖綴合物釋放的碳水化合物。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，N-多糖通過(guò)酶消化從混合物中的糖蛋白釋放，酶消化用肽N-糖苷酶F或其它本領(lǐng)域已知的內(nèi)切糖苷酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，能釋放N-和O-多糖，所用過(guò)程包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的肼。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可根據(jù)熟知過(guò)程用堿性條件下的β消除來(lái)選擇性釋放O-多糖。在仍與混合物中糖綴合物化學(xué)相連的碳水化合物上獲得分布的情況中，一個(gè)實(shí)施方案包括使用酶或化學(xué)過(guò)程以在獲得分布前修飾糖綴合物的非多糖部分，如蛋白酶或修飾糖脂脂部分的酶。措詞‘碳水化合物分布’所指實(shí)體包括所述碳水化合物的定性和/或定量信息。例如，這可指所述碳水化合物的電泳和/或色譜分布。在一個(gè)特定例子中分布是所述碳水化合物的質(zhì)譜。另外，分布可以是通過(guò)核磁共振分析獲得的信息。在另一個(gè)例子中，分布可以是描述結(jié)合碳水化合物的凝集素定性或定量方面的信息。另外，分布可以是描述碳水化合物是特定酶底物程度的信息，如糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶。這些信息可包括這類(lèi)酶反應(yīng)副產(chǎn)物的測(cè)量讀數(shù)，如糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中以等摩爾量釋放的核苷酸。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，措詞‘產(chǎn)生碳水化合物分布’或‘描繪碳水化合物分布’也可指分離多糖結(jié)構(gòu)并隨后檢測(cè)。通常在碳水化合物分布中鑒定一些碳水化合物。碳水化合物一般存在于復(fù)雜混合物且有效檢測(cè)需要分離。能完成分離的方法包括電泳和色譜方法。能完成檢測(cè)的方法包括抗體檢測(cè)、凝集素檢測(cè)、NMR、質(zhì)譜和熒光。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，在能描繪多糖分布前需要從糖蛋白中化學(xué)和/或酶取出多糖。從糖蛋白制備多糖的方法在本領(lǐng)域熟知。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，分離和檢測(cè)前需要衍生多糖。在一種方法中，本發(fā)明描繪多糖分布的方法(包括分離和檢測(cè))能結(jié)合DNA測(cè)序儀完成。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的是此方法也能結(jié)合適應(yīng)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)應(yīng)用。這種系統(tǒng)包括例如P/ACE連續(xù)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(Beckman Instruments，Inc.，F(xiàn)ullerton，Calif.)。發(fā)明也可與任何適應(yīng)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的電泳系統(tǒng)一起應(yīng)用。在又一個(gè)實(shí)施方案中，也可使用質(zhì)譜檢測(cè)方法如MALDI-TOF-MS，它用于測(cè)量至少1種碳水化合物或其片段的量。在質(zhì)譜方法中，通常片段化碳水化合物，因此所述方法中檢測(cè)到碳水化合物片段。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，能用微流控(microfluidics)方法完成分布。微流控是一個(gè)迅速發(fā)展的領(lǐng)域，以通過(guò)固體培養(yǎng)基(大部分是硅薄片或高純度玻璃板)中產(chǎn)生的狹窄孔通道的流體移動(dòng)為基礎(chǔ)，借助來(lái)自微芯片業(yè)的技術(shù)(影印平版和化學(xué)濕蝕刻)。流體能通過(guò)毛細(xì)管作用或主動(dòng)抽吸經(jīng)這些通道移動(dòng)，分析物可通過(guò)電泳在充滿流體的通道中移動(dòng)(Schmalzing等，(2001)Methods Mol.Biol.163，163-173)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，完成碳水化合物分離可通過(guò)層析分離，方法包括薄層層析(TLC)、高效液相色譜或氣相色譜。術(shù)語(yǔ)‘至少1種碳水化合物’指測(cè)量碳水化合物分布中存在的至少1種碳水化合物量，分布與肝硬化檢測(cè)診斷相關(guān)(因此所述至少1種碳水化合物可命名為至少1種診斷碳水化合物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量1種碳水化合物足以診斷肝硬化。這意味著在一個(gè)特定病例中，1種碳水化合物在患硬化的哺乳動(dòng)物中存在且在無(wú)硬化的哺乳動(dòng)物中缺乏，在另一個(gè)特定病例中，1種碳水化合物在無(wú)硬化的哺乳動(dòng)物中存在且在患硬化的哺乳動(dòng)物中缺乏。在又一個(gè)特定例子中，不同量的1種碳水化合物足以區(qū)分患硬化的哺乳動(dòng)物和無(wú)硬化的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，測(cè)量1種、2種或甚至更多(診斷)碳水化合物。在分布方法中，能測(cè)量(診斷)碳水化合物的量，例如通過(guò)計(jì)算峰高或峰表面。通過(guò)比較病人樣品中存在的至少1種(診斷)碳水化合物量與無(wú)肝硬化個(gè)體中存在的對(duì)應(yīng)診斷碳水化合物水平相比，可診斷肝硬化的存在或缺乏。發(fā)明能用于獲自哺乳動(dòng)物如人的樣品。診斷碳水化合物可以是寡糖或多糖。診斷碳水化合物可分支或不分支。來(lái)自肝硬化個(gè)體樣品的診斷碳水化合物存在的豐度(量)恒定高于或低于來(lái)自未患病個(gè)體(沒(méi)有肝硬化)的樣品。術(shù)語(yǔ)“所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物”指用試劑標(biāo)記的碳水化合物，試劑導(dǎo)致有效檢測(cè)碳水化合物。所述標(biāo)記碳水化合物也稱(chēng)為衍生碳水化合物。例如，發(fā)熒光化合物能用于標(biāo)記碳水化合物。所述發(fā)熒光化合物也優(yōu)選帶電，從而衍生化合物可在電泳條件下移動(dòng)。當(dāng)熒光標(biāo)記不帶電時(shí)，它能偶聯(lián)帶電的傳遞(imparting)種類(lèi)。所述熒光團(tuán)標(biāo)記也可通過(guò)熒光定量測(cè)量衍生碳水化合物。發(fā)熒光化合物如9-氨基芘-1，4，6-三磺酸(APTS)和8-氨基萘-1，3，6-三磺酸(ANTS)特別適用于電泳分離衍生碳水化合物。其它用于熒光標(biāo)記碳水化合物的化合物包括2-氨基吡啶(AP)、5-氨基萘-2-磺酸鹽(ANA)、1-氨基-4-萘磺酸(ANSA)、1-氨基-6，8-二磺酸(ANDA)、3-(4-羧基苯甲酰)-2-喹啉羧醛(CBQCA)、熒光黃、2-氨基吖啶酮和4-氨基芐腈(ABN)。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，關(guān)于檢測(cè)熒光標(biāo)記的碳水化合物，可應(yīng)用本領(lǐng)域已知任何檢測(cè)方法，但檢測(cè)優(yōu)選用激光器完成，如二極管激光器、He/Cd激光器或氬離子激光器。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，通過(guò)電泳分離產(chǎn)生的標(biāo)記碳水化合物帶分布用成像系統(tǒng)呈現(xiàn)，系統(tǒng)以電荷-偶聯(lián)裝置(CCD)照相機(jī)為基礎(chǔ)。來(lái)自CCD照相機(jī)的信息可隨后以數(shù)字形式保存并通過(guò)多種計(jì)算機(jī)程序分析，用于比較個(gè)體間和參考標(biāo)準(zhǔn)間的診斷碳水化合物模式。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，凝膠分離的診斷碳水化合物可轉(zhuǎn)至固定膜即印跡，然后用不同診斷碳水化合物-特異試劑探測(cè)如凝集素或者特異于所述診斷碳水化合物的單克隆或多克隆抗體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法，包括測(cè)量和檢測(cè)至少1種多糖結(jié)構(gòu)和/或糖綴合物，它們?cè)谟泻蜎](méi)有硬化的個(gè)體樣品中豐度不同，使用特異結(jié)合所述至少1種多糖結(jié)構(gòu)和/或糖綴合物的配基。配基包括凝集素和抗體。例如，體液樣品中有‘對(duì)分GlcNAc’殘基(GnT-III產(chǎn)物)的N-多糖結(jié)構(gòu)(或其綴合物)豐度增加可用特異識(shí)別多糖(或其綴合物)的凝集素檢測(cè)，多糖用對(duì)分GlcNAc修飾，如來(lái)自Phaseolusvulgaris的紅細(xì)胞凝集素(E-PHA)。另外，如果N-多糖不用對(duì)分GlcNAc殘基取代，可通過(guò)N-多糖(或其綴合物)與僅結(jié)合N-多糖(或其綴合物)的凝集素結(jié)合減少來(lái)檢測(cè)有‘對(duì)分GlcNAc’殘基(或其綴合物)的N-多糖結(jié)構(gòu)豐度增加。