生物分子分離中的過(guò)濾器模塊的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于從細(xì)胞裂解液和其他包含顆粒材料的液體混合物中快速分離靶標(biāo)分子的裝置，使用所述裝置分離靶標(biāo)分子(尤其是核酸)的方法，以及用于進(jìn)行包括所述裝置的所述方法的試劑盒。
【專利說(shuō)明】生物分子分離中的過(guò)濾器模塊
[0001]本發(fā)明涉及用于從細(xì)胞裂解液和其他包含顆粒材料的液體混合物中快速分離靶標(biāo)分子的裝置，使用所述裝置分離靶標(biāo)分子(尤其是核酸)的方法，以及用于進(jìn)行包含所述裝置的所述方法的試劑盒。
[0002]在生物化學(xué)和生物過(guò)程中，經(jīng)常需要從包含顆?；蛐跄牧系囊后w混合物或樣品中分離和收集特定類型的分子。這能夠例如通過(guò)將混合物過(guò)濾從而將固體或絮凝材料截留在過(guò)濾材料上/過(guò)濾材料中來(lái)實(shí)現(xiàn)。能夠?qū)⒘魍ㄒ号c選擇性結(jié)合所需分子的材料接觸，從而使得將所需分子從過(guò)濾的液體中捕獲。然后可以從結(jié)合材料上洗脫并收集所需分子。 [0003]例如，從細(xì)菌中純化質(zhì)粒通常涉及產(chǎn)生細(xì)胞裂解液，所述細(xì)胞裂解液包含可溶性質(zhì)粒材料和不溶性細(xì)胞碎片、蛋白和基因組DNA顆粒。
[0004]裂解液通過(guò)將不溶性顆粒材料除去來(lái)澄清，所述除去通常通過(guò)離心或過(guò)濾裝置來(lái)進(jìn)行。然后將澄清的裂解液轉(zhuǎn)移到核酸結(jié)合固體材料上，所述核酸結(jié)合固體材料結(jié)合所需要的質(zhì)粒DNA。在任選的洗滌步驟之后，然后從結(jié)合材料上洗脫并收集靶標(biāo)DNA。
[0005]細(xì)胞裂解液的澄清和質(zhì)粒DNA的洗脫在本領(lǐng)域中被廣泛使用和描述，其中在數(shù)個(gè)不同的實(shí)施方式中的過(guò)濾步驟是通過(guò)將過(guò)濾器裝置與DNA結(jié)合柱的聯(lián)用來(lái)進(jìn)行。這樣的解決方法描述于，例如 W095/02049A1、KR2004/085927A、DE202005010007UUW02008/121121A2,W02008/150838AUff02009/157679Al 或 W02010/075116A2。
[0006]描述了其他的解決方法，其中在一個(gè)柱中包含用于沉淀截留的過(guò)濾器和DNA結(jié)合材料的，因此不能除去所述過(guò)濾器。這樣的一個(gè)實(shí)施方式示于例如W02008/150826A1。
[0007]在幾個(gè)現(xiàn)有技術(shù)裝置中，含有兩種不同類型的、用于將固體、顆粒或絮凝物截留的過(guò)濾器，例如前置過(guò)濾器(pre-filter)和深度過(guò)濾器。所述前置過(guò)濾器通常是將例如未裂解細(xì)胞、細(xì)胞碎片和其他顆粒截留的粗過(guò)濾器，而所述深度過(guò)濾器是將較細(xì)的沉淀或絮凝物截留。所述前置過(guò)濾器通常是由剛性材料制成，所述剛性材料如燒結(jié)的多孔聚乙烯或聚丙烯(例如 W02008/50838A1、W02008/50826AU W02005/12521A1 或 US2006252142A)、玻璃(W02009/58414A1)、金屬絲網(wǎng)(W02003/46178A1)或沸石(W02009/60847A1)。所述深度過(guò)濾器最常見(jiàn)地是由膜或?qū)有问降睦w維材料(包含紙)來(lái)制備，其中所述材料選自多糖如纖維素、乙酸纖維素，塑料如聚乙烯、聚丙烯、特氟隆(Teflon) (PTFE)、聚丙烯酸酯、聚酰胺或聚偏二氟乙烯或包含砜基的聚合物如聚苯基砜(polyphenylsulfone)、聚醚砜、聚砜、聚芳基砜或聚苯基砜。
[0008]其他所述用于將固體、沉淀和絮凝物截留的材料是玻璃、金屬或塑料的珠或絲網(wǎng)。
[0009]在兩個(gè)現(xiàn)有技術(shù)文件中，討論了用于將碎片和沉淀截留的水凝膠柱的應(yīng)用(W02009/157679A1和W02009/157680A1)。使用的材料是瓊脂糖，使得核酸通過(guò)但是將裂解液的大部分污染物截留。
[0010]細(xì)胞裂解液包含基因組DNA代表的高分子量生物分子，其對(duì)于剪切力是非常敏感的。在現(xiàn)有技術(shù)中使用的大多數(shù)過(guò)濾材料是相當(dāng)剛性的。因此，如果對(duì)基因組DNA施加高作用力，例如在高速離心期間施加高壓力，這種剛性材料會(huì)將該基因組DNA剪切。然后基因組DNA的片段能夠通過(guò)過(guò)濾器，并且結(jié)合到DNA結(jié)合基質(zhì)上，產(chǎn)生所需要的質(zhì)粒DNA的污染物。
[0011]在另一方面，當(dāng)瓊脂糖或另一種水凝膠被用作過(guò)濾材料時(shí)，所述材料本身對(duì)于外部作用力是非常敏感的。如W02009/157680A1中所討論的，含有瓊脂糖作為過(guò)濾器的柱必須在使用前不久制備，但是然后該柱僅僅能夠以1000rpm-3000rpm范圍內(nèi)的離心旋轉(zhuǎn)。如果使用較低的rpm, DNA沒(méi)有穿過(guò)瓊脂糖柱；如果使用較高的rpm,會(huì)破壞瓊脂糖。
[0012]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是開(kāi)發(fā)某種方法和裝置，所述方法和裝置用于將包含至少一種類型分子(所述分子對(duì)剪切力敏感)的液體混合物澄清，然后選擇性結(jié)合該混合物中所需分子并且收集所述經(jīng)結(jié)合的材料，其中將所需分子的污染物最小化。
[0013]該目標(biāo)通過(guò)包含過(guò)濾器模塊的澄清/結(jié)合裝置、所述裝置在靶標(biāo)分離方法中的應(yīng)用以及用于靶標(biāo)分離的、包含這種裝置的試劑盒來(lái)滿足，其中所述過(guò)濾器模塊包含彈性過(guò)濾材料。
[0014]按照本發(fā)明的澄清/結(jié)合裝置代表了某種裝置，所述裝置將包含液相和固體顆粒、沉淀和/或絮凝物的懸浮液澄清，所述澄清能夠通過(guò)例如過(guò)濾從液相中將顆粒、沉淀和/或絮凝物分離和/或截留來(lái)實(shí)現(xiàn)，并且所述裝置還能夠結(jié)合通過(guò)澄清器件(例如過(guò)濾器)的液相成分中的至少一種靶標(biāo)分子，從而從剩余的液相中將所述靶標(biāo)分離。
[0015]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于從樣品中分離至少一種靶標(biāo)分子的澄清/結(jié)合裝置，所述裝置包含過(guò)濾器模塊和靶標(biāo)結(jié)合柱。所述澄清/結(jié)合裝置能夠是單柱澄清/結(jié)合裝置，其中所述過(guò)濾器模塊包含于柱中，所述柱還包含靶標(biāo)結(jié)合材料。優(yōu)選地，所述過(guò)濾器模塊可從所述柱中除去。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述澄清/結(jié)合裝置是雙柱澄清/結(jié)合裝置，其中所述過(guò)濾器模塊是插入到所述結(jié)合柱中的附加柱(further column)的形式。包含所述過(guò)濾材料的柱的形式的過(guò)濾器模塊優(yōu)選被配制用于接受裂解液。
[0016]所述過(guò)濾器模塊包含至少一種過(guò)濾材料，所述過(guò)濾材料是基本避免過(guò)濾器堵塞的“深度床過(guò)濾”材料。所述材料優(yōu)選是彈性的，其表示例如手動(dòng)下可變形的，優(yōu)選其是松軟的和柔性的。所述材料優(yōu)選選自具有開(kāi)放孔(開(kāi)放孔道)的任意泡沫(發(fā)泡材料)或海綿。這樣的材料的示例為發(fā)泡的聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯(包括基于聚酯的聚氨酯)、聚酯、聚醚、聚苯乙烯、三聚氰胺，或其他具有開(kāi)放孔道的塑料聚合物或天然海綿如Porifera、動(dòng)物纖維海綿或植物纖維海綿。所述材料為本領(lǐng)域已知，例如用于空氣過(guò)濾器，例如用于醫(yī)療設(shè)備、繃帶緩沖、清潔應(yīng)用等。
