專利名稱：用于改進(jìn)的生物測(cè)定法的使用電場(chǎng)的方法和設(shè)備的制作方法
用于改進(jìn)的生物測(cè)定法的使用電場(chǎng)的方法和設(shè)備發(fā)明人Mostafa Ronaghi, Tarun Khuarana, Juan G. Santiago相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2007年7月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第60/959，398號(hào)的優(yōu)先 權(quán)，將所述臨時(shí)申請(qǐng)通過引用整體并入本文。關(guān)于政府支持的聲明.
無。 涉及序列表、計(jì)算機(jī)程序或致密盤無。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及的領(lǐng)域是生物測(cè)定法和用于進(jìn)行這些測(cè)定法的設(shè)備，如微流裝置 (microfluidic device)，向所述裝置施加電場(chǎng)以控制帶電分子的移動(dòng)。所述測(cè)定法涉及帶 電的分子物質(zhì)(charged molecular species)，諸如核苷酸(由于磷酸根離子)、或因其離 子性質(zhì)而含有電荷的其它分子，如某些蛋白質(zhì)或小分子。相關(guān)領(lǐng)域硅的微加工(silicon microfabrication)方面取得的進(jìn)展已被應(yīng)用于生產(chǎn)多種 芯片上實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)所用的微通道和微陣列。優(yōu)勢(shì)包括低試劑消耗、小型化和快反應(yīng)速率。 然而，挑戰(zhàn)是有效地將生物樣品分離并存放到單獨(dú)的孔(well)中用于高通量分析。近來， 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了隨機(jī)陣列，其中使用固相支持體來單獨(dú)地捕獲獨(dú)特的生物學(xué)分子并將這些固相 支持體存放到具有相同尺寸范圍的幾何形狀的反應(yīng)孔(reaction wells with a geometry of the same size range)中。這些平臺(tái)所面臨的另一項(xiàng)挑戰(zhàn)是當(dāng)在孔內(nèi)分離的相同的珠 子上進(jìn)行重復(fù)測(cè)定時(shí)。常見這些挑戰(zhàn)的一個(gè)好例子是DNA測(cè)序。在某些DNA測(cè)序方法中，將DNA固定在固相支持體上，并將核苷酸和酶遞送至DNA 用于連續(xù)摻入核苷酸。這通常稱作使用通過合成進(jìn)行的測(cè)序的DNA測(cè)序。通過清洗將核苷 酸去除以允許核苷酸的重復(fù)添加。在通過合成進(jìn)行的測(cè)序中的主要挑戰(zhàn)之一是將核苷酸遞 送到DNA附近從而能夠快速并入以及有效去除核苷酸以提高閱讀長(zhǎng)度。具體專利和出版物Dressman^,"Transforming single DNA molecules into fluorescentmagnetic particles for detection and enumeration of genetic variations,，，Proc NatAcad Sci July 22，2003，vol. 100，no. 15，8817-8822 頁，公開了一種技術(shù)，其中將 DNA 分子集合 中的每個(gè)DNA分子轉(zhuǎn)化成單一的磁性顆粒，數(shù)千個(gè)拷貝的與原始DNA序列相同的DNA與所 述磁性顆粒結(jié)合。然后通過經(jīng)由流式細(xì)胞儀對(duì)熒光標(biāo)記的顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)能夠簡(jiǎn)單地評(píng)定原 始DNA分子群體內(nèi)的變異?；谶@種方法的四種主要要素(珠子、乳劑、擴(kuò)增和磁性)將其 稱作BEAM。在進(jìn)行PCR循環(huán)之后，用洗滌劑破壞微乳劑，再通過離心并將試管置于Dynal的MPC-S磁體上而將珠子從油相分離。Margulies 等，"Genome sequencing in micro fabricated high-density picolitrereactors, "Nature 437，376-380 (2005)公開了一種用于通過合成進(jìn)行測(cè)序的方 法和裝置，其使用光導(dǎo)纖維切片(fiber optic slide)的開孔。該方法使用設(shè)計(jì)成利用小 規(guī)?？椎膬?yōu)勢(shì)的改良型熱測(cè)序方案(modified pyrosequencingprotocol)。光導(dǎo)纖維切片 通過對(duì)光導(dǎo)纖維塊進(jìn)行切片來制造，光導(dǎo)纖維塊通過重復(fù)拉伸和融合光纖獲得。切片含有 大約160萬個(gè)孔，將所述切片裝載有珠子并裝配到設(shè)計(jì)在孔開口之上產(chǎn)生300-mm高的通道 的流式腔中，測(cè)序試劑流經(jīng)所述通道。未經(jīng)蝕刻的切片基底與另一光導(dǎo)纖維成像束在光學(xué) 上接觸，所述光導(dǎo)纖維成像束與電荷耦合器件(CCD)傳感器結(jié)合，允許捕獲從每個(gè)單獨(dú)的 孔底部發(fā)射出的光子。在標(biāo)準(zhǔn)2-ml試管中制備含有150萬顆珠子的800ml乳劑。將每種 乳劑等分至8個(gè)PCR管用于擴(kuò)增。PCR之后，破壞乳劑以釋放珠子，包括帶有經(jīng)擴(kuò)增、固定的 DNA模板的珠子和空珠子。通過離心使富集的攜帶模板的珠子沉積在開孔中。將用鏈霉抗生物素蛋白包覆的 SeraMag珠與退火至DNA捕獲珠上所固定的模板的生物素化富集引物結(jié)合。要點(diǎn)在于不要 渦旋振蕩珠子，因?yàn)闇u旋振蕩可能破壞SeraMag和DNA捕獲珠之間的連接。Erickson "Electrokinetically Based Approach for Single-Nuc1eotidePo1ymorphism Discrimination Using a Microfluidic Device，” Anal. Chem.，77 (13)，4000-4007，(2005)公開了一種用于單核苷酸多態(tài)性(SNP) 鑒別的動(dòng)電方法，其使用PDMS/基于玻璃的微流控芯片。該技術(shù)利用了施加外部電勢(shì)所提 供的在探針陣列中存在的耦合熱能(焦耳加熱(Joule heating))、剪切力(電滲)和電能 (電泳)的精確控制。其中描述了一種四端口裝置(four-port device)，對(duì)不同端口施加 有不同的電壓。Chen 等，"Nanopore sequencing of polynucleotides assisted by a rotatingelectric field,"Applied Physics Letters volume 82,number 8,2003年 2 月 24日1308-1310公開了一種通過旋轉(zhuǎn)電場(chǎng)輔助的、控制多核苷酸經(jīng)過毫微孔(nanopore)的 易位過程的方法。盡管所述工作基于模擬，但表明所述方法能夠通過在薄膜上加入兩對(duì)平 行電極而輕易地在毫微孔測(cè)序?qū)嶒?yàn)中實(shí)現(xiàn)。Erickson, D. ， Liu, X. ， Krull, D. ， Li, D. "An electrokinetical ly controlledDNA hybridization microfluidic chip enabling rapid target analysis, ” AnalyticalChemistry，2004，76，7269-7277 公開了一種裝置，其中對(duì)"H” 型流 動(dòng)通道的不同末端施以不同的電壓。論文還進(jìn)一步描述了芯片加工技術(shù)。Edman 等，‘‘Electric field directed nucleic acid hybridization onmicrochips，”Nucleic Acids Research, Vol 25，Issue 244907—4914 公開了一種基于 微芯片的核酸陣列，其中通過向所選測(cè)試位點(diǎn)下單獨(dú)的微電極選擇性施加直流正偏壓(DC positive bias)來進(jìn)行電尋址和/或雜交。這引起帶負(fù)電的核酸分子在微電子陣列上所 選位置上的快速轉(zhuǎn)運(yùn)和濃縮。然后可以將核酸(DNA、RNA、多核苷酸、寡核苷酸等)通過直 接附接到微電極上覆蓋的滲透層或通過與之前尋址并附接的核酸雜交來固定。這篇論文描 述了在實(shí)踐此處教導(dǎo)的方法時(shí)適用的緩沖條件等。Sosnowski,R. G. ,Tu,E. , Butler, ff. F.， 0' Connell, J. P. and Heller,M. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997，94，1119—1123 (在這篇