這種凝集素的例子是來(lái)自刀豆屬(Canavalia ensiformis)的凝集素(Con A)。檢測(cè)觀察到的血清糖蛋白N-多糖半乳糖基化不足可通過(guò)末端GlcNAc結(jié)合凝集素如Griffoniasimplicifolia II(GS-II)凝集素。另外，測(cè)量半乳糖基化不足可通過(guò)末端半乳糖結(jié)合凝集素的結(jié)合減少，如來(lái)自刺酮屬(Erythrina crystagelli)的凝集素。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，獲得‘由碳水化合物結(jié)構(gòu)確定的特征分布’是通過(guò)測(cè)量構(gòu)成特異糖基轉(zhuǎn)移酶底物的碳水化合物性質(zhì)。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，此糖基轉(zhuǎn)移酶是β-1，4-糖基轉(zhuǎn)移酶且碳水化合物存在于血清或血漿蛋白的總混合物中。此反應(yīng)的另外底物是UDP-半乳糖，反應(yīng)產(chǎn)生stechiometric量的UDP。因此，通過(guò)測(cè)量反應(yīng)前和后的脫唾液酸蛋白半乳糖基化程度差異可獲得分布，例如方法包括糖蛋白結(jié)合特異于末端β-半乳糖的凝集素(如本領(lǐng)域已知獲自蓖麻(Ricinuscommunis)和刺酮crystagelli的凝集素，或galectins如獲自灰色鬼傘(Coprinuscinereus)。另外，通過(guò)測(cè)量血清或血漿蛋白混合物的β-1，4-糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)產(chǎn)生的UDP量可獲得分布，例如通過(guò)HPLC。UDP量也能用偶聯(lián)酶反應(yīng)測(cè)量，反應(yīng)與1種或多種已知來(lái)自核苷酸代謝的酶偶聯(lián)，例如二磷酸核苷酸如酵母Golgi GDPase，它也顯示對(duì)UDP的顯著水解活性。在后一種情況中，分布可通過(guò)測(cè)量UMP或磷酸鹽獲得，使用熟知的技術(shù)。另一個(gè)UDP測(cè)量例子包括使用超分子膜孔，它在本領(lǐng)域已知對(duì)UDP-Gal和UDP的親和性不同。因此，例如所得分布能對(duì)于血清或血漿樣品中存在的蛋白或碳水化合物總量標(biāo)準(zhǔn)化。在又一個(gè)實(shí)施方案中，獲得分布可通過(guò)使用血清或血漿蛋白混合物中作為β-1，4-糖基轉(zhuǎn)移酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶底物存在的碳水化合物，UDP-半乳糖和CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸作為糖供體底物。在此實(shí)施方案中，分布可由反應(yīng)前和后唾液酸結(jié)合凝集素(如本領(lǐng)域熟知的獲自Maackiaamurensis或Sambucus nigra的凝集素)結(jié)合糖蛋白的差異組成，或可由測(cè)量反應(yīng)中釋放的UDP和/或CMP量組成，使用本領(lǐng)域已知方法。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，碳水化合物分布方法能預(yù)電泳添加1個(gè)或多個(gè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)用不同于碳水化合物分析物附著標(biāo)記的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)標(biāo)記。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)可精確和重復(fù)確定衍生碳水化合物的電泳遷移率，這是通過(guò)參考這些遷移率和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)混合物中組成的遷移率。例如，描繪分布前，若丹明標(biāo)記的寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)GenescanTM500(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)或若丹明標(biāo)記的6-、18-、30-和42-聚寡核苷酸的混合物可加入衍生多糖?？杉尤朐\斷標(biāo)準(zhǔn)，然后標(biāo)記用于分析的樣品；然而標(biāo)記診斷標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)選伴隨標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)用于分析。此外，優(yōu)選定量標(biāo)準(zhǔn)中的診斷碳水化合物以提供與樣品中診斷碳水化合物量的定量或定性比較，樣品用于分析。術(shù)語(yǔ)‘體液’包括血液、血清、血漿、唾液、尿、骨髓液、腦脊髓液、滑液、淋巴液、羊水、乳頭吸出液等。用于分析的優(yōu)選體液是常規(guī)獲自病人的體液，特定優(yōu)選體液包括血清和血漿。
盡管完成本發(fā)明可在描繪(衍生)多糖分布前不預(yù)處理樣品，在一個(gè)特定實(shí)施方案中，用于分析的樣品可能需要加工，然后分離和定量診斷碳水化合物。所用樣品加工的精確方法可根據(jù)一些因素變化，這些因素可歸于樣品液選擇和診斷碳水化合物特性；這些因素包括診斷碳水化合物豐度、背景碳水化合物濃度、干擾分子的存在，例如不利影響診斷碳水化合物帶遷移率或熒光標(biāo)記診斷碳水化合物的分子，無(wú)論熒光標(biāo)記是否必須從衍生診斷碳水化合物中分離。用于此加工或預(yù)處理樣品的適當(dāng)方法包括透析，用于去除干擾分子(如用于有效質(zhì)譜檢測(cè)的鹽)；超濾，用于濃縮診斷碳水化合物和去除干擾分子；離心，用于去除干擾分子或濃縮細(xì)胞；沉淀，用于去除干擾分子，從血清中取出白蛋白以富集糖基化蛋白并從而用于較低豐度，用糖苷酶去糖基化(如唾液酸酶消化多糖)以產(chǎn)生更簡(jiǎn)單的多糖分布；層析如親和層析以取出例如來(lái)自血清的白蛋白。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法，所述方法包括(a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和(b)測(cè)量所述碳水化合物分布中存在的至少1種碳水化合物或其片段或者所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物的相對(duì)量。術(shù)語(yǔ)‘測(cè)量相對(duì)量’指可在2個(gè)分布間測(cè)量至少1種碳水化合物或片段(如1種特定的碳水化合物或片段)的量，1個(gè)分布獲自無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物且另1個(gè)分布獲自可能患肝硬化并待診斷肝硬化的哺乳動(dòng)物。另外，可在取自無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物的平均參考范圍和待診斷肝硬化哺乳動(dòng)物中所述特定碳水化合物的測(cè)量量間比較1種特定碳水化合物的量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，‘測(cè)量相對(duì)量’指測(cè)量1個(gè)碳水化合物分布中存在的至少2種碳水化合物或其片段或者所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物的相對(duì)量、所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的特征，分布獲自動(dòng)物體液樣品。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，為了能夠測(cè)量碳水化合物的相對(duì)量，凝膠上包含診斷標(biāo)準(zhǔn)，用于分析受試者樣品中的診斷碳水化合物；然而，診斷標(biāo)準(zhǔn)體現(xiàn)的信息如帶移動(dòng)距離和強(qiáng)度，也能通過(guò)與保存記錄比較來(lái)獲得，保存記錄產(chǎn)生自以前進(jìn)行過(guò)熒光團(tuán)協(xié)助碳水化合物電泳的診斷標(biāo)準(zhǔn)，電泳條件類(lèi)似用于分析的樣品所受到的條件。診斷標(biāo)準(zhǔn)可以都是陽(yáng)性即對(duì)應(yīng)于患病個(gè)體的完整碳水化合物模式，或是陰性即對(duì)應(yīng)于未患病個(gè)體。診斷標(biāo)準(zhǔn)的組成可類(lèi)似于用于分析的樣品，它們可包含診斷碳水化合物和背景碳水化合物，背景碳水化合物組成與實(shí)際樣品中發(fā)現(xiàn)的相似。診斷標(biāo)準(zhǔn)能從來(lái)自患病和未患病個(gè)體的樣品獲得。另外，診斷標(biāo)準(zhǔn)可包含1種或多種無(wú)背景碳水化合物的診斷碳水化合物。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，測(cè)量肝硬化的診斷技術(shù)不需要了解碳水化合物結(jié)構(gòu)的現(xiàn)有詳細(xì)知識(shí)。