[0017]彈性材料(優(yōu)選泡沫或海綿)的孔，應(yīng)該優(yōu)選在10 U m-1000 u m的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在25-500 y m的范圍內(nèi)，并且最優(yōu)選在50-200 y m的范圍內(nèi)。所述泡沫優(yōu)選具有每厘米5-50的孔道的數(shù)量，優(yōu)選20-40孔道/cm。
[0018]所述泡沫或海綿優(yōu)選是“自支承(self-supporting) ”的泡沫或海綿。這表示所述泡沫或海綿是彈性材料，由壓力變形，然而當(dāng)除去所施加的壓力時(shí)，基本恢復(fù)到其原始的形狀。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述彈性材料是柔軟材料，其可易于由人手指的力量變形。
[0019]這樣的彈性也能夠通過(guò)稱為壓縮硬度(或所述泡沫的壓縮力度)來(lái)測(cè)定，例如通過(guò)DIN EN IS03386來(lái)測(cè)量。能夠通過(guò)將所述泡沫的標(biāo)準(zhǔn)尺寸片壓縮至預(yù)定的量(常至40%)并且測(cè)量得到所述壓縮需要的力(kPa或N/m2)。優(yōu)選的材料的壓縮硬度(至40% )在0.5-50kPa的范圍內(nèi)，優(yōu)選l_30kPa的范圍內(nèi)，更優(yōu)選l_20kPa并且特別優(yōu)選2_10kPa。
[0020]由于使用的過(guò)濾材料的彈性和柔性特性，與不使用過(guò)濾器的方法例如離心相比，減少了剪切敏感的分子(如基因組DNA)的剪切并且在洗脫液中基因組DNA片段的量非常低。
[0021]過(guò)濾器模塊還優(yōu)選包含一層或兩層第二過(guò)濾器，優(yōu)選在彈性過(guò)濾器之下。優(yōu)選地，所述第二過(guò)濾器也不應(yīng)該由剛性材料制備，所述材料在高速離心中將敏感分子如基因組DNA剪切。所述第二過(guò)濾器能代表常用的深度過(guò)濾器，其優(yōu)選由纖維材料來(lái)制備。所述第二過(guò)濾器可以是膜或?qū)拥男问剑渲兴霾牧峡蛇x自多糖如纖維素，包括紙、乙酸纖維素，塑料如聚乙烯、聚丙烯、Teflon? (PTFE)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯酸酯、聚酰胺、尤其是Nylon?、聚偏二氟乙烯，包含砜基的聚合物如聚苯基砜、聚醚砜、聚砜、聚芳基砜或聚苯基砜或非DNA結(jié)合二氧化硅。
[0022]第二過(guò)濾器的孔小于彈性過(guò)濾器的孔，并且優(yōu)選在0.1-50 的范圍內(nèi)、優(yōu)選0.5-30 y m的范圍內(nèi)，最優(yōu)選1-10 y m的范圍內(nèi)。只要本文所述的彈性過(guò)濾器和第二過(guò)濾器的孔徑在其所述的范圍內(nèi)重疊，應(yīng)該清楚的是所述第二過(guò)濾器的孔徑應(yīng)該小于所述彈性過(guò)濾器的孔徑。
[0023]所述彈性過(guò)濾器的厚度和所述一個(gè)或多個(gè)第二過(guò)濾器的厚度并不限于本發(fā)明，然而，優(yōu)選彈性過(guò)濾器的厚度為例如1-1Omm,優(yōu)選2-8mm,更優(yōu)選3-5_。由于所述一個(gè)或多個(gè)第二過(guò)濾器相比彈性過(guò)濾器有意地截留較少的物質(zhì)，所述一個(gè)或多個(gè)第二過(guò)濾器的厚度優(yōu)選低于所述彈性過(guò)濾器的厚度。因此，所述一個(gè)或多個(gè)第二過(guò)濾器的厚度可各自在0.1-1mm的范圍內(nèi)。
[0024]所述一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器允許液相通過(guò)并且基本截留全部的固體/顆粒/絮凝材料。所述一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器以某種方式安裝在過(guò)濾器模塊中，所述方法使得裂解液必須通過(guò)所述一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器而不允許繞過(guò)。因此，例如，如果使用過(guò)濾柱，所述一個(gè)或多個(gè)過(guò)濾器與所述柱的側(cè)壁接觸或被置于與所述側(cè)壁接觸的固定器中。例如，所述彈性過(guò)濾器能夠依尺寸定制以符合所述柱的內(nèi)部，并與該柱的側(cè)壁接觸，尤其是當(dāng)其濕潤(rùn)時(shí)，例如與柱的內(nèi)徑相比，所述過(guò)濾器“尺寸變大(oversizing)”。在這種情況下，所述過(guò)濾器“抓住”所述柱的內(nèi)部。另外，所述過(guò)濾器能夠通過(guò)在所述過(guò)濾器下和/或其上的環(huán)來(lái)固定。如果將環(huán)置于所述過(guò)濾器之上，這樣具有其他優(yōu)勢(shì)，即所述液體裂解液直接通過(guò)所述彈性過(guò)濾器并且阻礙裂解液通過(guò)流下柱壁而繞過(guò)所述過(guò)濾器。
[0025]為了提供本發(fā)明的過(guò)濾器模塊，將彈性過(guò)濾器(例如泡沫或海綿)置于具有入口和出口的容器內(nèi)，所述容器例如管、柱、注射器等。所述容器能夠由塑料、金屬、復(fù)合材料、玻璃或其任意組合制成，或者任意其他非反應(yīng)性或生物可容性材料制成。所述容器能夠使用可注塑材料來(lái)制造，所述可注塑材料能夠耐受由離心或中等真空壓力造成的力。如果需要，第二過(guò)濾器也置于所述容器的內(nèi)部，優(yōu)選在所述彈性過(guò)濾器之下。過(guò)濾器中的至少一種可在容器內(nèi)被支承起來(lái)，所述支承例如通過(guò)下列方式設(shè)計(jì)所述容器，其在底部代表液體可透過(guò)性的支承結(jié)構(gòu)例如絲網(wǎng)、圍欄或任意相似的支承結(jié)構(gòu)如交聯(lián)、輪狀等，或包括端面的通道，或者所述過(guò)濾器通過(guò)支承器件 在容器內(nèi)被支承起來(lái)，所述支承器件例如固定器、環(huán)、絲網(wǎng)、圍欄或任意相似的支承結(jié)構(gòu)如交聯(lián)、輪狀等，或包括端面的通道，或者過(guò)濾器可通過(guò)例如膠水、膠、密封或相似粘合劑粘附在所述容器的壁上。另外，所述支承元件能夠是對(duì)結(jié)合柱的內(nèi)表面的改進(jìn)，例如在內(nèi)部孔的內(nèi)表面上形成的環(huán)形脊?fàn)钗?annular ridge)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，第二過(guò)濾器置于柱中的泡沫或海綿之下，其中所述第二過(guò)濾器可被支承。所述第二過(guò)濾器本身然后能用作彈性過(guò)濾器的支承物。如此制備的柱形式的過(guò)濾器模塊能夠插入到附加柱中，獲得雙柱裝置，所述附加柱中具有針對(duì)所需要靶標(biāo)的結(jié)合材料。
[0026]所述結(jié)合柱優(yōu)選配制成接受來(lái)自過(guò)濾器模塊的經(jīng)過(guò)濾的樣品。所述結(jié)合柱包含用于結(jié)合至少一種靶標(biāo)分子的結(jié)合材料。所述結(jié)合柱可由任意在本領(lǐng)域中已知的、用于結(jié)合所需靶標(biāo)的柱來(lái)代表，所述靶標(biāo)尤其是通過(guò)彈性過(guò)濾器或過(guò)濾器模塊的核酸如質(zhì)粒DNA或RNA，或者蛋白。除非另有說(shuō)明，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。通常，本文所用的命名在本領(lǐng)域熟知并常用。方向的術(shù)語(yǔ)如“上”和“下”，“頂部”和“底部”，“以上”和“以下”或“上部”或“下部”等在裝置使用中指部件的方向。在術(shù)語(yǔ)以單數(shù)形式提供的情況下，也考慮該術(shù)語(yǔ)的復(fù)數(shù)形式。
[0027]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“小量制備”或“小量準(zhǔn)備”是指來(lái)自約0.5-5ml的起始培養(yǎng)體積的純化規(guī)模。在小量制備純化中使用的柱或其他裝置也能在從約0.5ml-約5ml的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“中量/大量制備”或“中量/大量準(zhǔn)備”是指從5-100ml的培養(yǎng)體積開(kāi)始的純化規(guī)模。在中量制備純化中使用的柱或其他裝置能夠在約5ml-約15ml或約5ml_約25ml的范圍內(nèi)，而在大量制備純化中使用的柱或其他裝置能夠在約25ml-約100ml的范圍內(nèi)。