5論文中引用)證明受控電場(chǎng)可以用于調(diào)節(jié)單鏈和雙鏈寡核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、濃縮、雜交和變性。 具有大范圍變化的結(jié)合強(qiáng)度的寡核苷酸雜合體之間的辨別可以通過簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)電場(chǎng)強(qiáng)度來獲得。Horejsh 等，“A molecular beacon， bead-based assay for the detection ofnucleic acids by flow cytometry, Nucleic Acids Res.，2005，33 (2) :el3 公幵了另夕卜 一種使用珠子的測(cè)定形式。在這種情況下，使用微球綴合型分子信標(biāo)(molecular beacon) 的流體陣列系統(tǒng)使用流式細(xì)胞儀對(duì)溶液中未標(biāo)記核酸的進(jìn)行特異性、多路檢測(cè)。對(duì)于這種 測(cè)定系統(tǒng)，使用生物素-鏈霉抗生物素蛋白連接將分子信標(biāo)與微球綴合。Nikiforov 在 2001 年 9 月 11 日授權(quán)的題目為"Assay methods and system，” 的US 6，287，774公開了一種測(cè)定系統(tǒng)，其包含排列在主體結(jié)構(gòu)中的第一通道。所述第一 通道與包含具有熒光標(biāo)記的第一試劑的第一試劑混合物來源、與第一試劑反應(yīng)以產(chǎn)生與第 一試劑具有實(shí)質(zhì)上不同的電荷的熒光標(biāo)記產(chǎn)物的第二試劑來源、和聚離子的來源以流體方 式連接(fluidly connected)。該系統(tǒng)還包括用于將第一試劑、第二試劑和聚離子引入第 一通道的材料轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，和與第一通道以傳感通信的方式布置的(cbposited in sensory communication)檢測(cè)器。將檢測(cè)器配置成檢測(cè)在檢測(cè)區(qū)域中的試劑的熒光極化水平。如上述專利中所引用的，受控動(dòng)電轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在Ramsey的美國(guó)專利No. 5，858，195 中有詳細(xì)描述。這類動(dòng)電材料轉(zhuǎn)運(yùn)和定向系統(tǒng)包括依賴于在施加于所述結(jié)構(gòu)的電場(chǎng)內(nèi)帶電 物質(zhì)(charged species)的電泳遷移率的那些系統(tǒng)。這些系統(tǒng)更具體地被稱作電泳材料轉(zhuǎn) 運(yùn)系統(tǒng)。其它動(dòng)電材料定向和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)依賴通道或腔結(jié)構(gòu)內(nèi)流體和材料的電滲流，其產(chǎn)生 自跨越這些結(jié)構(gòu)施加的電場(chǎng)。簡(jiǎn)言之，在將流體置于通道中時(shí)，所述通道具有承載帶電官能 團(tuán)(例如在蝕刻玻璃通道或玻璃微毛細(xì)管中的羥基)的表面，那些基團(tuán)能夠電離。在羥基 官能團(tuán)的情況下，這種電離，例如，在中性PH下，導(dǎo)致質(zhì)子從所述表面釋放并進(jìn)入流體，在 接近流體/表面界面處產(chǎn)生某種質(zhì)子濃度，或在通道中的大量流體(bulk fluid)周圍產(chǎn)生 正電層(positively charged sheath) 0沿通道長(zhǎng)度施加電壓梯度將導(dǎo)致質(zhì)子層沿著電壓 下降的方向移動(dòng)，即，朝負(fù)極移動(dòng)。2004年5月 11 日授權(quán)的Fritsch等人的題目為“Microfluidics and smallvolume mixing based on redox magnetohydrodynamics methods,，，的US6, 733，244公開了一禾中裝 置，其中將利用磁流體動(dòng)力學(xué)的微流通道用于泵送(pump)非常小體積的溶液。所述通道沿 通道壁具有電極，且溶液內(nèi)攜帶電流的物質(zhì)帶著電流通過溶液。通過使用攜帶電流的物質(zhì) 生成的電場(chǎng)與施加于通道的磁場(chǎng)垂直。將這兩個(gè)場(chǎng)垂直于期望的流動(dòng)方向施加。電場(chǎng)和磁 場(chǎng)的組合致使溶液垂直于兩個(gè)場(chǎng)流過通道。應(yīng)該注意，本裝置提供一個(gè)電場(chǎng)，其能夠使帶電粒子(分子)移動(dòng)經(jīng)過溶液。所述 場(chǎng)不移動(dòng)溶液本身。另外，所述場(chǎng)不需要是電磁場(chǎng)，也不依賴鐵磁原理引起移動(dòng)。即，此處 的場(chǎng)不是簡(jiǎn)單地用磁鐵吸引珠子。這不會(huì)引起此處所述的離子移動(dòng)。發(fā)明概述以下概述不意在包括本發(fā)明的全部特性和方面，也不暗指本發(fā)明必需包括此概述 中討論的全部特性和方面。本發(fā)明涉及電場(chǎng)(“e場(chǎng)”)用于有效地將帶電物質(zhì)，如珠子、分子(ATP、酶)、DNA 等，沉積到固定的反應(yīng)物之上或附近的用途。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)電場(chǎng)能夠?qū)⒌孜锖兔笣饪s到DNA分子附近并有效地去除核苷酸。在一個(gè)設(shè)計(jì)用于進(jìn)行熱測(cè)序的微流裝置的實(shí)施方案中實(shí)施了 這種技術(shù)。所述裝置被設(shè)計(jì)為可提高從光發(fā)生反應(yīng)中獲得的信號(hào)的整體質(zhì)量并改進(jìn)閱讀長(zhǎng) 度。具體而言，我們證明，可以將核苷酸集中于單鏈DNA的珠子的附近或?qū)⑺鼈儚暮瑔捂?DNA的珠子移開，來提高核苷酸的摻入或清洗。該技術(shù)可一般地應(yīng)用于任何為了高通量分析 而需要集中于靶位點(diǎn)或從靶位點(diǎn)移去的帶電物質(zhì)。這種技術(shù)使用一種帶有直流偏壓的交流 電場(chǎng)以吸引/排斥核苷酸(帶電分子)。改變直流偏壓的極性導(dǎo)致核苷酸濃縮到含DNA珠 的孔中或從含DNA珠的孔中去除核苷酸。所述偏壓通常在約IV以上，但可以高至由介電擊 穿強(qiáng)度限定的最大電壓，其可以是 15-20V或更高。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含一種裝置，其具有至少一個(gè)流體通道和被界定為 與所述流體通道相通的反應(yīng)區(qū)。所述反應(yīng)區(qū)可以是孔、腔、管或其它物理區(qū)域。反應(yīng)區(qū)包含 到流體通道的朝向或開口，還包含偏離(offset from)流體通道的底部，所述裝置被構(gòu)建成 使流體沿著橫穿(transverse to)反應(yīng)區(qū)開口的方向流動(dòng)，其包含(a)與底部相鄰的第一 電極；(b)與開口相鄰的第二電極；和(c)在第一和第二電極之間的可控電壓源，其可以被 控制以向給定的電極提供交變的正電荷和負(fù)電荷、和直流偏壓，由此通過電極之間的電場(chǎng) 弓丨導(dǎo)流體通道中流體中的帶電物質(zhì)進(jìn)入或退出反應(yīng)區(qū)。 由于所述裝置可以在測(cè)序或其它注重反應(yīng)檢測(cè)的反應(yīng)中使用，所以所述裝置可以 進(jìn)一步包含與反應(yīng)區(qū)耦合的反應(yīng)傳感器用于檢測(cè)反應(yīng)區(qū)中的反應(yīng)。這可以是光電倍增管、 CCD或其它裝置。可以使用光纖進(jìn)行改進(jìn)的檢測(cè)。在反應(yīng)傳感器包含光導(dǎo)纖維面板的情 況下，可以自與面板單獨(dú)耦合的每個(gè)反應(yīng)孔獲得改進(jìn)的靈敏度和特異性。反應(yīng)傳感器包含 CMOS光敏元件用于檢測(cè)低水平的光，并進(jìn)一步用于定量這種水平。所述裝置可以進(jìn)一步描述為包含含有珠子的工作流體的微流裝置，其中反應(yīng)區(qū)是 大小僅可容納一顆珠子(sized to contain only one bead)的孔。在微流裝置中，反應(yīng)區(qū) 可以在選自光致抗蝕劑和PDMS的惰性固體聚合物中界定。如果珠子是帶負(fù)電的，則此處的 移動(dòng)(the present movements)被易化。這些珠子可以是例如聚苯乙烯。珠子也可以是磁 性的。在某些實(shí)施方案中，與底部相鄰的電極是IT0(氧化錫銦)薄層，厚度小于約 150nm。這種電極將是透光的，以便通過反應(yīng)傳感器對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。電極優(yōu)選包含介電涂層(dielectric coating)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣可防止腐蝕并增加 電場(chǎng)。介電涂層可以是例如一種或多種Parylene 聚-對(duì)二甲苯，或氧化硅，或氮化硅。所述裝置可以配置成適合于與另外的電子裝置連接并包含合適的流體通道和電 極的一次性裝置(disposable device)，例如，用于引導(dǎo)帶電粒子在液體中移動(dòng)的裝置，其 中將所述粒子引導(dǎo)入反應(yīng)區(qū)，其包含(a)處于反應(yīng)區(qū)中液體的一側(cè)的包覆有介電材料的 第一電極；(b)處于反應(yīng)區(qū)中所述液體的相對(duì)側(cè)的包覆有介電材料的第二電極；(c)橫穿 (transverse to)反應(yīng)區(qū)的流體流動(dòng)通道；和(d)用于信號(hào)發(fā)生器的連接，所述信號(hào)發(fā)生器 用于向第一電極和第二電極施加交流電壓和直流電壓，由此電極被構(gòu)建并排列從而在它們 之間產(chǎn)生電場(chǎng)。本發(fā)明還包括用于在微流裝置中如上所述移動(dòng)帶電分子物質(zhì)的方法，其中所述 分子物質(zhì)從與反應(yīng)區(qū)相通的流體通道移動(dòng)進(jìn)入反應(yīng)區(qū)，所述方法包括步驟(a)使帶電分 子物質(zhì)在流體通道中沿流動(dòng)方向流動(dòng)；(b)提供具有跨越反應(yīng)區(qū)的陽極端和陰極端的電場(chǎng)(an electric field having a positive end and anegative end across the reaction area)；和(c)通過向反應(yīng)區(qū)中的電場(chǎng)施加與分子物質(zhì)上的電荷相反的電荷(applying a charge to the electric field in the reactionarea opposite to the charge on the molecular species)來引導(dǎo)帶電分子物質(zhì)進(jìn)入反應(yīng)區(qū)。在這種實(shí)施方案的一個(gè)方面中，使 超過一種分子物質(zhì)移入反應(yīng)區(qū)，由此引起分子物質(zhì)之間的反應(yīng)。在另一方面，一種或多種 分子物質(zhì)已在反應(yīng)區(qū)中，導(dǎo)致帶電分子物質(zhì)和反應(yīng)區(qū)中所述一種或多種分子物質(zhì)之間的反 應(yīng)。所述電場(chǎng)含有頻率為至少100kHz的交流部分(component)，還優(yōu)選包含直流偏壓，其至 少可以是1伏特，但通常不是高壓。所述方法可以進(jìn)一步包括反相(reverse)直流偏壓的 極性的步驟，以引導(dǎo)帶電分子物質(zhì)退出反應(yīng)區(qū)。附圖簡(jiǎn)述