在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，測(cè)量肝硬化的診斷技術(shù)使用碳水化合物結(jié)構(gòu)的知識(shí)。不同調(diào)節(jié)多糖的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可概括為N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III產(chǎn)物的峰度增加(對(duì)分GlcNAc，圖1所示峰2、4和7的多糖結(jié)構(gòu))，二觸角多糖的半乳糖基化減少(圖1所示峰1和2的多糖結(jié)構(gòu)強(qiáng)度提高)，二和三觸角充分半乳糖基化多糖結(jié)構(gòu)的峰度降低(圖1所示峰3和8的多糖結(jié)構(gòu))。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法，所述方法包括生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，并測(cè)量所述碳水化合物分布中存在的至少1種碳水化合物或其片段或者所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物的相對(duì)量、或者至少1種碳水化合物或其片段的特征，其中所述至少1種碳水化合物選自i)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(多糖1)，ii)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(多糖2)，iii)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc(多糖3)，iv)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(多糖7)，v)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)]Man(α-1，3)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc(多糖8)，vi)衍生自多糖1、2、3、7或8的片段，vii)多糖1、2、3、7或8的唾液酸衍生物，viii)多糖1、2、3、7或8或其衍生物或片段的特征。
為了闡明，峰1、2、3、7和8的結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于圖1所示碳水化合物分布和圖4中這些結(jié)構(gòu)的圖解。所述碳水化合物分布是脫唾液酸分布(多糖上沒(méi)有唾液酸)，意味著峰1、2、3、7和8的結(jié)構(gòu)嚴(yán)格稱(chēng)為碳水化合物片段(缺失唾液酸結(jié)構(gòu))。本文用IUPAC命名規(guī)則表示碳水化合物(http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/2carb/38.html)，本發(fā)明鑒定根據(jù)圖1的峰并通過(guò)其精簡(jiǎn)和擴(kuò)展命名來(lái)表示。在權(quán)利要求中，使用精簡(jiǎn)命名。
來(lái)自圖1的峰1的脫唾液酸多糖結(jié)構(gòu)精簡(jiǎn)命名GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc擴(kuò)展命名β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-[α-L-Fucp-(1→6)]-D-GlcpNAc來(lái)自圖1的峰2的脫唾液酸多糖結(jié)構(gòu)精簡(jiǎn)命名GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc擴(kuò)展命名β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-GlcpNAc-(1→4)][β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-[α-L-Fucp-(1→6)]-D-GlcpNAc來(lái)自圖1的峰3的脫唾液酸多糖結(jié)構(gòu)精簡(jiǎn)命名Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc擴(kuò)展命名β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-D-GlcpNAc來(lái)自圖1的峰7的脫唾液酸多糖結(jié)構(gòu)精簡(jiǎn)命名
Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc擴(kuò)展命名β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-GlcpNAc-(1→4)][β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-[α-L-Fucp-(1→6)]-D-GlcpNAc來(lái)自圖1的峰8的脫唾液酸多糖結(jié)構(gòu)精簡(jiǎn)命名Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)]Man(α-1，3)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc擴(kuò)展命名β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-[β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)]-α-D-Manp-(1→3)-[β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→2)-α-D-Manp-(1→6)]-β-D-Manp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-D-GlcpNAc在另外一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)肝硬化的方法，包括步驟(a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和(b)測(cè)量多糖結(jié)構(gòu)1或其片段和多糖結(jié)構(gòu)8或其片段和/或多糖結(jié)構(gòu)2或其片段和多糖結(jié)構(gòu)8或其片段和/或多糖結(jié)構(gòu)7或其片段和多糖結(jié)構(gòu)8或其片段和/或多糖結(jié)構(gòu)1或其片段和多糖結(jié)構(gòu)3或其片段和/或多糖結(jié)構(gòu)2或其片段和多糖結(jié)構(gòu)3或其片段和/或多糖結(jié)構(gòu)7或其片段和多糖結(jié)構(gòu)3或其片段的相對(duì)量。
多糖結(jié)構(gòu)1、2、7和8的平均峰高在不同病人組中計(jì)算。硬化組(n＝37)的這些多糖結(jié)構(gòu)間的平均相對(duì)量是峰1/峰82.444，峰2/峰80.590和峰7/峰81.479。健康對(duì)照組(n＝60)的平均相對(duì)量是峰1/峰80.809，峰2/峰80.081和峰7/峰80.7234。這意味著當(dāng)峰1/峰8間的相對(duì)量比此健康群體平均值高3.02倍時(shí)和/或當(dāng)峰2/峰8間的相對(duì)量比此健康群體平均值高7.28倍時(shí)和/或當(dāng)峰7/峰8間的相對(duì)量比此健康群體平均值高2.04倍時(shí)，樣品診斷為有硬化。
硬化組(n＝27)的這些多糖結(jié)構(gòu)間的相對(duì)量是峰1/峰81.21，峰2/峰80.25和峰7/峰80.95。這意味著當(dāng)峰1/峰8間的相對(duì)量比此慢性肝炎組平均值高2.01倍時(shí)和/或當(dāng)峰2/峰8間的相對(duì)量比此慢性肝炎組平均值高2.36倍時(shí)和/或當(dāng)峰7/峰8間的相對(duì)量比此慢性肝炎組平均值高1.56倍時(shí)，樣品診斷為有硬化。
完整對(duì)照群體(n＝153，由健康個(gè)體、患慢性肝炎的個(gè)體和患慢性酒精中毒的個(gè)體組成)的這些多糖結(jié)構(gòu)間的相對(duì)量是峰1/峰80.98，峰2/峰80.115和峰7/峰80.87。這意味著當(dāng)峰1/峰8間的相對(duì)量比此完整對(duì)照群體平均值高2.49倍時(shí)和/或當(dāng)峰2/峰8間的相對(duì)量比此完整對(duì)照群體平均值高5.13倍時(shí)和/或當(dāng)峰7/峰8間的相對(duì)量比此完整對(duì)照群體平均值高1.7倍時(shí)，樣品診斷為有硬化。
因此在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)峰1/峰8間的比例(相對(duì)量)高于至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的對(duì)照群體平均值相對(duì)量時(shí)，樣品診斷為獲自患肝硬化的哺乳動(dòng)物。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)肝硬化的方法，包括步驟(a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和(b)測(cè)量多糖結(jié)構(gòu)1或其片段和多糖結(jié)構(gòu)8或其片段的相對(duì)量，其中所述多糖結(jié)構(gòu)或其片段間的所述相對(duì)量比無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物中所述相對(duì)量平均值高至少80％。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)峰2/峰8間的相對(duì)量高于至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％的對(duì)照群體平均值相對(duì)量高時(shí)，樣品診斷為獲自患肝硬化的哺乳動(dòng)物。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)肝硬化的方法，包括步驟(a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和(b)測(cè)量多糖結(jié)構(gòu)2或其片段和多糖結(jié)構(gòu)8或其片段的相對(duì)量，其中所述多糖結(jié)構(gòu)或其片段間的所述相對(duì)量比無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物中所述相對(duì)量平均值高至少100％。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)峰7/峰8間的相對(duì)量高于至少20％、至少30％、至少40％的對(duì)照群體平均值相對(duì)量時(shí)，樣品診斷為獲自患肝硬化的哺乳動(dòng)物。
