專利名稱：試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明試劑盒涉及生物技術(shù)，尤其是一種酶標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)，將鏈親和素、生物素捕獲技術(shù)應(yīng)用于酶聯(lián)免疫技術(shù)中，建立板式鏈親和素雙位點(diǎn)夾心一步法定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Streptavidin-ELISA)，用于檢測(cè)患者血清cTnI水平。
在所有橫紋肌中肌鈣蛋白復(fù)合體的功能相近，但是心肌TnT、TnI(cTnT，cTnI)與骨胳肌的TnT、TnI在結(jié)構(gòu)上有很大的不同，分別由不同的基因編碼。編碼心肌TnT的基因只在胚胎期在骨胳肌中有短暫表達(dá)，因此可用免疫學(xué)方法將心肌和骨胳肌的TnT、TnI區(qū)別開來。心肌TnC與骨胳肌TnC相同，因此檢測(cè)方法應(yīng)用價(jià)值不大。
心肌TnT檢測(cè)方法由Katus等人于1989年報(bào)道[Katus HA，RemppisA，Looser S et alJ mol cell cardiol 1989；211349]。該方法是基于親和純的多抗和一種單抗建立起來。1992年羅氏(當(dāng)時(shí)為寶靈曼)診斷產(chǎn)品公司推出了第一代心肌TnT EIA檢測(cè)試劑盒。固相采用鏈親和素(Streptavidin，SA)-牛血清白蛋白復(fù)合物包被的聚苯乙烯管，第一單抗用生物素標(biāo)記，通過SA間接固定到固相上，第二單抗用辣根過氧化物酶標(biāo)記。檢測(cè)范圍0.1-15μg/L。與骨胳肌的交叉反應(yīng)性約2％，在不存在肌肉損傷的情況下，該水平的交叉反應(yīng)性對(duì)診斷特異性影響不大。但是對(duì)有肌肉損傷或肌病患者，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)受到影響。因此為了提高檢測(cè)方法的特異性，1997年推出了第二代TnTEIA檢測(cè)試劑盒，骨胳肌TnT濃度達(dá)到1000μg/L時(shí)，用第二代方法也不會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。1999年第三代以釕作標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光TnTElecsysl010&2010也已推向市場(chǎng)。
1987年Cummins等人首先報(bào)道檢測(cè)cTnI的RIA法[Cummins B，Auckland MC，Cummins P et alAm Heart J.1987；1131333]。目前，心肌TnI的定量和定性檢測(cè)方法已有多種，包括競(jìng)爭(zhēng)放免測(cè)定法、酶免疫測(cè)定法、金免疫層析法等。由于各種方法的靈敏度不一樣，TnI的正常參考值變動(dòng)較大10μg/L、3.8μg/L、0.35μg/L、0.1μg/L均有報(bào)道。研究資料表明，cTnT與cTnI水平的符合率可達(dá)90％，cTnT+/cTnI-為8.9％，cTnT-/cTnI+1.1％[Robert H，Christenson，Snow-Hong D et alClinical Chemistry 1998，44(3)494]。近年的研究認(rèn)為，對(duì)于某些腎功能不全的病人及肌病患者，TnI的特異性高一些。
目前，cTnT和cTnI作為診斷心肌損傷的確定標(biāo)志物，因其診斷靈敏性高、特異性強(qiáng)，有逐漸替代“金標(biāo)準(zhǔn)”CK-MB的趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)均使用相應(yīng)的進(jìn)口試劑盒，價(jià)格昂貴，難在臨床廣泛使用。
正常情況下，心肌肌鈣蛋白I在血中的含量很低(＜0.1μg/L)，一般酶免疫測(cè)定方法的敏感度達(dá)不到此要求。為了提高檢測(cè)系統(tǒng)的敏感度，本發(fā)明提出一種新的技術(shù)方案。
本發(fā)明目的可通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的為了提高檢測(cè)系統(tǒng)的敏感度，本發(fā)明是通過鏈親和素一生物素捕獲系統(tǒng)將抗體、抗原或免疫復(fù)合物間接地固定于固相之上。以鏈親和素固相捕獲技術(shù)及酶免疫技術(shù)為基礎(chǔ)，建立板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法ELISA定量檢測(cè)血清cTnI，可供心臟梗死確診使用，對(duì)于懷疑有AMI的胸痛病人，可以通過連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)cTnI方法判斷其預(yù)后。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，采用鏈親和素固相，生物素標(biāo)記一種抗cTnI單克隆抗體，辣根過氧化酶標(biāo)記另一種單克隆抗體，建立板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法。