圖1是根據(jù)本發(fā)明的裝置的示意圖，其顯示了一個(gè)帶有微加工的孔和IT0電極的 光導(dǎo)纖維面板。通過施加跨越這些電極的電勢(shì)差能夠引導(dǎo)帶負(fù)電的核苷酸朝向DNA珠；圖2A和2B是用于在DNA珠(或其它靶位點(diǎn))附近集中或自其移開核苷酸(或其 它帶電分子)的設(shè)置的示意圖，其中圖2B中顯示的是一種備選的電極排列；圖3A和3B是顯示在50iim孔內(nèi)電場(chǎng)輔助誘捕(electric assisted trapping) lym珠子的照片。在圖片中顯示的4個(gè)電極中，關(guān)閉電壓(3A)，然后在2個(gè)電極 處施加電壓(3B)，而在這些位點(diǎn)觀察到粒子的堆疊(stacking)。圖4A和4B是用于顯示電場(chǎng)中的熒光染料濃度的實(shí)驗(yàn)裝置的示意圖(4A為透視 圖，4B為側(cè)視圖)；圖5A和5B是顯示未被集中的熒光染料(5A)和通過電場(chǎng)被集中的熒光染料(5B) 的照片；和圖6是顯示因電場(chǎng)導(dǎo)致的增加的化學(xué)發(fā)光的圖片，其使反應(yīng)區(qū)中產(chǎn)生光的酶 (light generating enzyme)附近的焦磷酸增加。優(yōu)選實(shí)施方案詳述定義除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)那些普 通技術(shù)人員所通常理解的具有相同含義。盡管與本文所述那些相似或等效的任何方法和材 料能夠用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，但將對(duì)優(yōu)選的方法和材料進(jìn)行描述。概括而言，如本文使用 的、在與生物化學(xué)和生物物理學(xué)相關(guān)的情況下應(yīng)用的命名法是本領(lǐng)域公知且常用的那些。 某些未具體限定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)大體上依據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法并如本說明書通篇所引用 和討論的概括的和更具體的參考文獻(xiàn)中所述來進(jìn)行。出于清楚的目的，下文對(duì)以下術(shù)語進(jìn) 行定義。術(shù)語“微流裝置”按常規(guī)含義使用，將其理解為所述裝置優(yōu)選用于并有利于小反應(yīng) 體積和液體流速。概括而言，反應(yīng)孔應(yīng)不大于lOOnL，并且可以小達(dá)lpL。在下文描述的一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，它們的直徑是35 u m。所述裝置將包括液體流動(dòng)通道使緩沖液和反應(yīng) 物流入反應(yīng)孔。反應(yīng)孔可具有可容納單顆帶電珠子的大小。反應(yīng)孔通常是任何如下所述的 界定的空間，反應(yīng)物被聚攏在其中，并且其位于流體通道的直接流動(dòng)之外(located out of the directflow of the fluid channel)，除非裝置被配置成借助下述方式引導(dǎo)反應(yīng)物進(jìn) 入反應(yīng)區(qū)或者退出反應(yīng)區(qū)對(duì)電極充電而提供場(chǎng)，該場(chǎng)吸引帶電物質(zhì)進(jìn)入孔中或?qū)щ娢镔|(zhì)排斥到孔外。術(shù)語“橫穿”(transverse)按照常規(guī)含義用于表示交叉的(crosswise)，優(yōu)選為但 不必需為正交(perpendicular)。術(shù)語“電場(chǎng)”用于意指因空間體積中或圍繞空間體積的介質(zhì)中電荷(如電子、離子 或質(zhì)子)的存在而產(chǎn)生的作用?；诏B加，每個(gè)電荷分布在一個(gè)點(diǎn)處對(duì)整個(gè)場(chǎng)起貢獻(xiàn)。置 于空間體積中或在周圍介質(zhì)中的電荷具有施加于其上的力。電場(chǎng)通過電壓的差產(chǎn)生電壓 越高，產(chǎn)生的場(chǎng)將越強(qiáng)。相反，磁場(chǎng)在電流流動(dòng)時(shí)產(chǎn)生電流越大，磁場(chǎng)越強(qiáng)。電場(chǎng)即使在沒 有電流流動(dòng)時(shí)也存在。電場(chǎng)以伏特每米度量(V/m)。為了在方便的時(shí)限內(nèi)，在本方法和裝置 中引起帶電離子的移動(dòng)，電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)為大約5V/cm或更高，高至焦耳加熱的可實(shí)行限值和 介電擊穿限值，最大上限值為大約lOOOV/cm。作為高強(qiáng)度電場(chǎng)的實(shí)例，注意到作為偶極的水可以通過電場(chǎng)進(jìn)行部分排列，并且 這可以通過用靜電源使水流移動(dòng)來容易地顯示。非常高的場(chǎng)強(qiáng)(5xl09V m—1)使冰中的水重 新定向，從而抑制結(jié)冰。通用方法和設(shè)備下文描述的是用于由電場(chǎng)引導(dǎo)的帶電分子的集中(concentration)和清洗 (washing)的設(shè)備和方法。先前的電泳集中技術(shù)依賴于法拉第電流將帶電物質(zhì)集中在電極部位。這通常導(dǎo)致 在電極處發(fā)生的電解反應(yīng)和電解產(chǎn)物(如氧和氫)的生成。本方法使用通過電極的電容耦 合的位移場(chǎng)而非通過電極的法拉第電流。本文使用的電場(chǎng)基于公認(rèn)的電容原理。在將不同電荷的兩個(gè)平板置于彼此附近 時(shí)，如在平行的平板電容器中，平板之間的兩個(gè)E場(chǎng)加成而平板之外的E場(chǎng)抵消。當(dāng)平板彼 此靠近形成電容器時(shí)，在整個(gè)電容器內(nèi)部平板之間的E場(chǎng)是恒定的，只要E場(chǎng)不是靠近平板 邊緣。由于電場(chǎng)是電勢(shì)梯度的負(fù)數(shù)，且E場(chǎng)在電容器內(nèi)部是恒定的，所以電場(chǎng)的強(qiáng)度E與平 板之間的電壓V和它們的間隔d的關(guān)系非常簡(jiǎn)單。 E 式 1通過將薄絕緣材料(電介質(zhì))置于平板之間，可以使間隔d減小，由此增加電容器 的電容并防止平板接觸。

施加在電極處的電壓。因此，由于雙電層的屏蔽，跨越電極的直流電壓在通道主體中不產(chǎn)生
位移電流是與變化的電場(chǎng)相關(guān)的量。其發(fā)生在介電材料中，也發(fā)生在自由空間中。 位移電流在數(shù)學(xué)上定義為電位移場(chǎng)D(已知物理術(shù)語，也稱為電場(chǎng)/通量密度)的
式2
其中D= ￡E，其中介電常數(shù)￡ = ^、，并且其中 、是電介質(zhì)的相對(duì)介電常數(shù)，而 e Q是自由空間的介電常數(shù)(8. 854E-12FIH-1)。
在本裝置中，響應(yīng)于所施加的跨越電極的直流電壓，在電極處產(chǎn)生雙電層，其屏蔽電場(chǎng)，并且需要法拉第電流以實(shí)現(xiàn)集中。然而，如果以比離子形成雙層所用時(shí)間更快的時(shí)程 切換跨越電極的電壓，那么屏蔽作用變得可以忽略，電場(chǎng)在跨越整個(gè)通道的寬度上都存在。 對(duì)于一種典型情況10mM離子強(qiáng)度電解質(zhì)、lOnm的厚電雙層，且電極之間間隙為 100 y m， 需要的交流頻率是 100kHz。本方法使用交變場(chǎng)，其以 500kHz或更高的頻率變化，并帶 有凈直流偏壓以實(shí)現(xiàn)跨越電極沒有任何法拉第電流的凈電場(chǎng)。如果單獨(dú)施加橫跨流體流動(dòng)通道的直流電壓，則通道的一個(gè)表面附近的電壓將被 距離通道壁約lOnm內(nèi)的雙電層所屏蔽。因此在通道的全部剩余寬度上(距離該壁超過 lOnm)，電場(chǎng)大部分將為零。如果只施加交流電壓——它的切換比離子響應(yīng)時(shí)間( 0. lms) 更快——?jiǎng)t該電場(chǎng)的作用將同等地施加在整個(gè)通道中。然而，平均電場(chǎng)仍將為零。在既有直 流又有交流電壓(both DAand AC voltage)的情況下，在整個(gè)通道上存在時(shí)均直流場(chǎng)(time averaged DCf ield)，從而產(chǎn)生一個(gè)力E，其在通道一側(cè)較高，而隨著與該側(cè)的距離增加而下 降。