在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，發(fā)明提供檢測(cè)肝硬化的方法，包括步驟(a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，(b)測(cè)量多糖結(jié)構(gòu)7或其片段和多糖結(jié)構(gòu)8或其片段的相對(duì)量，其中所述多糖結(jié)構(gòu)或其片段間的所述相對(duì)量比無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物中所述相對(duì)量平均值高至少40％。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明也包括進(jìn)行肝硬化診斷的試劑盒。例如，能產(chǎn)生進(jìn)行熒光團(tuán)協(xié)助碳水化合物電泳診斷肝硬化的試劑盒。另一個(gè)例子是產(chǎn)生質(zhì)譜肝硬化診斷的試劑盒。熒光團(tuán)協(xié)助碳水化合物電泳診斷試劑盒提供進(jìn)行肝硬化診斷所需的試劑組合。適當(dāng)試劑盒使實(shí)驗(yàn)室能方便地進(jìn)行熒光團(tuán)協(xié)助碳水化合物電泳診斷。試劑盒可包括用于鑒定肝硬化測(cè)試的試劑。試劑盒可包括診斷標(biāo)準(zhǔn)，熒光標(biāo)記，印跡和結(jié)合材料如膜、碳水化合物特異結(jié)合試劑、凝集素、說(shuō)明、樣品容器、聚丙烯酰胺凝膠試劑、預(yù)制凝膠、酶緩沖液、還原劑(用于熒光團(tuán)標(biāo)記碳水化合物)和能催化結(jié)構(gòu)性改變?cè)\斷碳水化合物反應(yīng)的糖苷酶(如唾液酸酶、半乳糖苷酶、巖藻糖苷酶)。更完整的試劑盒能包括進(jìn)行熒光團(tuán)協(xié)助碳水化合物電泳的裝置，如聚丙烯酰胺凝膠設(shè)備、CCDs、激光器、DNA測(cè)序儀、計(jì)算機(jī)、軟件等。熒光團(tuán)協(xié)助碳水化合物電泳診斷試劑盒所含試劑優(yōu)選以預(yù)測(cè)定量提供。試劑盒優(yōu)選包括完成本發(fā)明熒光團(tuán)協(xié)助碳水化合物電泳方法的說(shuō)明。
診斷測(cè)試用于實(shí)踐，因?yàn)樗?jiǎn)單到足以由正常訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)室人員大規(guī)模應(yīng)用。此外，由于以電泳為基礎(chǔ)的高分辨和高敏感性DNA測(cè)序和突變檢測(cè)分析器迅速在越來(lái)越多的臨床實(shí)驗(yàn)室中存在或大部分臨床實(shí)驗(yàn)室能負(fù)擔(dān)得起，可在它們上面運(yùn)行新的診斷糖組學(xué)測(cè)試。此外，可用范圍的DNA分析器能從每天每臺(tái)機(jī)器幾百到數(shù)百個(gè)樣品中容易地測(cè)量樣品產(chǎn)量，這取決于各實(shí)驗(yàn)室需求。此DNA分析裝置提供自動(dòng)化、總分析方法復(fù)雜性降低的附加優(yōu)勢(shì)?？偺堑鞍谆旌衔锏姆植荚黾訙y(cè)試容許量，測(cè)試用于混合物中各單獨(dú)糖蛋白豐度和糖基化模式的個(gè)體間小變化，因而能比目前經(jīng)典方法更有力測(cè)試，經(jīng)典方法中糖基化在純化糖蛋白上研究。
在另外一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)肝硬化的方法進(jìn)一步包括臨床化學(xué)參數(shù)和/或組織學(xué)數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明也能結(jié)合臨床化學(xué)參數(shù)和/或組織學(xué)和/或成像參數(shù)方便地完成。測(cè)量臨床化學(xué)參數(shù)包括測(cè)量膽紅素、白蛋白、凝血酶原時(shí)間、C-反應(yīng)蛋白、IgA豐度、血清透明質(zhì)酸濃度、轉(zhuǎn)氨酶和一些本領(lǐng)域已知肝代謝測(cè)試的水平。組織學(xué)包括肝活組織切片檢查。成像包括超聲波、CT-掃描、MRI-掃描和特異于肝的放射性追蹤物成像。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供方法檢測(cè)肝硬化哺乳動(dòng)物中肝細(xì)胞癌的存在或傾向性，包括(a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和b)在步驟a)的分布中測(cè)量至少1種碳水化合物或其衍生片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或所述碳水化合物分布中存在的至少1種碳水化合物或其衍生片段的特征的量，和c)比較步驟b)獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)和從肝硬化但無(wú)肝細(xì)胞癌的哺乳動(dòng)物分布獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)，以及(d)將步驟c)所得偏差歸于肝細(xì)胞癌的存在。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在檢測(cè)步驟c)中肝細(xì)胞癌存在或傾向性的方法中，二參數(shù)分析用獲自人血清碳水化合物分布的多糖7和14完成。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述二參數(shù)分析是二參數(shù)二元邏輯回歸分析。
提供下列例子作為某些實(shí)施方案的描述。它們僅用于示范且本身不限制。
實(shí)施例數(shù)據(jù)收集和糖組學(xué)血清分布特征獲得完整蛋白收集中存在的N-多糖庫(kù)分布，蛋白存在于214種人血清，從5μl血清起始，沒(méi)有任何預(yù)處理。Applied Biosystems 377 DNA測(cè)序儀用于此研究。14個(gè)峰的峰高在各分析血清樣品中定量，占＞99％的總觀察信號(hào)強(qiáng)度。我們將討論限于8到12個(gè)葡萄糖單位遷移范圍中的9個(gè)峰(圖1)。它們的強(qiáng)度高到足以進(jìn)行容易的常規(guī)定量。
統(tǒng)計(jì)加工由于我們研究的‘omics’設(shè)置，我們以純統(tǒng)計(jì)方法處理數(shù)據(jù)分析，沒(méi)有偏向所測(cè)峰特征。
圖2概括了7個(gè)樣品組中這9個(gè)峰的數(shù)據(jù)特征(中值和四分位間范圍)。在分析早期，我們觀察到患肝細(xì)胞癌病人樣品中產(chǎn)生的分布變化很類(lèi)似于肝硬化病人(此分布變化的一般特征通過(guò)比較圖1下面的2個(gè)圖而明顯)。由于此研究中所有患肝細(xì)胞癌的病人也有肝硬化(16)，我們決定在進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析中將這些樣品視作一組(n＝37，表1中的組1)，命名為硬化組。組0由60個(gè)來(lái)自紅十字會(huì)血液供體的對(duì)照樣品組成。來(lái)自患慢性乙肝或丙肝且無(wú)硬化病人的所有樣品一起納入組2(n＝27)。組3由8個(gè)無(wú)HCC轉(zhuǎn)移到肝的病人樣品組成。組4中，所有樣品從懷疑慢性酗酒且碳水化合物缺陷轉(zhuǎn)鐵蛋白(CDT)測(cè)試結(jié)果陽(yáng)性的病人中集合。血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的糖基化程度對(duì)最近(2-3周)的酒精攝入做出響應(yīng)且是目前檢測(cè)慢性酗酒的最佳血清標(biāo)記(Anton，2001；Wuyts等，2001)。顯然CDT的存在能影響本文所測(cè)總血清糖蛋白的糖基化分布。為了比較目的，組5由CDT為負(fù)的慢性酗酒者樣品(n＝33)組成。最后，組6由來(lái)自自身免疫紊亂病人的樣品組成(n＝24)。IgG的糖基化改變(特別是糖基化不足和α-1，6-連接的核心巖藻糖存在增加)在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎中詳細(xì)記載(Martin等，2001；Watson等，1999)并也能影響總血清糖蛋白的多糖模式，因?yàn)镮gG是很豐富的血清蛋白。