[0028]本文中使用的術(shù)語(yǔ)“柱”和“柱子”是指具有入口和出口并且能夠容納液體的裝置或容器。雖然柱通常是指具有大約圓柱形形狀的裝置和容器，可以理解的是本文使用的術(shù)語(yǔ)“柱”能夠指代具有任意形狀的裝置或容器，尤其是圓柱形，或其他形狀，包括但不限于主要是球形、錐形、長(zhǎng)方形、不規(guī)則形狀或其組合。
[0029]術(shù)語(yǔ)“靶標(biāo)生物分子”或“靶標(biāo)分子”可包含核酸、蛋白、脂質(zhì)、糖脂、通路產(chǎn)物或糖，其中優(yōu)選的靶標(biāo)分子是核酸或蛋白，特別優(yōu)選核酸。
[0030]本文使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白”或“蛋白質(zhì)”包含全長(zhǎng)蛋白、蛋白片段、天然狀態(tài)的蛋白或變性的蛋白。蛋白的混合物能夠是全長(zhǎng)蛋白的混合物、蛋白片段的混合物或全長(zhǎng)蛋白與蛋白片段的混合物。
[0031]本文使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”包含DNA和RNA，與分子量或來(lái)源無(wú)關(guān)。核酸包含單鏈或雙鏈核苷酸的聚合物的全部范圍，包括化學(xué)修飾的核苷酸，其如本領(lǐng)域已知的能夠形成堿基配對(duì)、與其他核酸可連接并且可被內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶切割。核酸可以來(lái)自任意天然來(lái)源或可以被修飾。DNA分子是任意大小,來(lái)自任意來(lái)源的任意DNA分子,包含來(lái)自病毒、原核生物和真核生物的DNA，以及合成DNA及其變體、衍生物和類似物。DNA可以是基因組DNA或染色體外DNA。RNA分子是任意大小，來(lái)自任意來(lái)源的任意RNA分子，包含來(lái)自病毒、原核生物和真核生物的RNA，以及合成RNA及其變體、衍生物和類似物。RNA和DNA可以是單鏈或雙鏈、線形或環(huán)形或超螺旋形。優(yōu)選的核酸被稱為“靶標(biāo)核酸”。
[0032] 按照本發(fā)明，“靶標(biāo)核酸”，優(yōu)選包含染色體外DNA，例如質(zhì)粒及其片段、載體及其片段、噬菌粒、粘粒、BAC、PAC、YAC、線粒體核酸分子、葉綠體核酸分子或其組合。具體地，優(yōu)選任意的載體和/或質(zhì)粒。它們可以是市售可得的、或合成的、或工程改造的或其衍生物。這種載體和/或質(zhì)?？梢员挥糜诳寺』騺喛寺「信d趣的核酸分子或由克隆或亞克隆感興趣的核酸分子衍生，并且因此也可以按照本發(fā)明來(lái)分離含有插入段、核酸片段或基因的重組載體。特別感興趣的載體的一般分類包含原核和/或真核克隆載體、表達(dá)載體、融合載體、雙雜交載體或反向雙雜交載體、用于不同宿主的穿梭載體、突變載體、轉(zhuǎn)錄載體、短發(fā)夾載體、用于接受大插入片段(酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)和Pl人工染色體(PAC))的載體等。其他感興趣的載體包含病毒來(lái)源載體(M13載體、細(xì)菌噬菌體載體、桿狀病毒載體、腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)，高、低或可調(diào)節(jié)拷貝數(shù)的載體、具有用于在單宿主中結(jié)合的相容復(fù)制子的載體(例如PACYC184和pBR322)以及真核附加體復(fù)制載體(例如PCDM8)。本發(fā)明考慮的載體包含含有插入的或額外的核酸片段或序列的載體(例如重組載體)以及本文所述的任意載體的衍生物或變體。按照本發(fā)明的有用的表達(dá)載體包含染色體衍生的載體、附加體衍生的載體和病毒衍生的載體,例如衍生自細(xì)菌質(zhì)?；蚣?xì)菌噬菌體的載體，以及衍生自其組合的載體，如粘粒和噬菌粒。 [0033]任意細(xì)胞、組織或生物體可被用作需要分離的靶標(biāo)分子的來(lái)源，從而將所述細(xì)胞、組織或生物來(lái)源(或其部分)中包含的所述靶標(biāo)分子從所述細(xì)胞、組織或生物體中釋放。細(xì)胞可以是原核或真核。生物體可以是原核、真核或病毒等，并且通常是指任意包含靶標(biāo)分子(例如感興趣核酸)的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主”或“宿主細(xì)胞”可在本文中互換使用。這樣的宿主的例子參見(jiàn) Maniatis 等，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))"，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約州冷泉港.(1982)。優(yōu)選的原核宿主包括但不限于埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌(E.coli))、桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、土壤桿菌屬(Agrobacter)(例如根癌土壤桿菌(A.tumefaciens))、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、顯核菌屬(Caryophanon)等的細(xì)菌。最優(yōu)選的原核宿主是大腸桿菌。在本發(fā)明中特別感興趣的細(xì)菌宿主包含大腸桿菌菌株K12、DH10B、DH5 a、HBlOl、JM109、Xllblue、Top 10、TopIOF和QIAGEN EZ。優(yōu)選的真核宿主包括但不限于真菌、魚類細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞，特別是昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含人細(xì)胞、CHO細(xì)胞、VERO細(xì)胞、Bowes黑色素瘤細(xì)胞、HepG2細(xì)胞等。細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、建立的細(xì)胞系、癌癥細(xì)胞系或正常細(xì)胞。示例性的動(dòng)物細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞如果蠅(Drosophila)細(xì)胞、夜蛾(Spodoptera) Sf9、Sf21細(xì)胞和粉紋夜蛾(Trichoplusa)High-Five細(xì)胞；線蟲細(xì)胞如秀麗隱桿線蟲(C.elegans)細(xì)胞；以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞如COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、VERO細(xì)胞、293細(xì)胞、PERC6細(xì)胞、BHK細(xì)胞和人細(xì)胞。按照本發(fā)明，也可使用任意病毒作為生物大分子(尤其是核酸分子)的細(xì)胞來(lái)源。還適于用作生物大分子來(lái)源的是血液或哺乳動(dòng)物器官的組織，例如衍生自腦、腎、肝、胰腺、血液、骨髓、肌肉、神經(jīng)、皮膚、泌尿生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、淋巴、胃腸道和相關(guān)組織來(lái)源以及衍生自哺乳動(dòng)物(包括人)的胚胎或胎兒的那些。這些細(xì)胞、組織和器官可以是正常的、轉(zhuǎn)化的或建立的細(xì)胞系，或它們可以是病變的，如涉及(由細(xì)菌、真菌或酵母、病毒(包含AIDS)或寄生蟲引起的)感染性疾病、遺傳或生物化學(xué)病變(例如囊性纖維化病、血友病、阿爾茨海默病、精神分裂癥、肌營(yíng)養(yǎng)不良或多發(fā)性硬化)或癌癥和癌變過(guò)程的那些。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的其他細(xì)胞、組織、病毒、器官和生物體也可作為生物大分子的來(lái)源使用，所述生物大分子的來(lái)源用于制備按照本發(fā)明的生物大分子。按照本發(fā)明，宿主或宿主細(xì)胞可用作需要分離的大分子的細(xì)胞來(lái)源。