作為進(jìn)一步的闡釋，可以說(不希望受到任何理論的限制)本方法和裝置采用了 一種特定類型的動(dòng)電作用(electrokinesis)。動(dòng)電作用是指由電場(chǎng)作用于電解質(zhì)溶液中 帶電物體周圍的可移動(dòng)離子所引起的一類現(xiàn)象。當(dāng)具有給定的表面電荷的物體浸入含離 子的溶液中時(shí)，形成一種彌散的離子云而遮蔽物體的表面電荷。這種由與浸入的物體伴隨 的由(固定)電荷構(gòu)成的遮蔽云以及溶液中的一層(移動(dòng)的)反荷離子構(gòu)成的排列，稱作 “雙層”。在這個(gè)小而厚度有限的區(qū)域中，流體不是電中性的。因此，作用于該區(qū)域的電場(chǎng)將 激發(fā)彌散層的離子的運(yùn)動(dòng)，而這些離子將繼而帶走(entrain)周圍的流體。產(chǎn)生的流場(chǎng)反 映了流體中離子電流的空間分布。電滲是動(dòng)電現(xiàn)象最簡(jiǎn)單的例子。其發(fā)生在平行于呈現(xiàn)固 定表面電荷的樣品容器或電極表面施加電場(chǎng)時(shí)，如在氧化硅電極的情況下(在中性PH范圍 內(nèi))。當(dāng)電極雙層中的反荷離子被電場(chǎng)加速時(shí)，它們拖動(dòng)溶劑分子并引發(fā)(set up)主體流 體流動(dòng)。這種作用在窄毛細(xì)管中非常顯著，可以有利地用于設(shè)計(jì)流體泵送系統(tǒng)。電泳是一種相近的現(xiàn)象，其是指的浸入電解液的帶電粒子在場(chǎng)誘導(dǎo)下的遷移。與 電滲一樣，電場(chǎng)加速粒子雙層中的運(yùn)動(dòng)離子(mobile ions) 0如果與之前的情況相反，粒子 本身是運(yùn)動(dòng)的，那么其將會(huì)通過反方向移動(dòng)來抵消這種場(chǎng)誘導(dǎo)的離子運(yùn)動(dòng)(和產(chǎn)生的離子 電流)。電泳通常在凝膠或具有牢固網(wǎng)孔(solid mesh)的介質(zhì)中進(jìn)行，所述凝膠或介質(zhì)將 基于某種因素(例如，大小)來阻礙離子粒子。如下文所述，本文預(yù)期粒子將處于液態(tài)流體 中而沒有阻礙性的凝膠或固相存在。現(xiàn)在參考圖1，其中示出了具有孔100的微流裝置，孔100限至在SU-8光致抗蝕劑 層110內(nèi)，該裝置還包括電極112，其間隔地位于層110上方(spaced above layer 110)并 在各孔間延伸，從而在電極112和光致抗蝕劑層110之間界定出流體流動(dòng)通道(如116所 示)，電極112與各孔相通。流體通道的深度優(yōu)選為100 u m的量級(jí)，這是由于本裝置特別適 合于10yL的體積。層110為成孔(well-forming)層(即，一種圖樣化以界定反應(yīng)區(qū)的至 少一部分以及流體流動(dòng)通道的層)。該層由光致抗蝕劑界定以方便在亞微米尺度進(jìn)行制造。 優(yōu)選的是在孔中實(shí)現(xiàn)高的長(zhǎng)寬比(例如，d/w> 5 1)。換句話說，反應(yīng)區(qū)或孔(因蝕刻) 偏移(offset from)通道一定深度，并且是具有一定(相對(duì)窄的)寬度或直徑的空腔。珠 子可以流經(jīng)流體流動(dòng)通道并流入各孔中。第二電極114位于成孔層110下方，其界定了孔 的底部。在孔已經(jīng)(以蝕刻或模制方式)形成于層中的情況下，電極暴露于孔中的流體和物質(zhì)，其中流體與物質(zhì)是在所示箭頭116處進(jìn)入裝置的。電極112和114優(yōu)選由IT0(氧化 銦錫)形成約lOOnm厚。如圖1進(jìn)一步所示，這些電極形成了基本上平行的片層(sheets)， 其間夾有所述流體通道和孔。值得注意的是，由氧化硅或Parylene或氮化硅構(gòu)成的 lOOnm厚的介電層被涂施 于電極，例如涂施于IT0層之上，如圖2 (204和206)所示。進(jìn)一步如圖1和圖2A和B所示， 電源118(圖1)連接各電極并充電，使得，就如下文中詳述的那樣，頂部電極112為負(fù)極，底 部電極114(在孔的底部)為正極，以便驅(qū)使粒子(原子、分子、珠子，等)進(jìn)入各孔中。在 這里使用術(shù)語“頂部”和“底部”是為了方便起見，裝置可以根據(jù)重力或使用時(shí)的取向以各 種方位配置。再次參考圖1，頂部電極112被涂施于基底120上，基底120由例如硼硅酸鹽玻 璃或石英制成，頂部電極112借助任何蝕刻或切削加工結(jié)構(gòu)(如光致抗蝕劑層中的臺(tái)階 (step)),間隔地位于成孔層110上方。在一個(gè)示例性方法中，含有連接在表面并向外延伸的DNA分子的珠子122，如圖所 示，裝在孔100中(每孔一個(gè)珠子)。寡核苷酸是以本領(lǐng)域已知的方式連接于珠子的(參見 相關(guān)專利和出版物)。這些珠子已經(jīng)藉由流體流動(dòng)116被傳送至孔區(qū)域，并在電場(chǎng)(經(jīng)孔 上方和下方的電極112和114實(shí)現(xiàn))或磁體的幫助下進(jìn)入各孔中。施加電場(chǎng)來驅(qū)使帶負(fù)電 荷的分子(如124處所示)移向珠子并進(jìn)入各孔中。這些分子可以是核苷酸、酶或其他帶 電的種類。這些分子在合適的緩沖液中傳送，并引起與珠子上的DNA鏈的可探測(cè)到的反應(yīng)。 優(yōu)選用低濃度( 10mM)的Tris-乙酸鹽(Tris_Acetate)或Tris HC1作為緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方式中，帶電的分子是核苷酸，它們被摻入多核苷酸，并在反應(yīng)區(qū)生成 無機(jī)含磷物質(zhì)(inorganic phosphorous)，后者被用來生成可探測(cè)到的光信號(hào)(如焦磷酸 測(cè)序(pyrosequencing))。相應(yīng)地，光導(dǎo)纖維面板126貼附到薄的透明電極114上，該電極， 帶有任何介電涂層，形成了反應(yīng)區(qū)的底部。電極對(duì)于要收集的光而言是透明的。光導(dǎo)纖維 面板126可以來自市購來源，如來自Schott North America, Inc。光導(dǎo)纖維面板由一束 平行排列并垂直于孔100底部表面的融合纖維構(gòu)成。以這種方式，光高效地從每個(gè)單獨(dú)的 孔100傳播至光傳感器，如耦合至光導(dǎo)纖維面板、在每個(gè)孔下面帶有傳感區(qū)的CMOS傳感器 128。眾所周知，CMOS (表示互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體)成像器包括光敏二極管的陣列，每個(gè)像 素內(nèi)一個(gè)二極管。但是與CCD不同的是，CMOS成像器中的每個(gè)像素具有自己?jiǎn)为?dú)的集成在 內(nèi)部的放大器。由于每個(gè)像素具有其自己的放大器，所以這種像素稱為“有源像素(active pixel) ”。CMOS探測(cè)器128中的陰影區(qū)對(duì)準(zhǔn)各單個(gè)孔，并從該孔接收最多的光，也只從該孔 接收光。每個(gè)孔都與一個(gè)單獨(dú)的CMOS探測(cè)器元件耦合。構(gòu)建裝置，使各孔100與CMOS傳感器像素幾乎完美對(duì)準(zhǔn)，是為了利用CMOS像素的 全部容量(capacity)和實(shí)現(xiàn)最佳可能的覆蓋(coverage)，這對(duì)改進(jìn)系統(tǒng)的通量來說是必 要的。然而，這不能用使面板中的纖維與像素對(duì)準(zhǔn)來實(shí)現(xiàn)，這是因?yàn)樵诳色@得的纖維面板中 的圖樣中存在不規(guī)則處(irregularities)。避免直接對(duì)齊的最便利的方法是使用光導(dǎo)纖 維，其尺寸遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于各孔和CMOS像素。使用這種面板防止面板與像素和各孔的對(duì)齊問題 的發(fā)生。但是像素和孔確實(shí)必須是對(duì)準(zhǔn)的。這可以通過固定圖像傳感器的位置和在X和Y 方向上使用兩個(gè)微米調(diào)節(jié)器得到含孔的微流平臺(tái)的完美對(duì)齊而容易實(shí)現(xiàn)。這種方法可以通 過手動(dòng)或通過更復(fù)雜的步進(jìn)電機(jī)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。每次運(yùn)行前，在存在ATP或PPi測(cè)定的校準(zhǔn)量時(shí)，用來探測(cè)完美對(duì)準(zhǔn)的校準(zhǔn)度量可以設(shè)為穿過整個(gè)圖像傳感器區(qū)的總共的光載流子量 (amount ofcollective photocharge)。如果沒有良好對(duì)齊的話，光信號(hào)就會(huì)在各個(gè)CMOS 像素之間的區(qū)域上有損失，但是隨著對(duì)齊越來越好，損失的光子通量也會(huì)減少。最大光強(qiáng)度 指示完美的對(duì)齊。微流板和CMOS傳感器板的自動(dòng)調(diào)節(jié)可以通過應(yīng)用壓電調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。在 這種技術(shù)中，微流板保持器將配備有單個(gè)或多個(gè)壓電致動(dòng)器。一旦將板插入保持器中，來自 CMOS輸出的反饋就能激活壓電致動(dòng)器以每次將板移動(dòng)至單個(gè)位置上。發(fā)明人的計(jì)算表明 2N的力應(yīng)足夠移動(dòng)板使其對(duì)準(zhǔn)。能產(chǎn)生該力的壓電調(diào)節(jié)器可以市購得到。這還已經(jīng)表明為 Pm級(jí)內(nèi)的對(duì)齊可以使用這種技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。