從圖2的數(shù)據(jù)中顯然硬化組的峰1、2和7上調(diào)且峰3和8下調(diào)充分，從而硬化組值的內(nèi)部四分位數(shù)間范圍不與對(duì)照組(組0)的內(nèi)部四分位數(shù)間范圍重疊。此外，如Spearman相關(guān)性分析(表2)所示，這些變化高度相關(guān)。因此，我們通過(guò)按比例測(cè)量(scaling)上調(diào)峰1、2和7到下調(diào)峰8建立了新變量，隨后對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化這些新變量以使分配標(biāo)準(zhǔn)化?？紤]不同峰4量的分析不提高分類(lèi)效率(見(jiàn)下)，結(jié)合峰3下調(diào)的分析也不提高效率。圖2的右圖概括了所得3個(gè)新變量的值。為檢測(cè)7個(gè)樣品組間這些新變量平均值的顯著差異，進(jìn)行單項(xiàng)變化分析，接著用2個(gè)不同的多比較檢驗(yàn)(Tukey真實(shí)顯著差異檢驗(yàn)和Scheffé比較)以查明特定組間差異。對(duì)于所有3個(gè)變量，familywise誤差率為0.0001時(shí)，硬化組與所有其它樣品組顯著不同(表3)。此差異的分類(lèi)效率用無(wú)參數(shù)接受操作曲線(ROC)分析和二元邏輯回歸評(píng)估。為了最佳臨床相關(guān)性和在咨詢合作肝臟病學(xué)者(H.Van Vlierberghe博士，UZGent)后，這些分類(lèi)算法用于比較硬化組和患慢性乙肝或丙肝的病人組。在典型的腸胃病學(xué)臨床環(huán)境中，硬化檢測(cè)在慢性肝炎患者(和有慢性酗酒的病人)中最相關(guān)。在我們部署中的慢性酗酒病人樣品組關(guān)于硬化存在的特征確定不充分，不能將此收集包括在截?cái)嘀荡_定中。圖3.1顯示ROC分析結(jié)果且獲得約為95％的滿意分類(lèi)效率。獲自ROC曲線的截?cái)嘀?在此值時(shí)達(dá)到最高的組合敏感性和特異性)表示為分開(kāi)象限中圖3剩余部分的二維散射圖的線。將散射圖一分為二的斜線是回歸線，從2個(gè)變量的線性二元邏輯回歸模型中計(jì)算。比較計(jì)算截?cái)嘀蹬c回歸線區(qū)分硬化組和所有其它樣品組的效率有益(圖3.2-6)。一般觀察到‘雙重ROC’分類(lèi)比回歸方法特異性高且敏感性低。在區(qū)分硬化組和慢性肝炎組中，敏感性和特異性都在90-98％的范圍內(nèi)。如圖3.3所見(jiàn)，對(duì)于雙重ROC分類(lèi)，紅十字會(huì)健康血液供體的樣品組沒(méi)有(左和右圖)或僅有1個(gè)(60，中央的圖)假陽(yáng)性，對(duì)于回歸方法，沒(méi)有(右圖)或僅有1個(gè)(中央和左)假陽(yáng)性。這接近100％特異性，敏感性約為95％，與區(qū)分慢性肝炎所得值很類(lèi)似，再次表明所測(cè)變量指示病理變化，此變化特異于硬化且不隨著慢性肝炎發(fā)作顯著改變(也能獲自ANOVA結(jié)果)。在結(jié)合參數(shù)Log(峰7/峰8)的回歸分析中特定觀察到來(lái)自慢性酗酒者的樣品組中有更多假陽(yáng)性(圖3.4)。然而，有另2個(gè)參數(shù)之一的雙重ROC分類(lèi)仍使這些病例保持在‘陽(yáng)性區(qū)’外。在自身免疫疾病組中(圖3.5)，假陽(yáng)性主要是由于25％病例的Log(峰1/峰8)值增加和由于17％病例的Log(峰7/峰8)值增加。Log(峰2/峰8)僅在1個(gè)病例(4％)中違反截?cái)嘀怠Ｔ俅?，在使這些病例保持在陽(yáng)性區(qū)外上，雙重ROC分析比二元邏輯回歸更成功。圖3.6給出所有這些分析的總圖象。總體上，最左側(cè)圖中的參數(shù)組合產(chǎn)生此‘方便樣品’集合的最佳結(jié)果，通過(guò)二元邏輯回歸的敏感性和特異性為95％，通過(guò)雙重ROC分析的敏感性為92％且特異性為98％。
不同調(diào)節(jié)N-多糖的結(jié)構(gòu)分析最后一段所示結(jié)果本身對(duì)區(qū)分硬化病人和慢性肝障礙不太發(fā)展的病人有價(jià)值。然而，為增加‘omics’方法所得信息對(duì)生物問(wèn)題的可靠性，通常嘗試使統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)加工結(jié)果與研究問(wèn)題的已知方面相關(guān)。對(duì)于糖組學(xué)，能評(píng)估這種相關(guān)性的一個(gè)先決條件是結(jié)構(gòu)分析不同‘表達(dá)’的多糖。通過(guò)使用外切糖苷酶陣列，我們能獲得關(guān)于不同調(diào)節(jié)多糖的足夠結(jié)構(gòu)信息。一些另外的要素使它可行首先，報(bào)導(dǎo)‘健康’人血清中存在的N-多糖以三維HPLC方式作圖(Nakagawa等，1995)。此研究構(gòu)成正常血清糖蛋白上存在的N-多糖的真實(shí)‘類(lèi)別’，因此對(duì)于我們的研究是可比較值的資源，如蛋白質(zhì)組學(xué)研究中充分注釋的蛋白質(zhì)組。第二，根據(jù)我們的診斷研究，樣品有廣泛定量的感興趣變化范圍。這對(duì)于‘追蹤’外切糖苷酶后陣列分布中感興趣的峰很有用。圖4顯示3個(gè)這些樣品的外切糖苷酶測(cè)序。健康血清分布中的5個(gè)主要峰結(jié)構(gòu)(圖4中以黑峰顯示結(jié)構(gòu)和其外切糖苷酶產(chǎn)物。有這些結(jié)構(gòu)的參考多糖和一些其外切糖苷酶產(chǎn)物的位置示于中間序列的底板。此板集合自單獨(dú)板，它們各含1個(gè)這些峰)。這些結(jié)構(gòu)的有效性顯著簡(jiǎn)化追蹤分布中剩余、不同調(diào)節(jié)峰的任務(wù)。
與圖1中峰1對(duì)應(yīng)的多糖結(jié)構(gòu)峰1在巖藻糖苷酶消化時(shí)轉(zhuǎn)移2個(gè)葡萄糖單位到a-半乳糖二觸角參考多糖的位置(中間測(cè)序列底部參考圖中的第1個(gè)峰)。此外，巖藻糖苷酶消化時(shí)，此位置的峰變得很強(qiáng)，因?yàn)榉?轉(zhuǎn)移到此位置(峰6二半乳糖核心-巖藻糖基化二觸角多糖的結(jié)構(gòu))。這些一起證明峰1是二觸角、無(wú)半乳糖(agalacto)、核心-α-1，6-巖藻糖基化多糖。因此，它在硬化樣品組中上調(diào)指示半乳糖基化不足與血清糖蛋白核心巖藻糖基化增加的組合。
與圖1中峰2對(duì)應(yīng)的多糖結(jié)構(gòu)鑒定此峰更困難，因?yàn)樗呢S度相對(duì)低。然而，能獲得足夠信息以明確鑒定其結(jié)構(gòu)在用唾液酸酶和β-1，4-半乳糖苷酶雙消化產(chǎn)生的分布中，峰7產(chǎn)物與唾液酸酶板中的峰2精確共遷移。隨后，由于左側(cè)測(cè)序列(肝炎樣品)中沒(méi)有觀察到峰2，我們可在另2個(gè)樣品的唾液酸酶+巖藻糖苷酶雙消化模式中鑒定其外切糖苷酶產(chǎn)物，其中峰2可檢測(cè)。巖藻糖苷酶消化時(shí)峰2位置不再存在峰，只有1個(gè)可能是消化產(chǎn)物的新峰(以灰色突顯，中間測(cè)序列的唾液酸酶+巖藻糖苷酶分布中第1個(gè)箭頭)。在三消化分布中(添加β-1，4-半乳糖苷酶)，此峰更強(qiáng)，因?yàn)榉?的消化產(chǎn)物與它共遷移。添加己糖胺酶消化在此位置不留下峰痕跡。這使我們得出結(jié)論，峰2代表對(duì)分、無(wú)半乳糖的核心-α-1，6-巖藻糖基化結(jié)構(gòu)。因此，此峰攜帶峰3和峰7的結(jié)構(gòu)改變組合，即它是非半乳糖基化且具有對(duì)分GlcNAc殘基。
與圖1中峰3對(duì)應(yīng)的多糖結(jié)構(gòu)這是總血清糖蛋白上最豐富的N-多糖。唾液酸酶消化后，通過(guò)與麥芽糖-寡糖參考梯(ladder)相比較，估計(jì)其大小為9個(gè)單糖單位。唾液酸酶/β-1，4-半乳糖苷酶消化后，此多糖失去2個(gè)半乳糖殘基且在β-N-乙酰己糖胺酶消化時(shí)再失去2個(gè)GlcNAc殘基。剩余多糖遷移到Man3GlcNAc2核心N-多糖結(jié)構(gòu)的位置。我們推斷多糖nr.3的結(jié)構(gòu)是二觸角、二-β-1，4-半乳糖基化。此結(jié)論通過(guò)它與有此結(jié)構(gòu)的參考多糖精確共遷移來(lái)確認(rèn)，未用和用β-1，4-半乳糖苷酶消化。峰3在硬化中下調(diào)，其半乳糖基化不足的產(chǎn)物(或前體)豐度增加且其它二觸角多糖存在增大，此基本二觸角底物是這些多糖的前體。
與圖1中峰7對(duì)應(yīng)的多糖結(jié)構(gòu)此峰也以相對(duì)低豐度存在于慢性肝炎病人的血清(圖4左側(cè)測(cè)序列的第2個(gè)板中第3個(gè)箭頭)和正常血清(未顯示)分布。其測(cè)序最容易在第3個(gè)測(cè)序列中跟蹤，代表我們收集中受影響最嚴(yán)重的血清之一。峰7是此分布中第3大最豐富多糖，此峰而不是其任何消化產(chǎn)物與上述參考多糖之一或其消化產(chǎn)物共遷移。由于到四重外切糖苷酶消化沒(méi)有發(fā)現(xiàn)共遷移，這最可能意味存在這些參考多糖中沒(méi)有的取代物。四重消化后，峰7消化產(chǎn)物比三甘露糖核心寡糖移動(dòng)慢1個(gè)葡萄糖單位，意味著此三甘露糖核心上存在取代物，大小為1個(gè)單糖。根據(jù)總血清糖蛋白N-多糖的作圖研究，它僅可能是所謂的對(duì)分GlcNAc。不預(yù)期此取代物抗這些條件中的伴刀豆β-N-乙酰己糖胺酶消化，因?yàn)橐阎獙?duì)分GlcNAc殘基特定抗酶取出(通過(guò)參考多糖上此殘基對(duì)本文所用相同外切糖苷酶的抗性來(lái)確認(rèn)，見(jiàn)圖4，第3個(gè)測(cè)序列下的參考圖)。巖藻糖苷酶消化誘導(dǎo)1.2個(gè)葡萄糖單位轉(zhuǎn)移，這指示核心-α-1，6-連接巖藻糖殘基的存在。添加β-1，4-半乳糖苷酶消化轉(zhuǎn)移另2個(gè)葡萄糖單位給峰，表明存在2個(gè)β-1，4-半乳糖殘基。因此，我們推斷峰7代表二觸角、二-β-1，4-半乳糖基化、核心-α-1，6-巖藻糖基化多糖結(jié)構(gòu)。通過(guò)所有峰7消化產(chǎn)物與有此結(jié)構(gòu)的參考多糖對(duì)應(yīng)消化產(chǎn)物共洗脫確認(rèn)此結(jié)果(右側(cè)測(cè)序列的底部板，板集合自不同泳道的電泳圖，它們各含1個(gè)特定外切糖苷酶陣列作用于有結(jié)構(gòu)7的參考多糖的消化產(chǎn)物)。此對(duì)分GlcNAc取代物是N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(Gn T III)活性作用于峰6所示結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，峰3的核心-α-1，6-巖藻糖基化變體。