在本發(fā)明中，與普通親和素相比，鏈親和素是一種偏酸性的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為5-6，且不含碳水化合物。因此用鏈親和素包被酶標(biāo)板可使陰性本底明顯降低。應(yīng)用該技術(shù)制備的酶標(biāo)板具有穩(wěn)定性能好、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)。有些物質(zhì)，如半抗原、多肽、核酸等，很難直接包被到聚苯乙烯板上，但很容易制備成生物素化的結(jié)合物而對(duì)SA酶標(biāo)板作間接包被。但SA直接包被需包被量較大。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)抗體進(jìn)行酸處理或熱變性后[Conradie JD，Govender M，Visser L，et alJ.Immunol Method 1983；59289]，可改善抗體的包被效果，檢測(cè)靈敏度可提高2-6倍。其機(jī)理可能是①改善了抗體的方向性，即更多的Fc段與固相結(jié)合；②暴露了更多的疏水性基團(tuán)；③變性引起的聚合作用增加了聚合單體的質(zhì)量。本發(fā)明采用酸處理SA后，發(fā)現(xiàn)包被量可比末處理SA降低二倍以上，陰性本底更低，從而可使檢測(cè)系統(tǒng)的敏感度得到明顯改善，應(yīng)用于cTnI的檢測(cè)，能夠基本上符合缺血性心肌損傷的診斷要求。
生物素化單克隆抗體的制備以及辣根過氧化酶標(biāo)記的單克隆抗體的制備采用常用的方法。標(biāo)記結(jié)合物分別加等體積的甘油，-4℃可保存2年以上。
本發(fā)明優(yōu)越性在于板式鏈親和素-ELISA定量檢測(cè)血清cTnI的方法具有簡(jiǎn)便、快速、低陰性本底和低成本。方法學(xué)考核表明本發(fā)明方法的最低檢測(cè)限可達(dá)0.3ng/ml，批內(nèi)差異3.5％-5.0％，批間差異7.6％-9.3％。與進(jìn)口試劑對(duì)比試驗(yàn)證實(shí)，用本發(fā)明方法測(cè)得的cTnI水平與ELC cTnT(Elecsys 2010，Roche)測(cè)得的cTnT水平的符合率為88.2％，ECL cTnT陽性/本法cTnI陰性為9.8％，ECL cTnT陰性/本法cTnI陽性為2.0％；與化學(xué)發(fā)光法測(cè)得的cTnI(ACS180，Bayer)的陽性符合率為83.3％，陰性符合率為100％。說明本方法對(duì)檢測(cè)血清cTnI有商用開發(fā)價(jià)值。
通過下述附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明范圍。
圖2是板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法ELISA定量檢測(cè)血清cTnI的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3是用本方法測(cè)定的cTnI水平與采用進(jìn)口電化學(xué)發(fā)光cTnT試劑測(cè)定的cTnT水平的符合率。
圖4是本方法與進(jìn)口化學(xué)發(fā)光cTnI試劑的對(duì)比測(cè)定結(jié)果。
鏈親和素固相的制備取50μl鏈親和素(1mg/ml)加入200μl蒸餾水稀釋，再加50μl 3mol/l醋酸，室溫放置5min，用2mol/l Tris調(diào)至pH 6.0，然后，用包被緩沖液(0.05mol/l，pH 9.5碳酸緩沖液)稀釋成2μg/ml，加入聚苯乙烯ELISA微孔板，120μl/孔4℃過夜，用洗滌液洗滌3次，加入封閉液(0.5％BSA，0.02mol/l，pH 7.2 PBS)37℃1小時(shí)，棄去封閉液，吹干備用。
生物素化抗體的制備單克隆抗體腹水提純采用辛酸法，生物素標(biāo)記單克隆抗體方法參考文獻(xiàn) [Ternynck T，Avramer SMethods inEnzymology 1990；184469]，lmg/ml抗體溶液中以1∶100摩爾數(shù)之比加入NHS-LC-biotin，混勻后室溫放置2小時(shí)，裝入透析袋對(duì)PBS，0.02mol/l，pH 7.2透析48小時(shí)，加等體積甘油，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 酶標(biāo)記抗體的制備辣根過氧化物酶(HRP)5mg溶于0.5ml雙蒸水中，加0.06mol/l過碘酸鈉0.5ml 4℃反應(yīng)30分鐘，然后，再加0.16mol/l乙二醇室溫反應(yīng)30分鐘后，與1ml濃度為2mg/ml的抗體溶液混合，對(duì)0.05mol/l，pH 9.5的碳酸緩沖液4℃透析過夜。透析物與0.2ml，0.5％的四氫硼酸鈉4℃反應(yīng)2小時(shí)，加等量飽和硫酸銨4℃攪拌30分鐘，1000g離心15分鐘。沉淀溶于pH 7.4，0.02mol/lPBS中，對(duì)同樣緩沖液透析過夜，加穩(wěn)定劑-30℃保存。