就光效率而言，孔的最好位置會(huì)是離面板盡可能 近的位置。因此，經(jīng)由沉積和將一層SU-8圖樣化在面板頂部，本文的孔正好構(gòu)造在面板的 頂部?；诎l(fā)明人的模擬，通過這種直接耦合可以將光效率從1.6%顯著提高到大于90%。圖2A為進(jìn)一步顯示本發(fā)明裝置和技術(shù)的示意圖。在這個(gè)實(shí)施方式中，將氧化銦 錫(IT0)電極材料( 150nm厚)涂施(112和114，如圖1所示)在標(biāo)準(zhǔn)玻璃片200、202 上，以便在通道中施加橫穿流動(dòng)方向的電場(chǎng)。透明的IT0電極進(jìn)一步涂覆有介電薄層204、 206 ( 20nm)，如Parylene或氧化硅或氮化硅(如圖2中的圖樣所示)，以防止由于電解造 成的電極腐蝕的發(fā)生和促進(jìn)(facilitate)電位移場(chǎng)。這樣，流體通道具有一個(gè)涂覆有介電 層的表面(其與流體接觸)和帶有電極部分的相對(duì)表面，其中所述電極部分也涂覆有介電 層。Parylene —個(gè)統(tǒng)稱，適用于未取代的和取代的種類。Parylene N和SCSParylene HT具 有特別高的介電強(qiáng)度和不依賴于頻率的介電常數(shù)，可能是優(yōu)選的。關(guān)于介電材料的進(jìn)一步 描述參見 US 4163828，Mahoney，1979 年 8 月 7 日授權(quán)，標(biāo)題為“Parylene stabilization，，。在圖2B中示出了電極排列的一個(gè)變化方案。在這個(gè)實(shí)施方式中，如圖2A中所示的 位于202處的玻璃層適于CMOS制造工藝，在該工藝中CMOS傳感器正好置于孔的下面和透 明層117的下方?？纂姌O優(yōu)選涂覆有介電層(未示出)，但是由一組布線115、115a中的一 個(gè)或兩個(gè)形成，或者由成孔層下方的、沿著孔一側(cè)的、位于底部部分的電極條119形成。在 俯視圖中，布線和電極會(huì)是柵格的形式，在每個(gè)孔的底部部分的周圍靠近傳感器處形成正 方形。這使得在CMOS傳感器像素尺寸的量級(jí)上制造各孔成為可能。例如，如果每個(gè)孔(像 素)為一個(gè)20 y M的正方形，可以用布線直徑約為1 P m的單根或雙根布線來形成柵格，并 產(chǎn)生脈沖以提供AC和DC電荷(charge)。布線鄰接孔的底部排布。電極也置于孔的側(cè)壁 內(nèi)，部分地延伸到孔的底部，如圖115和115a處所示。同樣地，如果認(rèn)為“像素”是孔底部 的一部分，其中孔與傳感器光學(xué)接觸，則像素的四條邊被電極所界定，在此處電極為一組金 屬條，每個(gè)金屬條大部分在孔的側(cè)壁內(nèi)，但是稍許延伸至孔的底部。這些金屬布線115和金 屬條119連接至電源，并以如上所述的方式工作。含有流動(dòng)通道及用于DNA珠子的各孔的流動(dòng)結(jié)構(gòu)形成在SU-8 ( 200 y m厚)中。 PDMS/硅橡膠墊片(gasket)也可用來產(chǎn)生流動(dòng)通道。IT0-介電層涂覆的玻璃片形成流動(dòng) 通道的頂部和底部。如圖1中所述，珠子122位于含有帶電粒子124的流體介質(zhì)中的孔中， 電源連接電極從而引起了粒子朝向或背離孔和孔中的珠子122移動(dòng)，珠子具有貼附其上的 反應(yīng)物，如與核苷酸124反應(yīng)的寡聚核苷酸。常規(guī)的光刻技術(shù)可以用于SU-8圖樣化。這種制造SU-8的方法已經(jīng)經(jīng)過測(cè)試并在 Stanford納米器件加工裝置上得到驗(yàn)證。SU-8加工能用來制造長(zhǎng)寬比(aspect ratio)大 的孔，這對(duì)減少相鄰珠子之間的化學(xué)串?dāng)_而言是很關(guān)鍵的。即，反應(yīng)區(qū)應(yīng)當(dāng)完全容納珠子。
在給出上述描述本發(fā)明裝置優(yōu)選實(shí)施方式的條件下，很明顯各種備選構(gòu)造都是可 能的。盡管沒有示出，但是可以想到在一個(gè)實(shí)施方式中，每個(gè)孔都可耦合到單獨(dú)受控的電極 對(duì)上，在同一時(shí)間，不同的孔可處于帶電物質(zhì)受到吸引或排斥的不同狀態(tài)。電極可以由各種透明的導(dǎo)電層制成，例如金屬氧化物如氧化銦錫(IT0)、銻摻雜的 氧化錫和錫酸鎘(氧化鎘錫)，其中每種都常用作光電裝置(如液晶顯示器)中的透明電 極。出于光學(xué)探測(cè)的目的，電極是透明的。在以熱或電方式測(cè)量反應(yīng)的裝置中，電極無需為 透明的。例如，裝置可用于電探測(cè)結(jié)合反應(yīng)。參見US 5，284，748,Mroczkowski等人，1994年 2 8 H , feU^J"Method for electrical detection of a binding reaction，，。#$;fe貞 測(cè)定法可以通過用電活性物質(zhì)標(biāo)記一種免疫反應(yīng)物來進(jìn)行。Pace，美國(guó)專利號(hào)4，233，144， 1980年11月11日授權(quán)，解釋了一種這樣的技術(shù)。另一種方法涉及將抗原-抗體層夾在兩 個(gè)導(dǎo)電層之間并測(cè)量所得疊層的電容。6化撲吐，美國(guó)專利號(hào)4，054，646，1977年10月18 日授權(quán)，記載了這樣一種方法。電容測(cè)量系統(tǒng)的另一種類型包括一對(duì)電極，這對(duì)電極涂覆有 基底并浸入含有特別與基底結(jié)合的物質(zhì)的介質(zhì)中，正如Arwin，美國(guó)專利號(hào)4，072，576中所 描述的。成孔層可以由任何惰性材料形成。光刻技術(shù)可以用來將層圖樣化入一系列流體 通道和反應(yīng)區(qū)中，例如US 6，960，437，Enzelberger等人，2005年11月1日授權(quán)，標(biāo)題為 "Nucleic acid amplification utilizing microfluidicdevices，，中所記載的。如此文 中所述，微流裝置至少部分由彈性材料構(gòu)成，并且通過單層和多層軟刻蝕(MLSL))技術(shù)和 /或犧牲層包封方法構(gòu)成(參見，例如，Unger等人，(2000)，Science 288 :113_116和PCT 公開W001/01025)。利用這些方法，微流裝置可以如此設(shè)計(jì)其中流經(jīng)裝置的流動(dòng)通道的 溶液至少部分地利用一個(gè)或多個(gè)控制通道控制，該控制通道通過彈性膜或片段與流體通道 分隔開。更具體地來說，一些制造方法涉及通過用光致抗蝕劑的光刻技術(shù)初期制造硅晶片 上的用于頂部層(具有控制通道的彈性層)和底部層(具有流體通道的彈性層)的母模 (Shipley SJR 5740)。通道高度可以受到旋涂速率的精確控制。光致抗蝕劑通道通過將光 致抗蝕劑暴光于UV光并接著顯影而形成。熱回流工藝和保護(hù)處理如先前所述的那樣進(jìn)行 (M. A. Unger, H. -P. Chou, T. Throsen, A. Scherer 禾口 S. R. Quake, Science 288，113(2000))。光致抗蝕劑物質(zhì)可以旋涂或噴涂至基底如硅晶片上，或者作為膜或絲網(wǎng)應(yīng)用 至晶片上。市購的干燥膜狀光致抗蝕劑物質(zhì)包括丙烯酸基物質(zhì)，例如從Mitsui(日 本)以商品名Ordyl PR132購得的物質(zhì)；環(huán)氧基物質(zhì)，例如從E. I.DuPont de Nemours and Company Corporation (Wilmington, Del.)以商品名 RIST0N 購得的物質(zhì)，或者從 MicroChem Corporation (Newton, Mass.)以商品名 SU-8 購得的物質(zhì)，(或者例如 Lexmark International, Inc. (Lexington, Ky.)內(nèi)部使用的專利物質(zhì)，內(nèi)部稱為GSP920)；以及聚酰 亞胺基光致抗蝕劑物質(zhì)，例如從HD Microsystems (Pariin,NJ.)以商品名HD4000購得的物 質(zhì)。在將光致抗蝕劑物質(zhì)應(yīng)用至晶片基底的流體側(cè)上之后，通過掩膜使光致抗蝕劑 物質(zhì)曝光于光化輻射如紫外(UV)光以使光致抗蝕劑物質(zhì)圖樣化，以便在顯影光致抗蝕劑 物質(zhì)時(shí)提供流體通道在光致抗蝕劑物質(zhì)中的位置。然后，通過用顯影化學(xué)試劑將未固化 的物質(zhì)從晶片的流體通道/孔區(qū)域溶解，顯影得到圖樣化的光致抗蝕劑物質(zhì)。顯影化學(xué) 試劑可以選自四甲基氫氧化銨、二甲苯、脂肪烴、碳酸鈉和乙酸2-丁基乙氧乙酯(BCA)。