與圖1中峰8對(duì)應(yīng)的多糖結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于峰8的多糖比多糖3長(zhǎng)約2個(gè)單糖單位，不能被牛腎巖藻糖苷酶消化并與三觸角的充分β-1，4-半乳糖基化參考多糖共遷移。此外，β-1，4-半乳糖苷酶取出3個(gè)半乳糖殘基(從多糖)，之后該多糖比多糖3剩余物長(zhǎng)1個(gè)單糖單位，當(dāng)和二觸角結(jié)構(gòu)比較時(shí)，與三觸角多糖預(yù)期的1個(gè)額外GlcNAc殘基一致。總之，峰8代表2，4-分支三觸角、三-β-1，4-半乳糖基化多糖結(jié)構(gòu)。
與圖1中峰9對(duì)應(yīng)的多糖結(jié)構(gòu)此多糖比峰8的三觸角未巖藻糖基化多糖長(zhǎng)1個(gè)單糖單位，對(duì)牛腎和杏仁粉巖藻糖苷酶都敏感，消化后該多糖轉(zhuǎn)變成峰8。因此，此多糖上存在的巖藻糖殘基是α-1，3/4連接。我們推斷峰9的多糖是多糖8的分支-巖藻糖基化衍生物。不能用外切糖苷酶消化確定分支巖藻糖殘基的確切位置。
與圖1中其它峰對(duì)應(yīng)的多糖峰4也在硬化組中上調(diào)，雖然不足以使四分位范圍不與對(duì)照組之一重疊。僅用外切糖苷酶難以明確闡明其完全結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗谕僖核崦?消化分布中的位置與1種核心-巖藻糖基化單半乳糖基化二觸角多糖重疊。此單半乳糖基化多糖產(chǎn)生正常血清唾液酸酶-消化分布中的大部分峰4強(qiáng)度。下列觀察提示此結(jié)構(gòu)不是硬化病人血清中存在量增加的結(jié)構(gòu)添加β-1，4-半乳糖苷酶消化時(shí)，峰出現(xiàn)的位置與上述巖藻糖苷酶消化峰2時(shí)相同。這表明峰2的半乳糖基化變體必須存在于患病的唾液酸酶處理分布中，它大1或2個(gè)半乳糖殘基。符合這些要求且這里未鑒定的唯一差異調(diào)節(jié)峰是峰4。峰4和其β-1，4-半乳糖苷酶產(chǎn)物間的距離與二觸角、二半乳糖基化多糖和其β-1，4-半乳糖苷酶產(chǎn)物間的距離相同，這是峰4上存在2個(gè)β-1，4-連接半乳糖殘基的有力證據(jù)。因此，我們暫時(shí)認(rèn)為硬化中峰4的峰強(qiáng)度增加至少部分來(lái)自對(duì)分、二半乳糖基化多糖(無(wú)巖藻糖基化)。
明確鑒定其它峰需要質(zhì)譜，其中許多最可能是上述結(jié)構(gòu)的單半乳糖基化變體。
分析核心-α-1，6-巖藻糖基化報(bào)導(dǎo)肝細(xì)胞癌中的α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)增加(Noda等，1998)。由于前面段落中鑒定的一些上調(diào)峰(1、2和7)和非差異調(diào)節(jié)峰6在N-多糖核心近側(cè)GlcNAc上攜帶α-1，6-連接巖藻糖殘基，研究這4個(gè)峰高組成的變量特征很有趣。因此，加入這4個(gè)峰的峰高并對(duì)上述用于其它變量的相同組進(jìn)行單向ANOVA，接著以0.0001的familywise誤差率進(jìn)行相同多比較檢驗(yàn)。結(jié)果示于圖5。硬化組平均值與所有其它組的平均值顯著不同。當(dāng)硬化組在有和沒(méi)有HCC的病例中分開(kāi)時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到核心巖藻糖基化程度的顯著差異(t-檢驗(yàn)，P＞0.1)。
發(fā)展臨床有用的高通量去糖基化和僅用PCR熱循環(huán)儀的標(biāo)記操作可用的去糖基化和標(biāo)記操作仍相對(duì)是勞動(dòng)力密集，從血清到用于分析的脫唾液酸標(biāo)記多糖，它們需要2天半，因而能在3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作日進(jìn)行完整分析。在基礎(chǔ)研究環(huán)境中，操作大體上令人滿意，但在臨床研究實(shí)驗(yàn)室中更麻煩，因?yàn)橐恍┭b置一般不使用(平板和真空離心)。更重要的是操作包括一些管到管轉(zhuǎn)移和手工過(guò)程，隨著樣品跟蹤變得相對(duì)復(fù)雜，這些過(guò)程難以確認(rèn)。同樣，參與的勞動(dòng)力和從樣品到結(jié)果相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間不利于臨床實(shí)驗(yàn)室中的簡(jiǎn)單實(shí)行。因此，我們決定從真實(shí)應(yīng)用角度放射性再思考樣品制備過(guò)程。由于血清糖蛋白濃度很高(幾乎所有蛋白被糖基化，除了白蛋白，這意味著每升約35g糖蛋白)，5μl樣品包含約175μg糖蛋白。用50kDa血清糖蛋白的估計(jì)平均分子量和每分子3個(gè)N-糖基化位置占據(jù)進(jìn)一步計(jì)算，大致估計(jì)在此5μl血清樣品中獲得10nmol N-多糖。已知15fmol的峰易在DSA-FACE上檢測(cè)且有相對(duì)完整的分布，應(yīng)能檢測(cè)代表約0.5％總多糖庫(kù)的峰，操作的分析階段需要約5pmol標(biāo)記多糖。這意味著我們已有的N-多糖量和我們實(shí)際需要用于分析的量間有3000倍的寬富余。可犧牲此寬富余以使樣品制備操作中的一些步驟效率更低但更易應(yīng)用。尋求可負(fù)擔(dān)和熟悉的設(shè)備，設(shè)計(jì)設(shè)備用于處理小體積液體樣品而蒸發(fā)最小，我們發(fā)現(xiàn)用于PCR的有熱蓋的熱循環(huán)儀適合。然后，通過(guò)仔細(xì)考慮隨后使用的緩沖液系統(tǒng)，發(fā)展的過(guò)程僅包括液體加入/去除和稀釋?zhuān)瑥难宓酱治龅臉?biāo)記N-多糖。以PCR機(jī)器為基礎(chǔ)的血清蛋白N-多糖標(biāo)記操作是1)加入5微升血清到PCR管(或96孔PCR板的管)和加入1微升含10％SDS的20mM NH4Ac緩沖液，pH＝7。混合并關(guān)上管。置于有熱蓋的熱循環(huán)儀且96度加熱5分鐘。使熱循環(huán)儀冷卻下來(lái)(此步驟使糖蛋白變性以增加對(duì)PNGase F的接近性)。
2)加入1微升10％NP-40溶液以中和對(duì)PNGase F的SDS-變性效果(用于PNGaseF消化的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程)。加入2微升PNGase F溶液(1000個(gè)Biolabs單位)。關(guān)上管并在熱循環(huán)儀中37度加熱3小時(shí)。
3)轉(zhuǎn)移1微升溶液到另一個(gè)PCR管(或96孔PCR板)，在脫唾液酸化(步驟4)剩余部分中保持此樣品。如果需要，此樣品產(chǎn)生唾液酸化多糖的分布。
4)加入8微升50mM NaAc緩沖液pH＝5并混合。(計(jì)算此緩沖液量以考慮重碳酸鹽基礎(chǔ)上的血清緩沖能力且足以補(bǔ)償此緩沖能力的2倍變化，這比臨床觀察到的大許多)。加入2μU(2微升)產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶。關(guān)上管并在熱循環(huán)儀中37℃加熱3小時(shí)。
5)取1微升且轉(zhuǎn)移到新PCR管(或板)。另外(但由于蒸發(fā)作用最小而精確性更低)，從管中取出19微升并處理剩余的1μl。同樣從步驟3(唾液酸化多糖)中取出管且2個(gè)樣品進(jìn)一步的處理類(lèi)似。
6)在熱循環(huán)儀上，打開(kāi)管且循環(huán)儀的蓋開(kāi)并加熱到65度。這蒸發(fā)樣品，由于體積很小(1μl)，蒸發(fā)在不到5分鐘內(nèi)完成。
7)制備標(biāo)記溶液，溶液含0.6M檸檬酸中的10mM APTS和50％DMSO中的0.5M氰硼氫化鈉。加入1、5微升此標(biāo)記溶液到目前干的PCR管底部。很好的關(guān)上管且熱蓋開(kāi)，90度加熱1小時(shí)(這是脫唾液酸多糖的快速動(dòng)力學(xué)標(biāo)記化學(xué)。對(duì)于唾液酸化多糖，標(biāo)記溶液相同但溫度應(yīng)保持在37度且反應(yīng)應(yīng)過(guò)夜完成以防止脫唾液酸)。
8)加入150微升水到各管以終止反應(yīng)，稀釋標(biāo)記到約100pmol/μl。所得溶液能直接用于在DNA測(cè)序儀上上樣(加入甲酰胺和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)后)。在早期實(shí)驗(yàn)中，我們確定100pmol游離標(biāo)記代表能在測(cè)序凝膠泳道上上樣而不使凝膠分離能力廣泛超負(fù)荷的最大容許量。
如上所述分析健康供體的4個(gè)血清樣品。信號(hào)強(qiáng)度和數(shù)據(jù)性質(zhì)令人很滿意，證明血清N-多糖樣品制備可僅用相對(duì)便宜的熱循環(huán)儀完成，管轉(zhuǎn)移很少。(半)自動(dòng)化潛能對(duì)讀者顯然，與大規(guī)模PCR設(shè)置類(lèi)似。實(shí)行此操作能完成硬化的血清分析，周轉(zhuǎn)時(shí)間為24小時(shí)(或更短，如果可使用以毛細(xì)管陣列為基礎(chǔ)的更快分析器)。我們確信此樣品制備過(guò)程的改進(jìn)使肝硬化診斷測(cè)試更接近于常規(guī)臨床化學(xué)中的實(shí)際使用。