實(shí)施例二雙位點(diǎn)夾心一步法ELISA定量檢測(cè)血清cTnI方法如

圖1是本發(fā)明創(chuàng)建的板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法ELISA定量檢測(cè)血清cTnI的操作流程圖所示，鏈親和素預(yù)包被微孔板每孔加入20μl抗原標(biāo)準(zhǔn)品或持測(cè)血清樣品，然后加100μl生物素化抗TnI單抗(約2μg/ml)及辣根過氧化物酶標(biāo)記另一抗TnI單抗的混和液(pH7.2，0.02mol/l磷酸緩沖液)，37℃反應(yīng)90分鐘，洗滌。加鄰苯二胺(0PD)底物液，37℃，15分鐘，加2mol/l硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上測(cè)490nm處的吸光值(A)，以A490nm為縱坐標(biāo)，各TnI濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
方法學(xué)考核標(biāo)準(zhǔn)曲線用純化的牛心肌TnI抗原，經(jīng)Bayer公司的TnI試劑盒(TnI)定量后，用正常人血清(TnI含量＜0.01ng/ml)稀釋成TnI含量為0.3，1.0，3.0，8.0，15，30ng/ml各參照標(biāo)準(zhǔn)品，用本發(fā)明建立的方法進(jìn)行定量，以A490nm為縱座標(biāo)，各TnI參照標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法ELISA定量檢測(cè)血清cTnI的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線所示。
最低檢測(cè)量用TnI為0的標(biāo)準(zhǔn)品，作12復(fù)管測(cè)定，計(jì)算平均吸光值為0.196(SD 0.027)。以平均值+2SD計(jì)算，0.3ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品的0D值高于此計(jì)算值，所以最低檢測(cè)限是0.3ng/ml。
精密度取TnI含量高(15ng/ml)、低(約3ng/ml)的2份血清標(biāo)本分別做批內(nèi)(8復(fù)管)和批間(連續(xù)8天)檢測(cè)，結(jié)果批內(nèi)CV3.5％，5.0％，批間CV為7.6％，9.3％。
對(duì)比試驗(yàn)見圖3用本發(fā)明方法測(cè)定的cTnI水平與采用進(jìn)口電化學(xué)發(fā)光cTnT試劑測(cè)定的cTnT水平的符合率，圖中，1-n＝45，88.2％；2-n＝5，9.8％+cTnT/-cTnT；3-n＝1，2.0％，-cTnT/+cTnT圖4本發(fā)明與進(jìn)口化學(xué)發(fā)光cTnI試劑的對(duì)比測(cè)定結(jié)果所示，51例病人的血清經(jīng)電化學(xué)發(fā)光cTnT試劑(ECL cTnT；Elecsys 2010，Roche)測(cè)定，陽性cut-off值定＞0.1ng/ml時(shí)，陽性例數(shù)15例，陰性例數(shù)36例。用本發(fā)明建立的方法對(duì)比測(cè)定，cTnI水平與cTnT水平同時(shí)升高例數(shù)10例，符合率為66.7％，cTnI和cTnT水平均正常的例數(shù)35例，符合率97.2％，總符合率88.2％，ECL cTnT陽性/本法cTnI陰性例數(shù)5例，占9.8％，ECL cTnT陰性/本法cTnI的陽性數(shù)有l(wèi)例，占2.0％。與進(jìn)口化學(xué)發(fā)光cTnI試劑(ACS180，Bayer)的陽性符合率為83.3％，陰性符合率為100％。
權(quán)利要求
1，一種試劑盒，在ELISA試劑盒基礎(chǔ)上，其特征是通過鏈親和素—生物素捕獲系統(tǒng)將抗體、抗原或免疫復(fù)合物間接地固定于固相上，建立板式鏈親和素雙位點(diǎn)夾心一步法。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法是用鏈親和素預(yù)包被酶標(biāo)板，生物素標(biāo)記抗cTnI單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記另一株抗cTnI單克隆抗體。
3，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的試劑盒的用途，其特征是用板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法定量檢測(cè)血清cTnI。