13進(jìn)一步細(xì)節(jié)參見US7，043，838，Smoot等人，2006年5月16日授權(quán)，標(biāo)題為“Process formanufacturing a micro-fluid ejection device，，。一種用于核苷酸預(yù)濃集(preconcentration) /清洗的通用測(cè)定規(guī)程如下所述1.首先以DNA珠子填充流動(dòng)通道。2.用IT0介電玻璃片從頂部密封流動(dòng)通道。3.接著用含核苷酸的溶液填充流動(dòng)通道。4.將IT0電極連接到高頻AC源，并且跨越通道施加高頻方波脈沖(V 5_7V，> 100kHz)。即，電源118向電極112、114提供AC場(chǎng)，電極114僅在孔底部是有效的。AC場(chǎng) 在2至20伏、優(yōu)選5至7伏范圍內(nèi)，并且頻率在約10kHz至約10MHz的范圍內(nèi)，優(yōu)選為大于 100kHz。高頻AC場(chǎng)消除了在電極_液體界面處形成的雙電層的作用。如果沒有AC場(chǎng)，雙 電層會(huì)屏蔽施加在電極間的DC電壓，這樣在通道內(nèi)部就不會(huì)有DC電場(chǎng)。5.將小DC電壓( 1. 5V)疊加在存在的AC電壓上，該DC電壓也來自電源118。 根據(jù)DC場(chǎng)的極性，核苷酸或者濃集在DNA珠子附近或者被各孔中的DNA珠子排開。本裝置可以用于廣泛多樣的測(cè)定法。優(yōu)選的測(cè)定法包括涉及核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)的那些。 這些測(cè)定法包括引物延伸/降解測(cè)定法在這種測(cè)定法中，通過將dATP結(jié)合到ssDNA中來檢測(cè)蛋白質(zhì)制備物中的末端轉(zhuǎn) 移酶活性。典型的流程包括將130nM TdTS或130nM TdTL在200nM 二甲胂酸鉀、25mM Tris-HCl, pH 6. 6、0. 25mg/ml BSA、4mMMgC12、4 ii M ZnS04、5 % 甘油、ImM dATP 和 20nM 5' -32P-標(biāo)記的(dA) 10引物中在35°C溫育。使用同一測(cè)定法在缺乏dATP的條件下查找蛋 白質(zhì)制備物中的3' 5'核酸外切酶活性。在第0、5、15、30和60分鐘取等分試樣，補(bǔ)充以甲 酰胺染料混合物，并在16%丙烯酰胺變性凝膠上進(jìn)行電泳。在將濕膠在Kodak膠片(Biomax MR)下于-70°C 曝光之后使產(chǎn)物顯像。參見 See Thejournal of Immunology, 2004,172 6764-6767. "Evidence That the Long MurineTerminal Deoxynucleotidyltransferase Isoform Plays No Role in the Control ofV(D)J Junctional Diversity. ”。DNA的克隆分析，或復(fù)用分析這種測(cè)定法使用具有多個(gè)反應(yīng)區(qū)的裝置，其中每個(gè)反應(yīng)區(qū)被設(shè)計(jì)成可容納一顆 且僅可容納一顆珠子的孔。使用本領(lǐng)域已知的方法使DNA分子附著在電中性的珠子上， 每顆珠子一種DNA?？梢杂糜谥樽拥闹行圆牧系膶?shí)例包括玻璃、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、 Sepharose⑧珠(交聯(lián)的多糖瓊脂糖，GEHealthcare的商標(biāo)權(quán))、瓊脂糖的其它形式、膠乳 等。此外，可以使用磁珠，如實(shí)施例3中所示例的。由于附著DNA或其它分子的過程是不完 全的，所以這將導(dǎo)致兩組珠子，一組帶有DNA，而一組沒有DNA。將兩組都放入流動(dòng)通道，并 向孔施加帶有直流偏壓的交流場(chǎng)。由于DNA帶負(fù)電，這將導(dǎo)致含DNA的珠子被捕獲在孔中， 而裸珠則流過，由此將它們洗去。這樣在裝置中產(chǎn)生DNA包覆珠子的富集群體。然后可以 使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)擴(kuò)增珠子上的DNA。DNA包覆的珠子可以是多種已知的珠子材料并 且直接與DNA (或RNA)的寡核苷酸或多核苷酸相連，然后這些DNA (或RNA)寡核苷酸或多 核苷酸通過充當(dāng)測(cè)序模板或通過充當(dāng)用于附接其它多核苷酸的探針等進(jìn)行進(jìn)一步加工?？?以將珠子用鏈霉抗生物素蛋白包覆并與生物素化的DNA/RNA連接，或?qū)⒅樽右员绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種的方式進(jìn)行配置。在此實(shí)施方案的一個(gè)方面中，用條形碼為珠子編碼。條形碼是用于唯一性地檢測(cè) 一個(gè)分子的一種特殊標(biāo)記。條形碼可以是本領(lǐng)域已知的任何類型的條形碼，包括但不限于 光學(xué)標(biāo)記、熒光標(biāo)記、電響應(yīng)標(biāo)記和一組質(zhì)量不同的標(biāo)記。使用取決于條形碼類型的方法來 解碼條形碼，所述方法包括但不限于質(zhì)量、電、視覺、熒光和核酸檢測(cè)。這樣能夠鑒定每個(gè)反 應(yīng)區(qū)中的DNA。如此，這種方法允許將一組珠子引入流動(dòng)通道中，這組珠子中僅有一些含有要分 析的分子(例如，DNA)，其中含有分子的珠子含有不同的分子種類(例如，不同的DNA序列、 不同的蛋白質(zhì)等)。將珠子隨機(jī)放入孔中，并通過條形碼編碼來鑒定。分子僅需要響應(yīng)存在 的Eg。如圖5中所示，甚至某些染料也響應(yīng)，以及蛋白質(zhì)和核酸(DNA、RNA)也是。復(fù)用分析在多個(gè)孔中進(jìn)行，其可以是大約數(shù)百或數(shù)千個(gè)不同的孔?？梢岳貌煌?的流體通道尋址每個(gè)孔(或孔的子組)。一旦將靶分子引導(dǎo)進(jìn)入單獨(dú)的孔中，就將反應(yīng)物 特異性地尋址到那些分子進(jìn)行化學(xué)分析。如上所述讀取結(jié)果，并且分析可以進(jìn)一步包括去 卷積(deconvolute)條形碼以識(shí)別靶分子。本文靈活地(loosely)使用術(shù)語“條形碼”來 指代與靶分子直接地或通過固相支持體如珠子相關(guān)聯(lián)的獨(dú)特分子(如寡核苷酸或磁性顆 粒)。更多細(xì)節(jié)可以在例如2001年7月17日授權(quán)的、題為“Fixed address analysis of sequence tags. ”的Lizardi等人的US 6，261，782中找到。其它能夠依據(jù)本方法使用的標(biāo) 簽包括分子或金屬條形碼、質(zhì)量標(biāo)簽，和可通過核磁共振、電子順磁共振、表面增強(qiáng)型拉曼 散射、表面細(xì)胞質(zhì)基因組反響(surface plasmon resonance)、熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、拉曼 共振、微波或其組合檢測(cè)的標(biāo)簽。質(zhì)量標(biāo)簽是在質(zhì)譜中具有區(qū)別性質(zhì)量特征(distinctive mass signature)、或?yàn)闃?biāo)記的組分提供在質(zhì)譜中的區(qū)別性質(zhì)量特征的化合物或成分 (moiety) 0治療標(biāo)簽在使用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)時(shí)有用。優(yōu)選的治療標(biāo)簽是肽、核酸和糖。也可 以使用標(biāo)簽的組合。例如，具有例如265種獨(dú)特標(biāo)簽組合的顏色編碼微珠可用于區(qū)別多種 組分。例如，可以獨(dú)特地標(biāo)記和檢測(cè)256種不同的連接物_檢測(cè)物(ligator-detector)，使 得所公開的方法能夠復(fù)用和自動(dòng)操作。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)這種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法檢測(cè)DNA分子中界定序列的存在，所述序列與一對(duì)寡核苷酸引物 互補(bǔ)。通過加入加熱元件，PCR反應(yīng)可以在例如圖1中所示例的裝置中進(jìn)行。PCR在例如基 本專利中有述，所述專利如美國(guó)專利No. 4，683，202 ；4，683，195 ；4，800，159和4，965，188。 1996 年 4 月 30 日授權(quán)的、題為"Methods and reagents for the polymerase chain reaction amplification of longDNA sequences,，，的 Cheng 的 US 5，512，462 描述了通過 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增長(zhǎng)于10kb的DNA序列的方法和試劑。所述方法使用由來自嗜 熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的主要熱穩(wěn)定DNA聚合酶與較少量的來自海岸熱球菌 (Thermococcus litoralis)、火球菌屬菌種 GB-D(Pyrococcus species GB-D)或海棲熱袍 菌(Thermotoga maritime)的、擁有3'到5'的核酸外切酶活性的次要熱穩(wěn)定DNA聚合酶 組成的組合物。本方法也可以應(yīng)用于多種通過合成進(jìn)行DNA測(cè)序的方法。熱測(cè)序本文描述的焦磷酸方法是一種通過合成進(jìn)行的測(cè)序。參見Ronaghi等，“ASequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate, " Science,281 :363 365(1998)和 Hyman， “ A New Method of Sequencing DNA, “ Anal. Biochem. , 174 423 436(1988)。如 Ronaghi,‘‘Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing, " GenomeResearch Vol. 11, Issue 1,3-11, January 2001 中所述，熱測(cè)序是一 種以檢測(cè)DNA合成過程中釋放的焦磷酸(PPi)為基礎(chǔ)的DNA測(cè)序技術(shù)。在一連串酶促反 應(yīng)中，產(chǎn)生與結(jié)合的核苷酸數(shù)成比例的可見光。這一連串反應(yīng)始于核酸聚合反應(yīng)，其中因 通過聚合酶進(jìn)行的核苷酸結(jié)合而導(dǎo)致無機(jī)PPi的釋放。釋放的PPi繼而由ATP硫酸化酶 轉(zhuǎn)化成ATP，ATP為螢光素酶氧化螢光素并生成光提供能量。由于加入的核苷酸是已知的， 所以能夠測(cè)定模板的序列。