確認(rèn)單獨(dú)病人組中的肝硬化診斷為確認(rèn)上面研究所得用于硬化檢測(cè)的截?cái)嘀担眠@些截?cái)嘀捣诸?lèi)有(n＝10)或沒(méi)有(n＝13)硬化的單獨(dú)慢性肝炎病人組。如圖3，部分8可見(jiàn)，所有3個(gè)參數(shù)組合獲得91％的分類(lèi)效率。因此，盡管此第2個(gè)受試者組的大小相當(dāng)小，我們推斷獲自我們最優(yōu)組的分類(lèi)模型沒(méi)有過(guò)分合適且觀察到＞90％的分類(lèi)效率。
比較用于肝硬化檢測(cè)的經(jīng)典臨床化學(xué)參數(shù)和糖分布在本發(fā)明中，所得參數(shù)區(qū)分HCC和/或硬化與非硬化慢性乙肝和丙肝的效率用接受操作曲線(ROC)分析評(píng)估。ROC分析結(jié)果表明分類(lèi)效率約為95％。ROC分析僅有涉及肝障礙經(jīng)典臨床化學(xué)參數(shù)的相同樣品組(圖3，部分7)產(chǎn)生的值為對(duì)于總膽紅素為76±6％，對(duì)于血清白蛋白為80±5％，其中AST、ALT、GGT和CRP產(chǎn)生非顯著AUC值P＞0.05。另外，對(duì)于我們硬化研究組中14個(gè)‘補(bǔ)償’硬化病例亞組(硬化病例有正常膽紅素和白蛋白水平)，總膽紅素和血清白蛋白濃度在參考范圍內(nèi)(總膽紅素＜1.3mg/dL且血清白蛋白＞3.5g/dL)，我們?cè)u(píng)估這些中有多少位于3個(gè)標(biāo)記的陽(yáng)性區(qū)域中，標(biāo)記獲自總血清蛋白的多糖分布(確定階段是通過(guò)ROC分析標(biāo)記區(qū)分無(wú)硬化的慢性肝炎和總硬化組(都對(duì)于白蛋白和膽紅素補(bǔ)償和去補(bǔ)償)。對(duì)于log(峰1/峰8)，這為12/14(85.7％)；log(峰2/峰8)11/14(78.5％)；log(峰7/峰8)11/14(78.5％)。因此，這些標(biāo)記平均能檢測(cè)約80％血清白蛋白和血清總膽紅素測(cè)量都遺漏的硬化病例。這明顯證明本發(fā)明的糖標(biāo)記比這些標(biāo)準(zhǔn)臨床化學(xué)標(biāo)記的性能更多，后者用于常規(guī)評(píng)估慢性肝病人。因而，我們的糖分布標(biāo)記檢測(cè)疾病較早階段中的肝硬化。
診斷肝硬化病人中的肝細(xì)胞癌(HCC)迄今為止，所有有HCC的病例與硬化組放在一起，因?yàn)樗麄冎谐艘粋€(gè)人以外都有潛在的硬化。然而，本領(lǐng)域已知目前在硬化背景上診斷HCC困難且有顯著的改進(jìn)空間。因此，在上述HCC和/或硬化組中，我們篩選能確定HCC病例的血清N-糖組模式改變。ROC分析HCC和/或硬化組中所有14個(gè)檢測(cè)峰(見(jiàn)圖1)表明峰5、7和14的豐度有顯著區(qū)分力(ROC；P＜0.05)。我們發(fā)現(xiàn)峰7和峰14的二參數(shù)分析有最佳分類(lèi)效率(圖6)。這用二參數(shù)二元邏輯回歸模型評(píng)估，其回歸線示于圖6(在此線上的病例處于2個(gè)不同類(lèi)別的概率相等)。此模型的邏輯函數(shù)是Z＝-0.649[％峰7]+5.722[％峰14]+2.967。以此模型為基礎(chǔ)的分類(lèi)檢測(cè)HCC的敏感性為71％且特異性為91％(總分類(lèi)效率82％)。由于豐度低，不能指定峰14的結(jié)構(gòu)。正在進(jìn)行更多的質(zhì)譜特征確定。我們推測(cè)此多糖是N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶V的產(chǎn)物，因?yàn)樗艿奈恢门c四觸角多糖一致且GnT-V活性增加是許多腫瘤的特征。
材料和方法研究設(shè)計(jì)臨床研究以方便樣品為基礎(chǔ)并由University Hospital Ghent的本地道德委員會(huì)批準(zhǔn)。包括73個(gè)病人的樣品(在University Hospital Ghent腸胃病系的1年階段(12/2000-12/2001)中呈現(xiàn)出慢性肝障礙癥狀)。在可檢測(cè)hepBsAg和HBV DNA或可檢測(cè)抗HCV抗體和HCV RNA存在時(shí)，通過(guò)至少2個(gè)血液樣品在6個(gè)月時(shí)間段中的ALT水平提高(高于正常上限)來(lái)診斷慢性乙肝(n＝8)和丙肝(n＝39)。在無(wú)肝活組織切片禁忌征候(凝血紊亂、存在腹水、...)的病人中，這通過(guò)經(jīng)皮膚的肝活組織切片確認(rèn)。在臨床(存在腹水、血管曲張、腦病)和生化背景(白蛋白和膽紅素水平，INR)上對(duì)硬化補(bǔ)償不全的病人進(jìn)行硬化診斷(n＝37)。在其他病人中(當(dāng)肝活組織切片的禁忌征候缺乏時(shí))，通過(guò)經(jīng)皮膚的肝活組織切片診斷。硬化的基本病因是慢性酗酒(n＝15)和慢性肝炎(n＝20)。在一個(gè)病例中，硬化病因是自身免疫性肝炎或未知(隱發(fā)性硬化)。在硬化病人中，通過(guò)超聲波、CT或MRI中存在甲胎蛋白上升或存在病灶肝損傷來(lái)診斷肝細(xì)胞癌(HCC，n＝16)，使用HCC特征；在一些病人中，兩者都存在。在沒(méi)有硬化時(shí)和對(duì)診斷有懷疑的病人中，進(jìn)行病灶損傷的真正切割針活組織切片。進(jìn)行診斷的臨床中心是佛蘭德斯的HCC研究中心，該區(qū)HCC發(fā)病率低，有約600萬(wàn)居民，主要是白種人，但也有重要的意大利、土耳其和Morrocan社區(qū)(約為15％的人口)。同樣，樣品包括的58個(gè)病人懷疑慢性酗酒且由于此原因進(jìn)入安特衛(wèi)普(佛蘭德斯區(qū)的主要城市)的Academic HospitalStuivenberg精神病學(xué)系。通過(guò)碳水化合物缺陷轉(zhuǎn)鐵蛋白測(cè)量(％CDT-TIATM，AxisBiochemicals，Oslo，Norway)評(píng)估最近的重酒精消費(fèi)，樣品組分成2個(gè)亞群，1個(gè)對(duì)CDT測(cè)試陽(yáng)性(大于6％CDT，n＝25)且另一個(gè)陰性(n＝33)。
24個(gè)樣品包括患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(n＝8)、強(qiáng)直性脊柱炎(n＝8)或克羅恩氏病(n＝8)的病人，這些疾病在University Hospital Ghent的風(fēng)濕病學(xué)系診斷。
為確立所測(cè)多糖的參考值，研究60個(gè)血液供體的對(duì)照組(其中26個(gè)女性，女性平均年齡60y，男性；59y)，其中健康狀況符合紅十字會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。這些樣品獲自比利時(shí)根特的紅十字會(huì)輸血中心。
表1概括了病因、年齡和性別數(shù)據(jù)。
血清診斷糖組樣品制備過(guò)程5μl血清(總共215)用50μl RCM緩沖液(8M尿素、360mM Tris，pH 8.6、3.2mM EDTA)50℃孵育1小時(shí)以使血清蛋白變性。隨后，這些混合物上樣于Multiscreen-IP板(Millipore，Bedford，CA，USA)的孔，如上所述制備(Papac等，1998)。根據(jù)報(bào)導(dǎo)的過(guò)程(同上)進(jìn)行還原、碘烷化和去糖基化步驟。
APTS衍生反應(yīng)和清除最近描述了用8-氨基-1，3，6-芘三磺酸衍生N-多糖和去除過(guò)量游離標(biāo)記(Callewaert等，2001)。簡(jiǎn)要地，去糖基化混合物蒸發(fā)到干燥，加入1μl 1∶1混合物，混合物含1.2M檸檬酸中的20mM APTS(Molecular Probes，Eugene，CA，USA)和DMSO中的1M NaCNBH3。衍生可在37℃進(jìn)行18小時(shí)。此后，通過(guò)加入10μl DI水淬滅反應(yīng)。用Multiscreen過(guò)濾板(Millipore，Bedford，CA，USA)中填充的交聯(lián)葡聚糖G10床去除過(guò)量未反應(yīng)APTS。應(yīng)用樣品后，樹(shù)脂床洗脫3次，這是通過(guò)加入10μl水和在臺(tái)式離心機(jī)中以750xg離心10秒，離心機(jī)裝備用于處理96孔板(Eppendorf，Hamburg，Germany)。洗脫物蒸發(fā)到干燥。蒸發(fā)后，衍生多糖在5μl水中復(fù)水。
外切糖苷酶消化1μl凈化衍生N-多糖批轉(zhuǎn)至250μl PCR管或錐形微量滴定板，用于節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶(2U/ml，Glyko，Novato，CA)處理，在10μl 20mM乙酸鈉pH5.0中37℃過(guò)夜。1單位唾液酸酶是在25℃和pH5.0時(shí)每分鐘水解1μmole N-乙酰神經(jīng)氨-D-乳糖的酶量。完成消化后，樣品蒸發(fā)到干燥并在1μl水中復(fù)水。
通過(guò)適應(yīng)DNA測(cè)序儀的FACE分析對(duì)于各樣品，加入0.5μl若丹明標(biāo)記的GenescanTM500標(biāo)準(zhǔn)混合物(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA，USA)和1μl去離子甲酰胺，各用于內(nèi)參和促進(jìn)樣品上樣。
所有實(shí)驗(yàn)在Applied Biosystems 377A DNA測(cè)序儀(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA，USA)上進(jìn)行，如上所述適于冷卻(Callewaert等，2001)。36cm凝膠包含10％的19∶1丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺(89mM Tris、89mM硼酸鹽、2.2mM EDTA)混合物。以3000V預(yù)跑1小時(shí)。分離中的電泳電壓為3500V且數(shù)據(jù)收集3小時(shí)(分離多糖直到15個(gè)葡萄糖單位大小)。