4，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的試劑盒制備方法，其特征是板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法的制備方法，第一，鏈親和素固相的制備取50μl、1mg/ml鏈親和素加入200μl蒸餾水稀釋，再加50μl 3mol/l醋酸，室溫放置5min，用2mol/l Tris調(diào)至pH 6.0，然后用包被緩沖液(0.05mol/l，pH 9.5碳酸緩沖液)稀釋成2μg/ml，加入聚苯乙烯ELISA微孔板，120μl/孔4℃過夜，洗滌液洗3次，加入0.5％BSA、0.02mol/l、pH 7.2 PBS封閉液，37℃、1小時(shí)，棄去封閉液，吹干備用；第二，生物素化抗體的制備單克隆抗體腹水提純采用辛酸法，生物素標(biāo)記單克隆抗體1mg/ml抗體溶液中以1∶100摩爾數(shù)之比加入NHS-LC-biotin，混勻后室溫放置2小時(shí)，裝入透析袋，對(duì)0.02mol/l、pH 7.2 PBS透析48小時(shí)，加入等體積甘油，在-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫坏谌?，酶?biāo)記抗體的制備辣根過氧化物酶5mg溶于0.5ml雙蒸水中，加0.06mol/l過碘酸鈉0.5ml、4℃反應(yīng)30分鐘，再加入0.16mol/l乙二醇室溫反應(yīng)30分鐘后，與1ml濃度為2mg/ml的抗體溶液混合，對(duì)0.05mol/l，pH 9.5的碳酸緩沖液4℃透析過夜，透析物與0.2ml，0.5％的四氫硼酸鈉4℃反應(yīng)2小時(shí)，加等量飽和硫酸銨4℃攪拌30分鐘，1000g離心15分鐘，沉淀溶于pH7.4、0.02mol/l PBS中，對(duì)同樣緩沖液透析過夜，加穩(wěn)定劑-30℃保存。
5，根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒的使用方法，其特征是用板式鏈親和素固相雙位點(diǎn)夾心一步法ELISA定量檢測(cè)血清cTnI的方法，鏈親和素預(yù)包被微孔板，每孔加入20μl抗原標(biāo)準(zhǔn)品或持測(cè)血清樣品，然后加100μl生物素化抗TnI單抗2μg/ml及辣根過氧化物酶標(biāo)記另一抗TnI單抗的混和液，用pH 7.2、0.02mol/l磷酸緩沖液，37℃反應(yīng)90分鐘后洗滌；加鄰苯二胺(OPD)底物液，37℃、15分鐘，加2mol/l硫酸終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀上測(cè)490nm處的吸光值(A)，以A490nm為縱坐標(biāo)，各TnI濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是用純化的牛心肌TnI抗原，經(jīng)Bayer公司的TnI試劑盒(TnI)定量后，用正常人血清TnI含量＜0.01ng/ml，稀釋成TnI含量為0.3、1.0、3.0、8.0、15、30ng/ml各參照標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行定量，以A490nm為縱座標(biāo)，各TnI參照標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，最低檢測(cè)量用TnI為0的標(biāo)準(zhǔn)品，作12復(fù)管測(cè)定，計(jì)算平均吸光值，以平均值+2SD計(jì)算，最低檢測(cè)限是0.3ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明試劑盒涉及生物技術(shù)，尤其是一種可用于酶標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)，將鏈親和素、生物素捕獲技術(shù)應(yīng)用于酶聯(lián)免疫技術(shù)中，建立板式鏈親和素雙位點(diǎn)夾心一步法定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，用于檢測(cè)患者血清cTnI水平。本發(fā)明在ELISA方法基礎(chǔ)上，通過鏈親和素—生物素捕獲系統(tǒng)將抗體、抗原或免疫復(fù)合物間接地固定于固相上，建立板式鏈親和素雙位點(diǎn)夾心一步法ELISA定量檢測(cè)血清cTnI。本發(fā)明是用鏈親和素預(yù)包被酶標(biāo)板，生物素標(biāo)記抗cTnI單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記另一株抗cTnI單克隆抗體。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、快速、低陰性本底等優(yōu)點(diǎn)。與相關(guān)進(jìn)口試劑對(duì)比二者有較高的符合率，本發(fā)明用于檢測(cè)血清cTnI有良好的開發(fā)使用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1402005SQ0213704
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月19日
發(fā)明者鄭佐婭, 王鴻利 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)