[0034]本文中使用的“細(xì)胞破壞”或“細(xì)胞裂解”是指使用組合物或組合物的組分將細(xì)胞打開(kāi)，所述組合物或組合物的組分將用作所需分離的生物大分子來(lái)源的細(xì)胞、組織或生物體裂解、斷裂或打孔，，從而在所述細(xì)胞、組織或生物來(lái)源(或其部分)中包含的生物大分子從所述細(xì)胞、組織或生物體中釋放。按照本發(fā)明，所述細(xì)胞、組織或生物體不需要完全裂解、斷裂或打孔，并且不需要將在來(lái)源細(xì)胞、組織或生物體中包含的所有感興趣的大分子從其中釋放出來(lái)。優(yōu)選地，細(xì)胞破壞或細(xì)胞裂解化合物或組合物產(chǎn)生至少25%、50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多的釋放效果，所述釋放是將所述細(xì)胞、組織或生物體中含有的總的感興趣生物大分子釋放出來(lái)。
[0035]按照本發(fā)明，可以通過(guò)將細(xì)胞與造成或輔助細(xì)胞裂解或破壞的組合物或化合物接觸以使所述細(xì)胞裂解或破壞，盡管按照本發(fā)明可以使用機(jī)械力或物理力(例如壓力、超聲、溫度(加熱、冷凍)和/或凍融等)。另外，可使用機(jī)械力、物理力或裂解組合物/化合物的任意組合來(lái)破壞/裂解細(xì)胞，只要所述的方法基本不破壞感興趣的生物大分子。
[0036]使用的細(xì)胞破壞或細(xì)胞裂解化合物或組合物并不限制本發(fā)明。在裂解組合物中包含的組分優(yōu)選適于要分離或純化的所需靶標(biāo)生物分子。對(duì)于哪種類型的所需生物分子優(yōu)選包括哪種組分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并且不限制本發(fā)明?？梢园环N或多種去污劑，例如十二烷基硫酸鈉(SDS)、肌氨酰、曲通X-100、吐溫20、NP-40、N烷基葡糖苷、N-烷基麥芽糖苷、葡糖酰胺、地高辛、脫氧膽酸鹽、3-[(3_膽酰胺丙基)-二甲基銨基(dimethylammonio)]-l-丙烷磺酸酯(CHAPS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)或fcij35。濃度可以是任意合適的，例如約0.01%-10% (w/v),更優(yōu)選地約0.1%-5%?？梢源嬖谝环N或多種離液劑，例如碘化鈉、高氯酸鈉、胍或其鹽或尿素。另外，可以存在一種或多種酶，如溶菌酶、溶細(xì)胞酶、酵母裂解酶(zymolyase)、神經(jīng)氨酸酶、Novozym234、鏈球菌溶血素、綠木酶(cellulysin)、變?nèi)芫鼗蛉芷锨蚓浮？梢约slmM_5M的濃度存在的一種或多種無(wú)機(jī)鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鋰或氯化鐠?？梢源嬖谝环N或多種有機(jī)溶劑，如甲苯、苯酚、丁醇、異丙醇、異戊醇、乙醇、醚(例如二乙醚、二甲醚或乙基甲基醚)或氯仿，只要它們對(duì)于任意按照本發(fā)明使用的過(guò)濾器沒(méi)有負(fù)面影響。可以存在破壞生物大分子(例如多粘菌素B)細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁的完整性(例如裂解或造成孔的形成)的任意其他化合物，或任意前述的組合。所述組合物可以包含其他組分，例如螯合劑(例如乙二胺四乙酸二鈉(Na EDTA)、EGTA、⑶TA)、一種或多種蛋白酶(蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶)或前述的任意組合。裂解/破壞組合物的活性成分的所需濃度和組合限制本發(fā)明，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易測(cè)定。
[0037]本文使用的術(shù)語(yǔ)“澄清”是指從液體混合物(例如細(xì)胞裂解液)中除去不需要的固體、沉淀或絮凝材料(例如細(xì)胞碎片和/或大的不溶性分子)的過(guò)程。澄清細(xì)胞裂解液的常用方法包含離心和過(guò)濾。優(yōu)選地，在過(guò)濾器模塊中基本截留不需要的碎片，使得基本澄清的裂解液通過(guò)含有結(jié)合材料的結(jié)合柱。
[0038]本文使用的術(shù)語(yǔ)“洗脫”是指通過(guò)溶劑的方式將由結(jié)合基質(zhì)所結(jié)合的所需靶標(biāo)分子釋放。術(shù)語(yǔ)“洗脫溶液”、“洗脫緩沖液”和“洗脫溶劑”是指用于從所述材料上釋放分子的溶劑。術(shù)語(yǔ)“洗脫液”是指洗脫得到的并且包含所需分子的液體溶液。
[0039]“洗脫液”可以包含被認(rèn)為是“分離的”核酸。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”(如在“分離的生物大分子”中)表示所述分離的材料、組分或組合物等已經(jīng)從其他材料、污染物等中至少部分純化出來(lái)，所述材料、污染物等不是已經(jīng)分離的所述物質(zhì)、組分或組合物的部分。例如，“分離的生物大分子”是已經(jīng)以某種方式處理的生物大分子，所述方式除去至少一些其他的、與細(xì)胞、組織、器官或生物體相關(guān)的大分子和細(xì)胞組分。具體地，術(shù)語(yǔ)“分離的生物大分子”、“分離的核酸分子”或“分離的質(zhì)?！笔侵复蠓肿又破坊蛸|(zhì)粒制品，所述大分子制品或質(zhì)粒制品含有約 10%,20%,30%,40%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%、90%和93% (重量％)的感興趣的生物大分子，優(yōu)選超過(guò)95%、97.5%和98%，并且最優(yōu)選超過(guò)99%、99.5%和99.9%。然而，如普通技術(shù)人員會(huì)理解的，包含分離的大分子的溶液可以包含其他成分，例如一種或多種緩沖鹽和/或溶劑，例如水或有機(jī)溶劑等，并且相對(duì)于起始材料，所述大分子仍然被認(rèn)為是“分離的”大分子。
[0040]通過(guò)本發(fā)明所述的裝置、方法和試劑盒來(lái)分離的核酸分子還可以通過(guò)擴(kuò)增、克隆、測(cè)序、標(biāo)記、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯、核酸合成、內(nèi)切核酸酶消化、其他酶修飾等進(jìn)行表征或操作，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的方法。
[0041]本發(fā)明提供了某種裝置和方法，所述裝置和方法適于澄清或過(guò)濾包含剪切敏感的大分子的液體混合物或樣品，然后從經(jīng)澄清的或經(jīng)過(guò)濾的液體或樣品中將所需分子結(jié)合到結(jié)合材料中。所需分子的分離還能夠包含后續(xù)從所述結(jié)合材料洗脫所需分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含過(guò)濾器模塊的雙裝置，所述過(guò)濾器模塊以澄清/過(guò)濾柱的形式至少部分插入到結(jié)合柱中，其中所述澄清柱將來(lái)自液體混合物的固體、沉淀或絮凝材料截留，而所述結(jié)合柱結(jié)合來(lái)自過(guò)濾的液體中的一種或多種所需靶標(biāo)分子。如果需要，能夠從所述結(jié)合材料上洗脫所結(jié)合的靶標(biāo)分子。
[0042]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述過(guò)濾器模塊被插入到與所述結(jié)合材料相同的柱中。在這種實(shí)施方式中，所述過(guò)濾器模塊不是柱，而是例如盤，所述盤包封上述的彈性過(guò)濾器和任選的第二過(guò)濾器，其能夠置于結(jié)合柱內(nèi)部的預(yù)先的網(wǎng)格(intended lace)上。在這種情況下，所述結(jié)合柱優(yōu)選以如下方式來(lái)設(shè)計(jì)，即所述過(guò)濾器模塊通過(guò)上述的方式固定在其預(yù)先的位置上。按照本發(fā)明，優(yōu)選在樣品經(jīng)過(guò)過(guò)濾器之后除去所述過(guò)濾器模塊。因此，所述過(guò)濾器模塊優(yōu)選是從結(jié)合柱上可除去的。