數(shù)據(jù)加工用Genescan 3.1軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。我們選擇使用14個(gè)很好確定的峰高以獲得分布的數(shù)字描述。這是所觀察峰的總數(shù)亞集，因?yàn)閮H包括在所有樣品中可定量的峰。我們選擇峰高而不是峰表面，因?yàn)橛袝r(shí)峰廣泛重疊，導(dǎo)致后者更難以常規(guī)方法定量。這些數(shù)據(jù)在MS Excell中集合并用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)包(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)進(jìn)一步加工。假定變量對(duì)研究群體的常態(tài)，用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)以0.05顯著水平評(píng)估。變量的單向參數(shù)分析后是Tukey真實(shí)顯著差異和Scheffé多比較檢驗(yàn)，顯著水平為0.0001。接受操作曲線(ROC)分析和二元邏輯回歸用于評(píng)估可能診斷變量的分類(lèi)效率。
為描繪制備，相同凝膠上的所有泳道與含APTS-標(biāo)記麥芽糖-寡糖標(biāo)準(zhǔn)的泳道一起排列，使用內(nèi)部若丹明-寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)的峰位置。為了闡明，排列過(guò)程后省略對(duì)應(yīng)于若丹明-標(biāo)記內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的峰。
外切糖苷酶陣列測(cè)序N-多糖1μl APTS-標(biāo)記N-多糖用高度純化外切糖苷酶的不同混合物消化，此多糖如段落8.2.2所述制備?；旌衔锾匦允居趫D且是下列各項(xiàng)的組合產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶(2U/ml，Glyko，Novato，CA)；肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)β-1，4-半乳糖苷酶(1U/ml，Boehringer，Mannheim，Germany)；伴刀豆β-N-乙酰己糖胺酶(30U/ml，Glyko，Novato，CA，USA)和牛附睪α-巖藻糖苷酶(0.5U/ml，Glyko，Novato，CA，USA)。單位定義由酶供應(yīng)商詳細(xì)說(shuō)明。完成消化后，樣品蒸發(fā)到干燥，在1μl去離子水中復(fù)水并在上述ABI377上分析。
表
表2
表3單向分析7個(gè)樣品組的差異
多比較檢驗(yàn)結(jié)果
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權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法，其特征在于，所述方法包括a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和b)在步驟a)的分布中測(cè)量至少1種碳水化合物或其衍生片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或所述碳水化合物分布中存在的至少1種碳水化合物或其衍生片段的特征的量，和c)比較步驟b)獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)和從無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物分布獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)，以及d)將步驟c)所得偏差歸于肝硬化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少1種碳水化合物選自i)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(多糖1)，ii)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(多糖2)，iii)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc(多糖3)，iv)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，3)[GlcNAc(β-1，4)][Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)[Fuc(α-1，6)]GlcNAc(多糖7)，v)Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)]Man(α-1，3)[Gal(β-1，4)GlcNAc(β-1，2)Man(α-1，6)]Man(β-1，4)GlcNAc(β-1，4)GlcNAc(多糖8)，vi)衍生自多糖1、2、3、7或8的片段，vii)多糖1、2、3、7或8的唾液酸衍生物，viii)多糖1、2、3、7或8或其衍生物或片段的特征。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述量以多糖1與多糖8和/或多糖2與多糖8和/或多糖7與多糖8和/或多糖1與多糖3和/或多糖2與多糖3和/或多糖7與多糖3間的相對(duì)量測(cè)量。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述多糖1與多糖8間的相對(duì)量比無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物中所述相對(duì)量平均值高至少80％。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述多糖2與多糖8間的相對(duì)量比無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物中所述相對(duì)量平均值高至少100％。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述多糖7與多糖8間的相對(duì)量比無(wú)肝硬化的哺乳動(dòng)物中所述相對(duì)量平均值高至少40％。
7.如權(quán)利要求1-6所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
8.如權(quán)利要求1-7所述的方法，其特征在于，所述體液是血清或血漿。
9.一種檢測(cè)肝硬化的診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括執(zhí)行權(quán)利要求1-8所述方法的工具。
10.如權(quán)利要求1-9所述檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法，所述方法還包括哺乳動(dòng)物身體狀況的其它定量和定性評(píng)估，如臨床化學(xué)參數(shù)和組織學(xué)數(shù)據(jù)。
11.一種檢測(cè)肝硬化哺乳動(dòng)物中肝細(xì)胞癌存在或傾向的方法，其特征在于，所述方法包括a)生成關(guān)于碳水化合物或其片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或由所述碳水化合物或所述碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述碳水化合物或所述碳水化合物片段特征的分布；所述碳水化合物或所述片段存在于或獲自糖綴合物混合物，所述糖綴合物存在于或分離自所述哺乳動(dòng)物體液樣品，和b)在步驟a)的分布中測(cè)量至少1種碳水化合物或其衍生片段、或所述碳水化合物或所述片段的標(biāo)記衍生物、或所述碳水化合物分布中存在的至少1種碳水化合物或其衍生片段的特征的量，和c)比較步驟b)獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)和從肝硬化但無(wú)肝細(xì)胞癌的哺乳動(dòng)物分布獲得的測(cè)量數(shù)據(jù)，以及d)將步驟c)所得偏差歸于肝細(xì)胞癌的存在。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，步驟b)中的二參數(shù)分析用衍生自人血清碳水化合物分布的多糖7和14進(jìn)行。
13.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述二參數(shù)分析是二參數(shù)二元邏輯回歸分析。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測(cè)哺乳動(dòng)物肝硬化的方法和試劑盒。所述診斷測(cè)試以體液如血清中診斷碳水化合物的分布和鑒定為基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/00GK1662817SQ03813954
公開(kāi)日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2003年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月16日
發(fā)明者N·L·M·卡勒瓦特, R·H·康特里拉斯 申請(qǐng)人:福拉姆斯大學(xué)生物技術(shù)研究所, 根特大學(xué)