所述核酸分子可以是RNA或DNA。然而，由于對(duì)于有限的核苷 酸延伸DNA聚合酶與RNA聚合酶相比顯示出更高的催化活性，所以集中針對(duì)引物DNA模板 (primed DNA template)用于熱測(cè)序的用途作出努力。標(biāo)準(zhǔn)熱測(cè)序使用大腸桿菌DNA Pol I的Klenow片段，其是相對(duì)緩慢的聚合酶。熱測(cè)序中使用的ATP硫酸化酶是來自酵母釀 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的重組形式，而螢光素酶來自美洲螢火蟲Photinus pyralis。從聚合到光檢測(cè)的全部反應(yīng)在室溫下發(fā)生于3_4秒之內(nèi)。熱測(cè)序反應(yīng)中的lpmol DNA產(chǎn)生6X 10"ATP分子，其繼而在560納米的波長(zhǎng)生成超過6 X 109個(gè)光子。這種量的光 可簡(jiǎn)單地通過光電二極管、光電倍增管或電荷耦合器件(CCD)相機(jī)檢測(cè)。有兩種不同的熱 測(cè)序策略固相熱測(cè)序(Ronaghi等1996)和液相熱測(cè)序。固相熱測(cè)序利用先前描述的三酶 系統(tǒng)中的固定的DNA。在此系統(tǒng)中，在每次核苷酸添加之后進(jìn)行清洗步驟以去除過量的底 物。在液相熱測(cè)序中，弓I入腺苷三磷酸雙磷酸酶，一種來自馬鈴薯的核苷酸降解酶，從而成 為四酶系統(tǒng)。這種酶的加入消除了對(duì)固相支持體和中間清洗的需要，由此使得熱測(cè)序反應(yīng) 能夠在一個(gè)試管中進(jìn)行。盡管在使用天然核苷酸方面是有利的，但是焦磷酸方法需要將聚合酶同步化在 DNA鏈上，已知這會(huì)限制序列閱讀長(zhǎng)度。同樣，預(yù)期所述檢測(cè)方法無法接近單一分子敏感性， 原因是在所述流程中由螢光素酶產(chǎn)生的光的有限的量子效率。此外，整體測(cè)序速度受到必 要的清洗步驟、后續(xù)的目的為鑒定焦磷酸存在的化學(xué)步驟的限制，也受到用全部四種堿基 相繼測(cè)試要測(cè)序的每個(gè)堿基對(duì)所需的固有時(shí)間的限制。在精確測(cè)定序列中同型核苷酸序列 段(stretch)中的困難也是公認(rèn)的。使用上文所列的DNA、核苷酸、PPi和酶的動(dòng)電現(xiàn)象的本方法為熱測(cè)序提供了顯著 的改進(jìn)。反應(yīng)物更好地流入孔中，解決上文列出的關(guān)于同步、閱讀長(zhǎng)度和速度的潛在問題領(lǐng) 域。引物延伸如 2003 年 9 月 2 曰授權(quán)的、題為"Sequencing by incorporation，，的 Parce 等的 US 6，613，513中所述，通過合成或結(jié)合進(jìn)行的測(cè)序通常都涉及將核苷酸或核苷酸類似物加 入包含核酸模板和引物的反應(yīng)混合物，例如，DNA或RNA。將核苷酸摻入引物，產(chǎn)生延伸的引 物。隨著每個(gè)附加的互補(bǔ)核苷酸并入引物而使序列得到測(cè)定，并重復(fù)這些步驟直到整個(gè)模 板序列或其部分得到測(cè)定。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸或核苷酸類似物，或其部分，包含3 ’-封閉 基團(tuán)和可檢測(cè)的標(biāo)簽?zāi)K，所述模塊通常包含磷酸或氨基甲酸基團(tuán)。3'-封閉基團(tuán)提供可逆的鏈終止。當(dāng)添加至生長(zhǎng)中的核酸鏈時(shí)，這些核苷酸類似物導(dǎo)致不能延伸的引物。通常 將3' _封閉基團(tuán)去除，例如通過還原劑和/或磷酸酶，以產(chǎn)生可延伸引物，向該可延伸引物 添加更多的核苷酸，由此允許對(duì)核酸模板的持續(xù)測(cè)序。3'-封閉基團(tuán)的去除任選在檢測(cè)添 加的核苷酸之前或之后進(jìn)行。在本方法的另一實(shí)施方案中，核苷酸或核苷酸類似物包含熒光標(biāo)簽。使用熒光核 苷酸通過合成進(jìn)行的測(cè)序通常包括在檢測(cè)添加的核苷酸之后光漂白熒光標(biāo)簽。光漂白包括 施加光脈沖，光脈沖破壞核苷酸(例如，已經(jīng)添加至引物的熒光核苷酸)的熒光或?qū)⑵浣档?至可以接受的水平，例如，背景水平或降低至足以防止信號(hào)經(jīng)過幾個(gè)測(cè)序循環(huán)而積累的低 水平。已經(jīng)開發(fā)了與末端核苷酸相關(guān)的使用染料或熒光標(biāo)簽的相關(guān)方法，其中序列測(cè)定 也通過凝膠電泳和自動(dòng)熒光檢測(cè)器來進(jìn)行。例如，最近已將Sanger延伸法修改用于自動(dòng) 微型測(cè)序系統(tǒng)中，其僅需要亞微升體積的試劑和染料標(biāo)記的三磷酸雙脫氧核糖核苷酸。在 Soper等的美國(guó)專利No. 5，846，727中，熒光檢測(cè)在芯片上進(jìn)行，所述芯片具有一個(gè)將激發(fā) 光傳送至毛細(xì)管通道的單模光纖，和另一個(gè)收集熒光光子的單模光纖。估計(jì)序列讀取在400 至500個(gè)堿基范圍內(nèi)，這相對(duì)于用傳統(tǒng)Sanger或Maxam-Gilbert方法獲得的序列信息量沒 有顯著改進(jìn)。另外，Soper方法在開始分離反應(yīng)之前需要PCR擴(kuò)增模板DNA，并對(duì)寡核苷酸測(cè) 序“梯子”進(jìn)行純化和凝膠電泳。這些系統(tǒng)都需要大量目標(biāo)DNA。即使是Cheeseman的美國(guó) 專利5，302，509中描述的方法，其不使用凝膠電泳進(jìn)行序列測(cè)定，也需要至少一百萬個(gè)DNA 分子。另外，可以使目前的電場(chǎng)設(shè)備適合用于涉及蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)和 小分子之間的接觸的測(cè)定法。例如，可以將固定的酶與底物(含或不含抑制劑)接觸，由此 使底物和任何抑制劑作為帶電粒子存在于溶液中。施加的E場(chǎng)使反應(yīng)物朝著酶移動(dòng)以縮短 過程時(shí)間。類似地，可以按照公開的方法設(shè)計(jì)使用固定在微量滴定板上的捕獲抗體的免疫 測(cè)定形式，從而改進(jìn)帶電試劑(抗原、標(biāo)記的抗體)朝向或離開捕獲抗體的流速。
實(shí)施例實(shí)施例1 將珠子集中到電極孔中在本實(shí)施例中，示例了在50 iim孔內(nèi)由電場(chǎng)輔助誘捕liim熒光聚苯乙烯珠。如圖 3中所示，制備了四個(gè)電極孔?？资褂靡粋?cè)帶有粘合劑的150 ym厚Mylar片層(sheet)制 成。將電極加工在印刷電路板上，且每個(gè)電極能夠通過施加跨越該電極和主體溶液的電壓 來單獨(dú)地激活。80 y m厚的電流傳導(dǎo)性Nafion膜形成了孔的底部，并且使電極與含有珠子 的溶液絕緣。將一個(gè)多輸出式計(jì)算機(jī)控制的電源(multi-output computer controlledpower supply) (Labsmith,HVS 3000D)用于單獨(dú)激活電極。使用立式Nikon落射熒光顯微鏡進(jìn)行 成像。通過將母液在10mM Tris-HEPES緩沖液中稀釋10，000x制備珠的溶液。然后將珠的 溶液注入電極之上3cm長(zhǎng)、5mm寬的流動(dòng)腔中?？缭诫姌O和主體溶液施加 75V/cm的額定 直流電場(chǎng)，珠子繼而在不到10秒之內(nèi)被誘捕到孔中。電壓僅施加在四個(gè)電極中的兩個(gè)上， 并在這些激活的電極部位處的Nafion膜上觀察到顆粒堆疊。在此實(shí)施方案中，存在將珠子 引導(dǎo)至孔內(nèi)的膜的直流電流。在下文描述的實(shí)施方案中，在電極上存在介電層，其阻止這些直流電流。因此，那些實(shí)驗(yàn)需要來自交流和直流電壓的組合的位移電流。實(shí)施例2 電場(chǎng)引導(dǎo)的熒光物質(zhì)的預(yù)濃集現(xiàn)參考圖4，其示例了用于說明電場(chǎng)引導(dǎo)的帶電分子移動(dòng)的原型裝置。該裝置包含 一層250 u M厚的硅墊片材料410，在該層中具有1mm直徑的孔。將其置于20nm聚對(duì)二甲 苯介電層408上，聚對(duì)二甲苯介電層408已經(jīng)放置在1 in. x 3 in玻璃片404上的150nm IT0層406上，形成“底部”。為了形成“頂部”，將另一玻璃片414類似地用IT0層415包覆 以形成電極，且聚對(duì)二甲苯層417位于頂部電極的“底部”一側(cè)與流體接觸，流體可以容納 在孔412中，孔412在兩個(gè)片包夾到一起時(shí)形成。將Coolsnap fx-16 CCD照相機(jī)，Olympus 1X70落射熒光顯微鏡成像裝置416布 置在流體孔之下。使用導(dǎo)電銅帶將電極與信號(hào)發(fā)生器連接。將含有500nM Alexa-Fluor 488 熒光染料(Molecular Probes)的 10mMTris-HCl 溶液按照以下流程置于孔中將導(dǎo)電銅帶與玻璃片上曝露的IT0層連接。將硅墊片置于底 部玻璃片上并且對(duì)玻璃片按壓以形成密封。用熒光染料溶液填滿墊片中的1mm孔。將第二 片玻璃片置于墊片頂部以密封含熒光染料的孔的頂部。控制信號(hào)發(fā)生器402操作，以跨越 玻璃片上的頂部和底部IT0電極(即，孔上和孔下)提供5V交流峰峰值、500kHz頻率?？?越底部和頂部玻璃片施加偏壓VDe = 1. 5V以實(shí)現(xiàn)將熒光Alexa-Fluor分子預(yù)濃集在孔底部 附近。結(jié)果示于圖5中。在圖5B的照片中可見，當(dāng)在玻璃片之間施加+1. 5V直流電壓和 交流電壓時(shí)，熒光染料集中在孔底部附近。在僅施加交流電壓或僅施加直流電壓時(shí)，未觀 察到預(yù)濃集(5A)。