[0043]所述澄清/結(jié)合裝置能用于樣品的澄清和從所述樣品中后續(xù)分離至少一種靶標(biāo)分子，其中使得剪切敏感分子的片段的污染物最小化。所述樣品能夠是液體樣品或是已經(jīng)在液體中懸浮的干樣品。例如，本文所述裝置能夠澄清細(xì)胞裂解液樣品并且從澄清的裂解液中分離核酸分子。在將樣品(例如裂解液)過(guò)濾并且一種或多種靶標(biāo)分子被結(jié)合材料捕獲之后，能夠除去并且丟棄內(nèi)部過(guò)濾器模塊(和不需要的碎片)。然后能夠任選地洗滌和洗脫結(jié)合到所述結(jié)合材料的核酸或一種或多種其他靶標(biāo)分子。
[0044]在上述的雙柱實(shí)施方式中，所述過(guò)濾器模塊對(duì)應(yīng)澄清/過(guò)濾柱。所述內(nèi)部澄清/過(guò)濾柱和所述結(jié)合柱兩者都能夠由塑料、金屬、復(fù)合材料、玻璃或其任意組合，或任意其他合適的非反應(yīng)性或生物相容性材料來(lái)制成，能夠耐受由使用所述裝置的離心而產(chǎn)生的力。
[0045]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，其中所述過(guò)濾器模塊是以能夠被插入到結(jié)合柱中的柱的形式，所述過(guò)濾器模塊/澄清柱的入口或上部開(kāi)口端與所述結(jié)合柱的入口或上部開(kāi)口端取向相同的方向，并且所述過(guò)濾器模塊/澄清柱的出口與所述結(jié)合柱的出口取向相同的方向。所述過(guò)濾器模塊/澄清柱能夠沿著所有的方向擴(kuò)展穿過(guò)內(nèi)部孔，從而使得所述過(guò)濾器模塊/澄清柱的出口與在所述結(jié)合柱中的結(jié)合材料鄰接?；蛘?，所述過(guò)濾器模塊/澄清柱僅能部分?jǐn)U展穿過(guò)內(nèi)部孔， 從而使得在所述過(guò)濾器模塊/澄清柱的出口和所述結(jié)合材料之間存在間隙。
[0046]優(yōu)選地，當(dāng)插入到結(jié)合柱中，甚至在離心時(shí)，所述過(guò)濾器模塊包含用于將所述過(guò)濾器模塊固定在其預(yù)先位置的任意方式。所述方式可以是例如環(huán)、曲柄、肩部等，所述方式優(yōu)選讓所述過(guò)濾器模塊的周圍大于結(jié)合柱的周圍，使得所述過(guò)濾器模塊不能更深地插入到結(jié)合柱中，或?qū)⑦^(guò)濾器模塊置于其對(duì)應(yīng)的結(jié)合柱內(nèi)部的曲柄或肩部上。
[0047]兩個(gè)柱都具有肩部的雙柱裝置的例子示于圖1(在所述外柱中的結(jié)合材料未顯示)。在所述的圖中，所述結(jié)合柱(結(jié)合材料未顯示)示作(I)，插入到所述結(jié)合柱中的所述過(guò)濾器模塊示作(2)。所述彈性過(guò)濾器(3)置于第二過(guò)濾器(4)之上。
[0048]另外所述過(guò)濾器模塊(例如以澄清柱的形式)可以如下方式設(shè)計(jì)，即其能夠插入到所述結(jié)合柱中(而不用任何用于將所述柱固定在適當(dāng)位置(in place)的方式)，但其能夠在過(guò)濾步驟之后被移去。
[0049]如果需要，所述結(jié)合柱的內(nèi)徑能夠依尺寸定制以容納澄清柱的尺寸，從而使得所述澄清柱的至少一部分外表面與所述結(jié)合柱的一部分內(nèi)表面接觸并且提供所述澄清柱和結(jié)合柱之間的緊密匹配。這種緊密匹配能是兩個(gè)表面之間的連接，其能通過(guò)表面之間互相接觸之后的摩擦力來(lái)實(shí)現(xiàn)。緊密匹配也能夠通過(guò)定制所述澄清柱和結(jié)合柱的形狀，從而使得一個(gè)或另一個(gè)(或兩個(gè))柱在尺寸上輕微偏離標(biāo)稱尺寸來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)所述兩個(gè)柱的圓錐形狀來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，緊密匹配能夠通過(guò)定制所述柱的曲柄或肩部的形狀來(lái)獲得，所述曲 柄或肩部用肩部或曲柄互相緊密接觸的方式來(lái)將所述澄清柱固定在適當(dāng)位置。在所述澄清柱和結(jié)合柱之間的匹配能夠是足夠氣密的，從而使得施加于所述結(jié)合柱的出口的負(fù)壓會(huì)在雙柱體系中產(chǎn)生真空。通常，當(dāng)位于所述結(jié)合柱內(nèi)時(shí)，所述澄清柱會(huì)是某種尺寸，從而使所述澄清柱的至少部分外表面與所述結(jié)合柱的至少部分內(nèi)表面接觸，并且當(dāng)施加負(fù)壓時(shí)形成與所述結(jié)合柱的真空密封。在所述外柱和澄清柱之間的匹配不會(huì)妨礙在不施加負(fù)壓時(shí)，將所述澄清柱從所述結(jié)合柱中移去。
[0050]所述結(jié)合柱包含用于結(jié)合所需靶標(biāo)的結(jié)合材料。所述結(jié)合材料能夠是用于捕獲靶標(biāo)分子的任意合適的材料，包括但不限于纖維、基質(zhì)、樹(shù)脂、膜、盤或過(guò)濾器或任意其他合適的材料或其組合。所述結(jié)合材料能夠捕獲至少一種類型的靶標(biāo)分子，包括但不限于核酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述結(jié)合材料是DNA或RNA結(jié)合材料，尤其是能夠結(jié)合質(zhì)粒DNA的材料。合適的DNA結(jié)合材料包含二氧化硅和非二氧化硅DNA結(jié)合材料或其組合。所述DNA結(jié)合材料還能夠是任意合適的色譜材料，包括但不限于硅膠、氧化鋁、二氧化鈦、多孔玻璃、聚合物或其任意組合。另外，所述結(jié)合材料能夠是電荷開(kāi)關(guān)膜(charge switch membrane),包含玻璃纖維或硝酸纖維素，或陰離子交換基質(zhì)，包含衍生的玻璃纖維。所述結(jié)合材料還能夠是幾種類型的例如在不同層中的所述材料的組合。所述結(jié)合材料能夠位于結(jié)合柱的內(nèi)部的出口或出口附近。所述結(jié)合材料能夠位于任意合適的位置，從而使得通過(guò)所述結(jié)合柱并且從出口孔離開(kāi)的樣品必須通過(guò)所述結(jié)合材料。
[0051]所述結(jié)合材料優(yōu)選包含合適尺寸的孔，以提供足夠的液體或澄清的樣品流穿過(guò)所述裝置，同時(shí)提供能夠?qū)⒎肿咏Y(jié)合的高表面積，并且從而提供對(duì)至少一種靶標(biāo)分子的優(yōu)良產(chǎn)率。所述孔的尺寸能夠是任意合適的、使得能夠?qū)⒅辽僖环N靶標(biāo)分子結(jié)合的尺寸，例如在約0.5 ii m和約5 u m之間的范圍內(nèi)。
[0052]所述結(jié)合柱能夠包含一種或多種所述結(jié)合材料的支承元件，或其能夠通過(guò)例如膠水、膠、密封或相似粘合劑粘附于容器的壁上。所述支承元件能夠?qū)⒔Y(jié)合材料保持在柱內(nèi)部的位置上。所述一種或多種支承元件能夠是物理上限制所述結(jié)合材料移動(dòng)的任意結(jié)構(gòu)。合適的支承元件包括但不限于固定器、環(huán)、絲網(wǎng)或玻璃料。另外，所述支承元件能夠是對(duì)結(jié)合柱的內(nèi)表面的改進(jìn)，例如在內(nèi)部孔的內(nèi)表面上形成的環(huán)形脊?fàn)钗?。[0053]本發(fā)明還提供用于澄清包含至少一種靶標(biāo)分子和固體顆粒、沉淀和/或絮凝物的懸浮液的方法，其中所述懸浮液還可以包含剪切敏感的分子，所述方法包括涉及如上述定義的、用于從靶標(biāo)分子中將所述固體顆粒、沉淀和/或絮凝物分離的過(guò)濾器模塊的過(guò)濾步驟，其中所述靶標(biāo)分子保留在溶液中。尤其是所述的方法適合用于從這種懸浮液中將所需靶標(biāo)分子分離和/或純化，其中所述懸浮液還可以包含剪切敏感的分子，如高分子量分子，包括涉及如上述定義的過(guò)濾器模塊的過(guò)濾步驟。所得的流通液包含溶液中所需的靶標(biāo)分子，基本不含顆粒材料如固體、沉淀和懸浮物。另外，所得的溶液優(yōu)選基本不含剪切敏感大分子的片段或其自身的片段。所述流通液可與靶標(biāo)結(jié)合材料接觸，以從所述流通液中將所述靶標(biāo)分離/分開(kāi)。
[0054]在按照本發(fā)明的優(yōu)選方法中，分離或純化核酸，所述核酸優(yōu)選DNA，最優(yōu)選質(zhì)粒DNA。
[0055]優(yōu)選地，所述核酸的分離和/或純化包括將所述核酸結(jié)合到核酸結(jié)合材料上的步驟，所述步驟優(yōu)選在結(jié)合柱中進(jìn)行。
[0056]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于分離和/或純化核酸的方法，所述方法包括以下步驟:
[0057](i)將包含核酸的樣品與包含至少一種由如上述彈性材料制成的過(guò)濾器接觸
[0058](ii)向所述樣品施加外力以使得所述樣品通過(guò)所述過(guò)濾器模塊
[0059]所述方法優(yōu)選還包括以下步驟:
[0060](iii)將步驟(ii)的流通液與核酸結(jié)合材料接觸
[0061](iv)任選地洗滌所述結(jié)合的核酸
[0062](V)從所述結(jié)合材料中將所述核酸洗脫。
[0063]所述樣品優(yōu)選是細(xì)胞裂解液，特別是包含基因組DNA和靶標(biāo)生物分子的細(xì)胞裂解液。優(yōu)選的靶標(biāo)生物分子是靶標(biāo)核酸或蛋白，尤其是質(zhì)粒DNA。
[0064]能夠向包含所述過(guò)濾器模塊的柱中加入含有所需分子的樣品。如果所述過(guò)濾器模塊是以上述澄清柱的形式，所述樣品通過(guò)所述澄清柱的開(kāi)口端加入到澄清柱中。
[0065]優(yōu)選地，施加離心力或負(fù)壓(真空)使得樣品通過(guò)所述過(guò)濾器模塊/澄清柱。
[0066]優(yōu)選地，所述流通液穿過(guò)進(jìn)入結(jié)合柱。由于所述樣品通過(guò)澄清柱，所包含的過(guò)濾器能夠防止大的不溶性分子通過(guò)所述澄清柱的出口。由于所述彈性過(guò)濾器(優(yōu)選泡沫或海綿)的彈性性質(zhì)，甚至在向所述樣品施加高離心速度的情況下，也基本不會(huì)將剪切敏感的分子如基因組DNA剪切。因此，將剪切敏感分子的片段的量最小化。
[0067]所述過(guò)濾的樣品優(yōu)選與位于所述結(jié)合柱中的結(jié)合材料接觸。所述結(jié)合材料能夠結(jié)合一種或多種所需分子，同時(shí)離心力或真空使得剩余液體通過(guò)所述結(jié)合柱的出口離開(kāi)所述裝置。然后能夠除去所述過(guò)濾器模塊/澄清柱。任選地可以加入一種或多種洗滌溶液，并且通過(guò)離心或真空使其通過(guò)所述結(jié)合材料并且離開(kāi)所述裝置。所述洗滌通過(guò)除去來(lái)自結(jié)合材料的未結(jié)合的分子、雜質(zhì)或其他碎片來(lái)增加所需分子的純度。然后能夠向所述結(jié)合柱中加入洗脫液以從所述結(jié)合材料中將所需分子洗脫。優(yōu)選收集洗脫液。能夠使用多等份的洗脫溶液。
[0068]在所述方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述懸浮液或液體混合物是細(xì)胞裂解液，并且所述過(guò)濾器模塊以澄清柱的形式操作。澄清的裂解液通過(guò)所述結(jié)合材料，所述結(jié)合材料結(jié)合感興趣的核酸，優(yōu)選質(zhì)粒DNA。然后能夠移去所述澄清柱并且洗脫和收集所述結(jié)合的質(zhì)粒DNA。本發(fā)明的雙柱裝置使得能夠在單個(gè)短(1-3分鐘)離心或真空步驟中澄清和結(jié)合。
[0069]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于分離和/或純化質(zhì)粒DNA的方法，所述方法包括以下步驟:
[0070](i)將包含基因組DNA和質(zhì)粒DNA的細(xì)胞裂解液與過(guò)濾器模塊接觸，所述過(guò)濾器模塊包含至少一種由自支承的泡沫或海綿制成的過(guò)濾器
[0071](ii)向所述樣品施加外力以使得所述樣品通過(guò)所述過(guò)濾器模塊
[0072](iii)將步驟(ii)的流通液與DNA結(jié)合材料接觸
[0073](iv)任選地洗滌所述結(jié)合的DNA
[0074](V)從所述結(jié)合材料中將所述DNA洗脫。
[0075]本文還提供了用于從樣品中將感興趣的靶標(biāo)分子分離的試劑盒。用于將感興趣的靶標(biāo)分子分離的試劑盒包含至少一種如本文所述的過(guò)濾器模塊。
[0076]優(yōu)選地，所述試劑盒包含用于從樣品中將至少一種靶標(biāo)分子分離的澄清/結(jié)合裝置，所述裝置包括:配制成用于接受樣品的過(guò)濾器模塊/澄清柱，所述澄清柱包含至少一種由如上述的彈性過(guò)濾器材料(優(yōu)選自支承的泡沫或海綿)制成的過(guò)濾器，其配制為從所述樣品中過(guò)濾至少一種非靶標(biāo)分子，以及配置成用于接受來(lái)自過(guò)濾器模塊/澄清柱的經(jīng)過(guò)濾樣品的結(jié)合柱，所述結(jié)合柱包含用于結(jié)合至少一種靶標(biāo)分子的結(jié)合材料。
[0077]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑盒包含含有過(guò)濾器模塊和結(jié)合材料的柱，所述過(guò)濾器模塊包含至少一種由如上述的彈性材料(優(yōu)選泡沫或海綿)制成的過(guò)濾器，，其中優(yōu)選所述過(guò)濾器模塊可從柱中除去。
[0078]所述試劑盒還包括至少一種選自以下的其他成分:至少一種裂解緩沖液；至少一種RNA酶儲(chǔ)液；至少一種重懸緩沖液；至少一種中和緩沖液；至少一種洗滌緩沖液；至少一種洗脫緩沖液；進(jìn)行所述靶標(biāo)分離/純化方法的說(shuō)明書。
[0079]附圖:
[0080]圖1顯示在離心柱中用于將過(guò)濾和結(jié)合聯(lián)用的過(guò)濾器模塊，其中在離心柱中的結(jié)合材料未顯示。(I)離心柱(結(jié)合材料未顯示)，(2)過(guò)濾器模塊，(3)柔軟、彈性的上部過(guò)濾材料，(4)壓實(shí)第二過(guò)濾器。
[0081]圖2顯示過(guò)濾器模塊的可能設(shè)計(jì)，其中柱的底部代表支承方式(過(guò)濾材料未顯示)。
[0082]圖3顯示了在瓊脂糖凝膠上按照實(shí)施例2分離的質(zhì)粒制劑。
[0083]I過(guò)濾器，所述過(guò)濾器具有非結(jié)合二氧化硅作為下部過(guò)濾材料，和多孔玻璃料，PE，10 u m作為上部過(guò)濾材料
[0084]2過(guò)濾器，所述過(guò)濾器具有多孔玻璃料PE7-12 U m作為下部過(guò)濾材料，和GazePET，20 um作為上部過(guò)濾材料
[0085]3過(guò)濾器，所述過(guò)濾器具有非結(jié)合二氧化硅作為下部過(guò)濾材料，和多孔玻璃料，PE，20-60 u m作為上部過(guò) 濾材料
[0086]4過(guò)濾器，所述過(guò)濾器具有非結(jié)合二氧化硅作為下部過(guò)濾材料，和多孔玻璃料，PE，10-20 u m作為上部過(guò)濾材料
[0087](5)參比:代替過(guò)濾的10分鐘離心將沉淀球團(tuán)化[0088]圖4顯示了在瓊脂糖凝膠上按照實(shí)施例3的小量制備，包含(I)針刺的毛氈(needle punched felt)和(2)參比:10分鐘離心將沉淀球團(tuán)化。
[0089]圖5顯示的瓊脂糖凝膠表示按照實(shí)施例1使用包含泡沫的過(guò)濾器模塊進(jìn)行的質(zhì)粒制備結(jié)果(1)，和按照參比(10分鐘離心將沉淀球團(tuán)化)的制備結(jié)果(2)。
[0090]圖6顯示根據(jù)用于裂解液澄清的過(guò)濾器的類型，與按照實(shí)施例5分離的質(zhì)粒相比基因組DNA的含量。小量制備如下所示。(1)參比:代替過(guò)濾的10分鐘離心以將沉淀球團(tuán)化，(2)使用泡沫作為過(guò)濾材料分離的質(zhì)粒，以及(3)使用針刺毛氈作為過(guò)濾材料分離的質(zhì)粒。
[0091]圖7顯示根據(jù)用于裂解液澄清的過(guò)濾器的類型，與按照實(shí)施例5分離的質(zhì)粒相比基因組DNA的含量。顯示了兩種小量制備。(1)參比:10分鐘離心將沉淀球團(tuán)化，(2)使用泡沫作為過(guò)濾材料分離的質(zhì)粒，以及(3)使用針刺毛氈作為過(guò)濾材料分離的質(zhì)粒。
實(shí)施例
[0092]實(shí)施例1:
[0093]按照以下方案從細(xì)菌細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA。通過(guò)將細(xì)胞球團(tuán)化的離心在1.5mlEppendorf管中從細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基中收獲細(xì)胞。使用的緩沖液、溶液和DNA結(jié)合柱來(lái)自市售可得的QIAprep試劑盒(德國(guó)希爾登的恰根公司(Qiagen)),其設(shè)計(jì)用于質(zhì)粒DNA的分離。
[0094]離心方案
[0095]所有的離心步驟在13.0OOrpm下進(jìn)行。
[0096]1.在250 ul的緩沖液Pl中重懸球團(tuán)化的細(xì)菌細(xì)胞并且轉(zhuǎn)移至微量離心管中。
[0097]2.加入250 U l緩沖液P2并且通過(guò)將管顛倒4_6次來(lái)徹底混合。
[0098]3.加入350 U l緩沖液N3并且立即通過(guò)將管顛倒4_6次來(lái)徹底混合。
[0099]4.通過(guò)傾析或移液將包含來(lái)自步驟4沉淀的整個(gè)樣品體積加到過(guò)濾器模塊，所述過(guò)濾器模塊是插入QIAprep離心柱中的柱的形式中。所述過(guò)濾器模塊包含聚氨酯泡沫和非結(jié)合的二氧化硅膜(例如不結(jié)合核酸的二氧化硅膜)。
[0100]5.整個(gè)組件離心1分鐘，棄去流通液。
[0101]6.從QIApr印離心柱中除去并且丟棄所述過(guò)濾器模塊。
[0102]7.通過(guò)加入0.5ml緩沖液PB并且離心30-60秒來(lái)洗滌所述QIApr印離心柱。棄
去流通液。
[0103]8.通過(guò)加入0.75ml緩沖液PE并且離心30-60秒來(lái)洗滌所述QIApr印離心柱。
[0104]9.棄去流通液，并且將柱再離心1分鐘以除去殘余的洗滌緩沖液。
[0105]10.QIApr印柱置于干凈的1.5ml微量離心管中。為了洗脫DNA，向各個(gè)QIApr印離心柱的中心加入50 ul緩沖液EB(10mM Tris *Cl,pH8.5)，放置I分鐘，并且離心I分鐘。收集洗脫液。
[0106]真空方案
[0107]1.按照QIAprep Miniprep手冊(cè)中的詳細(xì)內(nèi)容準(zhǔn)備真空歧管和QIAprep離心柱。
[0108]2.在250iU的緩沖液Pl中重懸球團(tuán)化的細(xì)菌細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)移至微量離心管中。
[0109]3.加入250 U l緩沖液P2并且通過(guò)將管顛倒4-6次來(lái)徹底混合。
[0110]4.加入350 u l緩沖液N3并且立即通過(guò)將管顛倒4-6次來(lái)徹底混合。[0111]5.通過(guò)傾析或移液將包含來(lái)自步驟4沉淀的整個(gè)樣品體積加到過(guò)濾器模塊，所述過(guò)濾器模塊是插入到真空歧管上的QIAprep離心柱中的柱的形式。所述過(guò)濾器模塊包含聚氨酯泡沫和非結(jié)合的二氧化硅膜。
[0112]6.打開(kāi)真空源以將溶液抽吸通過(guò)所述過(guò)濾器模塊和QIApr印離心柱，然后關(guān)閉真空源。
[0113]7.從QIApr印離心柱中除去并且丟棄所述過(guò)濾器模塊。 [0114]8?通過(guò)加入0.5ml緩沖液PB來(lái)洗滌所述QIApr印離心柱。打開(kāi)真空源以將洗滌溶液抽吸通過(guò)所述柱，然后關(guān)閉真空源。
[0115]9.通過(guò)加入0.75ml緩沖液PE來(lái)洗滌所述QIApr印離心柱。打開(kāi)真空源以將洗滌溶液抽吸通過(guò)所述柱，然后關(guān)閉真空源。
[0116]10.所述QIApr印離心柱置于2ml的收集管中并且轉(zhuǎn)移至微量離心管中。在
13.0OOrpm下進(jìn)行I分鐘離心以除去殘留的洗滌緩沖液。
[0117]11?所述QIApr印柱置于干凈的1.5ml微量離心管中。為了洗脫DNA，向各個(gè)QIAprep離心柱的中心加入50 U I緩沖液EB (IOmM Tris ? Cl，pH8.5)，放置I分鐘，并且在
13.0OOrpm下離心I分鐘。收集洗脫液。
[0118]如在QIAprep Miniprep豐冊(cè)(2005年6月)第22-23頁(yè)所沭的作為參比的方案
[0119]1.在250iU的緩沖液Pl中重懸球團(tuán)化的細(xì)菌細(xì)胞并且轉(zhuǎn)移至微量離心管中。
[0120]2.加入250 U I緩沖液P2并且通過(guò)將管顛倒4-6次來(lái)徹底混合。
[0121]3.加入350 u I緩沖液N3并且立即通過(guò)將管顛倒4_6次來(lái)徹底混合。
[0122]4.將樣品在臺(tái)式微量離心機(jī)中在13，OOOrpm下離心10分鐘。
[0123]5.來(lái)自步驟4的上清被轉(zhuǎn)移至QIAprep離心柱。
[0124]6.將所述QIAprep離心柱離心60秒。棄去流通液。
[0125]7.通過(guò)加入0.5ml緩沖液PB并且離心30-60秒來(lái)洗滌所述QIApr印離心柱。棄
去流通液。
[0126]8.通過(guò)加入0.75ml緩沖液PE并且離心30-60秒來(lái)洗滌所述QIApr印離心柱。
[0127]9.棄去流通液，并且將柱再離心I分鐘以除去殘余的洗滌緩沖液。
[0128]10?所述QIApr印柱置于干凈的1.5ml微量離心管中。為了洗脫DNA，向各個(gè)QIAprep離心柱的中心加入50 U I緩沖液EB (IOmM Tris ? Cl，pH8.5)或水，放置I分鐘，并且離心I分鐘。收集洗脫液。
[0129]作為“參比”，分別通過(guò)相同的方法處理樣品，除了代替過(guò)濾步驟，通過(guò)離心(10分鐘，13.0OOrpm)球團(tuán)化來(lái)除去固體、沉淀和絮凝物，并且所述上清被轉(zhuǎn)移到新的管中并進(jìn)一步加工。
[0130]實(shí)施例2
[0131]使用用于裂解液澄清的過(guò)濾(包含剛性上部過(guò)濾材料的過(guò)濾器模塊)所實(shí)施的質(zhì)粒小量制備或作為參比的離心(球團(tuán)化)所實(shí)施的質(zhì)粒小量制備的比較:
[0132]按照實(shí)施例1中所述的離心方案從大腸桿菌T0P10F細(xì)胞的5ml LB培養(yǎng)基中分離質(zhì)粒PUC19。在過(guò)濾器模塊中使用四種不同類型的過(guò)濾材料作為上部過(guò)濾器。
[0133]I過(guò)濾器，所述過(guò)濾器具有非結(jié)合二氧化硅作為下部過(guò)濾材料，和多孔玻璃料，PE，10 u m作為上部過(guò)濾材料，[0134]2過(guò)濾器，所述過(guò)濾器具有多孔玻璃料PE，7-12 μ m作為下部過(guò)濾材料，和GazePET，20 μ m作為上部過(guò)濾材料，
[0135]3過(guò)濾器，所述過(guò)濾器具有非結(jié)合二氧化硅作為下部過(guò)濾材料，和多孔玻璃料，PE，20-60 μ m作為上部過(guò)濾材料，
[0136]4過(guò)濾器，所述過(guò)濾器具有非結(jié)合二氧化硅作為下部過(guò)濾材料，和多孔玻璃料，PE，10-20 μ m作為上部過(guò)濾材料。
[0137]所有的樣品在瓊脂糖凝膠上分析。所述膠示于圖3。在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行根據(jù)各個(gè)洗脫液的OD26tl的150ng DNA,所述洗脫液包含各自的質(zhì)粒DNA。能夠看到，與通過(guò)將粗裂解液(5)離心的制備相比，所有燒結(jié)的材料(1-4)產(chǎn)生了明顯較高的所需質(zhì)粒DNA的gDNA污染物。
[0138]實(shí)施例3
[0139]用剛性上部過(guò)濾材料的過(guò)濾與作為參比的球團(tuán)化的比較:圖4
[0140]按照實(shí)施例1中所述的離心方案，分別從大腸桿菌DHlOB細(xì)胞的5mlLB培養(yǎng)基中分離質(zhì)粒PUC19或從大腸桿菌DH5 α細(xì)胞的5ml LB培養(yǎng)基中分離質(zhì)粒pCMVi3。作為過(guò)濾器模塊中的上部過(guò)濾材料，使用針刺毛氈(I)(剛性過(guò)濾材料)與參比(2)進(jìn)行比較。所有樣品均一式三份地進(jìn)行分析。在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行根據(jù)各個(gè)洗脫液的OD26tl的150ng DNA,所述洗脫液包含各自的質(zhì)粒DNA。所述凝膠顯示與由球團(tuán)化澄清的樣品相比，用針刺毛氈過(guò)濾的樣品包含明顯較多的(片段化的)基因組DNA。
[0141]實(shí)施例4
[0142]用彈性/柔軟 上部過(guò)濾材料的過(guò)濾與作為參比的球團(tuán)化的比較:圖5
[0143]按照實(shí)施例1中所述的離心方案，分別從大腸桿菌DHlOB細(xì)胞的5mlLB培養(yǎng)基中分離質(zhì)粒PUC19或從大腸桿菌DH5a細(xì)胞的5ml LB培養(yǎng)基中分離質(zhì)粒pCMV β。作為過(guò)濾器模快中的上部過(guò)濾器，聚氨酯、聚乙烯或聚苯乙烯泡沫用于與沉淀的參比球團(tuán)化進(jìn)行比較。所有樣品均一式三份地進(jìn)行分析。在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行根據(jù)各個(gè)洗脫液的OD26tl的150ngDNA,所述洗脫液包含各自的質(zhì)粒DNA。按照?qǐng)D5所示的凝膠分析，兩種類型的樣品中都沒(méi)有可見(jiàn)的基因組DNA。
[0144]實(shí)施例5
[0145]基因組DNA污染物的定量
[0146]為了再次定量在樣品中基因組DNA污染物的差異，按照實(shí)施例1的方案分離質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是來(lái)自T0P10F細(xì)胞的5ml LB培養(yǎng)基的pUC19和來(lái)自DH5 a細(xì)胞的5ml LB培養(yǎng)基的pBRCMVP。使用如實(shí)施例4中的聚氨酯泡沫或如實(shí)施例3中的針刺毛氈作為上部過(guò)濾材料。在質(zhì)粒DNA的洗脫之后，使用125ng的質(zhì)粒DNA作為實(shí)時(shí)PCR的模版。為了測(cè)定基因組DNA污染物的量，使用對(duì)于染色體丙酮酸激酶基因退火的引物和DNA探針。所述引物和探針的序列如下:
[0147]引物A Tcg taa gcg ttc tga cgt tat c
[0148]引物B Cat gat gcc gtc aga ggc ttc gag
[0149]探針 FAM-acc tga aag cgc acg gcg gcg aa
[0150]通過(guò)具有已知量的基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)系列方式來(lái)定量污染的基因組DNA的量。
[0151]如圖6和圖7所示，在用剛性材料來(lái)過(guò)濾的樣品中基因組DNA的污染物遠(yuǎn)高于用按照本發(fā)明的泡沫來(lái)過(guò)濾的樣品。作為參比，將質(zhì)粒制備用作模版，所述質(zhì)粒制備是使用將裂解液中的沉淀進(jìn)行球團(tuán)化來(lái)制備的。分別在圖6和圖7中，樣品(I)表示參比:10分鐘離心以球團(tuán)化沉淀，樣品(2)表示使用過(guò)濾器模塊分離的質(zhì)粒，所述過(guò)濾器模塊含有泡沫作為上部過(guò)濾材料和非結(jié)合二氧化硅作為下部過(guò)濾器，以及樣品(3)表示使用過(guò)濾器模塊分離的質(zhì)粒，所述過(guò)濾器模塊包含針刺毛氈(更剛性的材料)作為上部過(guò)濾材料和非結(jié)合二氧化硅作為下 部過(guò)濾器。
【權(quán)利要求】
1.一種包含過(guò)濾器模塊的澄清/結(jié)合裝置，其中所述過(guò)濾器模塊包含彈性過(guò)濾材料。
2.包含彈性過(guò)濾材料的過(guò)濾器模塊在用于分離核酸的方法中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的澄清/結(jié)合裝置或如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述彈性過(guò)濾材料是開(kāi)孔的泡沫或海綿。
4.如權(quán)利要求3所述的澄清/結(jié)合裝置或應(yīng)用，其特征在于，所述過(guò)濾器是由發(fā)泡的聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚酯、聚醚、聚苯乙烯、三聚氰胺、天然海綿、動(dòng)物纖維海綿或植物纖維海綿制成。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的澄清/結(jié)合裝置或應(yīng)用，其特征在于，所述過(guò)濾器模塊還包含由纖維材料制成的第二過(guò)濾器。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的澄清/結(jié)合裝置或應(yīng)用，其特征在于，所述第二過(guò)濾器置于流動(dòng)方向上的彈性過(guò)濾器之下或之后，并且所述第二過(guò)濾器的孔徑小于所述彈性過(guò)濾器的孔徑。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的澄清/結(jié)合裝置或應(yīng)用，其特征在于，所述裝置是單柱澄清/結(jié)合裝置，所述裝置中的柱包含 所述過(guò)濾器模塊，還包含靶標(biāo)結(jié)合材料，或者所述裝置是雙柱澄清/結(jié)合裝置，其中所述過(guò)濾器模塊是插入到所述結(jié)合柱中的附加柱的形式。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的澄清/結(jié)合裝置或應(yīng)用，其特征在于，所述過(guò)濾器模塊可從所述結(jié)合柱中除去。
9.一種用于澄清懸浮液的方法，所述懸浮液包含至少一種靶標(biāo)分子和固體顆粒、沉淀和/或絮凝物，其中所述懸浮液還任選地可以包含剪切敏感的分子，所述方法包括涉及如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所定義的過(guò)濾器模塊的過(guò)濾步驟，所述過(guò)濾器模塊用于從所述靶標(biāo)分子中將所述固體顆粒、沉淀和/或絮凝物分離，其中所述靶標(biāo)分子保留在溶液中。
10.如權(quán)利要求9所述的用于分離和/或純化核酸的方法，所述核酸作為靶標(biāo)分子，所述方法包括以下步驟: (i)將包含核酸的樣品懸浮液與如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所定義的過(guò)濾器模塊接觸 (ii)向所述樣品施加外力以使得所述樣品通過(guò)所述過(guò)濾器模塊。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，所述方法還包括以下步驟: (iii)將步驟(ii)的所述流通液與核酸結(jié)合材料接觸 (iv)任選地洗漆所述結(jié)合的核酸 (v)從所述結(jié)合材料中將所述核酸洗脫。
12.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述靶標(biāo)分子是質(zhì)粒DNA或RNA。
13.如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟(ii)中施加的外力是離心力或真空。
14.如權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過(guò)使用雙柱裝置將步驟(iii)中的所述流通液與核酸結(jié)合材料接觸。
15.一種用于進(jìn)行如權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)所述方法的試劑盒，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的過(guò)濾器模塊或澄清/結(jié)合裝置，并且任選地包含任意其他組分，所述組分選自:至少一種裂解緩沖液；至少一種RNA酶儲(chǔ)液；至少一種重懸緩沖液；至少一種中和緩沖液；至少 一種洗滌緩沖液；至少一種洗脫緩沖液；和/或進(jìn)行所述靶標(biāo)分離/純化方法的說(shuō)明書。
【文檔編號(hào)】B01D39/00GK103748208SQ201280031951
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月1日
【發(fā)明者】M·希辛格, K·舒爾特 申請(qǐng)人:恰根有限公司