如上所述，本裝置在此使用位移電流(或交流場(chǎng)，參見上文的式2)來防 止在液體-電介質(zhì)界面形成雙電層，雙電層將使一個(gè)表面附近的場(chǎng)集中(concentrate the field near one surface)。雙電層通常會(huì)屏蔽施加的整個(gè)直流電壓，在主體液體中將不存 在電場(chǎng)。因此，主體溶液中的離子不會(huì)經(jīng)受任何電場(chǎng)。通過施加高頻交流場(chǎng)，雙電層的影響 消失。因此，當(dāng)施加帶有直流偏壓的高頻交流電時(shí)，有可能在主體液體中具有凈電場(chǎng)。交流 場(chǎng)使因雙電層產(chǎn)生的電壓屏蔽作用瓦解，而直流偏壓在溶液中產(chǎn)生凈電場(chǎng)。這個(gè)系統(tǒng)的一 個(gè)優(yōu)勢(shì)是系統(tǒng)中不需要法拉第電流(引起電解)來實(shí)現(xiàn)預(yù)濃集。實(shí)施例3 電場(chǎng)引導(dǎo)的焦磷酸的預(yù)濃集基本上如圖4中所示構(gòu)建了一個(gè)裝置，有以下不同代替照相機(jī)和顯微鏡，將磁體 和Hamamatsu光電倍增管布置在孔412之下，如圖4中416處所示。流程如下將導(dǎo)電銅帶與玻璃片上曝露的IT0層連接。將硅墊片置于底部玻璃片 上并且對(duì)玻璃片按壓以形成密封。用含酶的磁珠裝填墊片中的1mm孔。將磁體置于玻璃片 下以使磁珠保持靜止。用焦磷酸鹽溶液注滿墊片中1mm的孔。將第二片玻璃片置于墊片頂 部來密封含化學(xué)品的孔的頂部。化學(xué)品如下焦磷酸鹽溶液、裝載有ATP硫酸化酶的磁珠和 螢光素酶(獲得自佔(zhàn)4 Life Scineces)。在頂部和底部IT0片之間施加峰峰值5V、500kHz頻率的交流電壓。在底部和頂部 片之間施加偏壓VDC = 1. 5V以實(shí)現(xiàn)將焦磷酸分子預(yù)濃集在孔的底部附近。圖6顯示了跨越通道施加或未施加直流偏壓時(shí)的光電倍增管的輸出。當(dāng)施加直流 偏壓時(shí)，來自化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的光信號(hào)增加，原因是酶珠附近的焦磷酸鹽濃度增加。當(dāng)去除偏 壓時(shí)，背景光信號(hào)降回到原始水平。當(dāng)在片之間施加+1. 5Vdc電壓時(shí)，來自酶促反應(yīng)的光信號(hào)因焦磷酸分子預(yù)濃集到孔底部酶珠附近而增加。當(dāng)僅施加交流電壓或僅施加直流電壓 時(shí)，觀察不到預(yù)濃集。在本實(shí)施例中，使用磁珠固定酶，并且在下方有將珠子保持在適當(dāng)位 置的磁體。當(dāng)施加純交流場(chǎng)時(shí)，不存在預(yù)濃集，因?yàn)橹黧w液體中的凈電場(chǎng)為零。當(dāng)僅施加直 流場(chǎng)時(shí)，雙電層屏蔽了施加的電壓，因而主體液體中的離子仍然不經(jīng)受凈電場(chǎng)。實(shí)施例4 電場(chǎng)引導(dǎo)的熱測(cè)序?yàn)榱嗽谖⒘餍酒线M(jìn)行熱測(cè)序，優(yōu)選在反應(yīng)孔中分離各個(gè)珠子。為了定位光信號(hào)并產(chǎn)生高強(qiáng)度發(fā)光，將檢測(cè)酶(螢光素酶和ATP硫酸化酶)固定 在用羧酸官能化的0.5i!m聚苯乙烯珠上。首先使用N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基 碳二亞胺(DEC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)將珠子上的羧酸轉(zhuǎn)化成胺活性的NHS酯。用 于將配體與珠子華禹合的多種方案在"Particulate solidsupports functionalized with EGTA ligands,"US 6，551，515中給出。然后這些NHS酯參與用酶表面上的氨基基團(tuán)形成 酰胺鍵。通過采用兩步式明確界定的固定化策略來最小化酶中關(guān)鍵殘基的損失。這些相 對(duì)透明的聚苯乙烯珠遠(yuǎn)小于454使用的2. 8 ii m不透明的磁珠(Margulies等，2005，cited under" ParticularPatents and Publications")。因此，結(jié)合容量顯著增加，并且將產(chǎn) 生更高的每體積固定材料的酶單位量。另外，由珠子上的羧基基團(tuán)提供的負(fù)電荷和酶上的 凈負(fù)電荷(對(duì)于螢火蟲螢光素酶和ATP硫酸化酶PI分別為6. 2-6. 4和5. 3-5. 7)在7. 5的 熱測(cè)序PH下，將為珠子提供有效的負(fù)電荷。然后通過電場(chǎng)(e場(chǎng))的使用將這些帶高電荷的珠子沉積在孔中。為了在芯片上 實(shí)現(xiàn)e場(chǎng)，將通過沉積如圖1-2中所示的IT0薄層( 0. 1 y m)而加工的透明電極用在光 導(dǎo)纖維面板和流體腔的頂蓋上?？缭桨驳碾姌O施加 IV電勢(shì)差以避免任何電解反應(yīng)并實(shí)現(xiàn) lOOV/cm的電場(chǎng)。 這些電極也將有助于沉積帶有DNA的30 y m聚苯乙烯珠和0. 5 y m聚苯乙烯酶珠，它們帶有 凈負(fù)電荷。由于珠子溶液的電荷分布和降低的電導(dǎo)率，面板孔覆蓋率將被改進(jìn)到 80%。 我們已經(jīng)證明了使用微加工電極對(duì)孔內(nèi)lym聚苯乙烯珠進(jìn)行的選擇性誘捕(如實(shí)施例1 中所述)。如上所述，為了實(shí)現(xiàn)將核苷酸活性預(yù)濃集至反應(yīng)孔附近，我們施加了橫穿流動(dòng)方 向的eg。這種策略提供了幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。在每次熱測(cè)序運(yùn)行過程中釋放的PPi將通過使負(fù)電 荷進(jìn)入孔中的電場(chǎng)被限制在反應(yīng)孔，并且將兩個(gè)相鄰孔之間的化學(xué)品相互干擾最小化。這 對(duì)于將來為了高密度平臺(tái)而降低孔和珠的大小是關(guān)鍵的。另外，清洗步驟能夠通過簡(jiǎn)單地 逆轉(zhuǎn)電場(chǎng)方向并因此將核苷酸排斥到孔外而變得更加有效。這種方法對(duì)于提高清洗效率以 實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)閱讀的價(jià)值是無法衡量的。在熱測(cè)序?qū)嶒?yàn)開始時(shí)，進(jìn)行PPi清洗以測(cè)量跨越整個(gè)芯片產(chǎn)生的光信號(hào)。從每個(gè) 孔釋放的光信號(hào)在所有的孔中應(yīng)該相等。然后進(jìn)行清洗，其后循環(huán)添加核苷酸。第一核苷 酸序列提供關(guān)于“鑰匙”的信息，“鑰匙”將幫助我們啟動(dòng)系統(tǒng)。在堿基判定之后，將這個(gè)鑰 匙序列從實(shí)際序列去除以提供初生序列(nascent sequence)用于裝配。結(jié)論上文的具體描述意在示例并闡明本發(fā)明，而不應(yīng)被看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本 發(fā)明的范圍由隨附權(quán)利要求字面上的范圍和等同的范圍來界定。在本說明書中提及的任何 專利或出版物表明了所述專利所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平，并且旨在傳達(dá)可能沒有明確列出但是本領(lǐng)域工作人員應(yīng)該理解的細(xì)節(jié)。這些專利或出版物通過引用并入本文，其程度就像 為了描述并使所涉及的方法或材料能夠進(jìn)行的目的所需，通過具體和個(gè)別地引用將每一篇 參考文獻(xiàn)并入本文一樣。
權(quán)利要求
一種用于實(shí)施生物測(cè)定的裝置，其具有至少一個(gè)流體通道和反應(yīng)區(qū)，所述反應(yīng)區(qū)帶有暴露于該流體通道的開口和偏離該流體通道的反應(yīng)區(qū)底部，所述裝置被構(gòu)建成使流體沿著橫穿反應(yīng)區(qū)開口的方向流動(dòng)，所述裝置包含(a)與反應(yīng)區(qū)底部相鄰的第一電極；(b)與反應(yīng)區(qū)開口相鄰的第二電極；和(c)與第一和第二電極相連的可控電壓源，其可被控制以在第一電極和第二電極之間提供交流電壓和直流偏壓，從而在第一電極和第二電極之間產(chǎn)生電場(chǎng)；由此通過電極之間的電場(chǎng)引導(dǎo)流體通道內(nèi)流體中的帶電物質(zhì)進(jìn)入或退出反應(yīng)區(qū)。
2.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步包含與反應(yīng)區(qū)耦合的反應(yīng)傳感器，用于檢測(cè)反應(yīng)區(qū)中的 反應(yīng)。
3.權(quán)利要求2的裝置，其中所述反應(yīng)傳感器包含與透明電極耦合的光導(dǎo)纖維面板。
4.權(quán)利要求2的裝置，其中所述反應(yīng)傳感器包含CMOS光敏元件。
5.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步地，其中反應(yīng)區(qū)是孔，其大小僅可容納一顆珠子。
6.權(quán)利要求5的裝置，進(jìn)一步地包含帶負(fù)電荷的珠子。
7.權(quán)利要求6的裝置，其中所述帶負(fù)電荷的珠子是聚苯乙烯。
8.權(quán)利要求6的裝置，其中所述珠子是磁性的，并且所述裝置進(jìn)一步包含磁體。
9.權(quán)利要求1的裝置，其中所述與底部相鄰的電極是厚度小于約150nm的ITO薄層。
10.權(quán)利要求1的裝置，其中所述反應(yīng)區(qū)是在惰性固態(tài)聚合物中界定的，所述聚合物選 自由光致抗蝕劑和PDMS組成的組。
11.權(quán)利要求1的裝置，其中所述電極包含位于暴露于流體通道中液體的表面上的介 電涂層。
12.權(quán)利要求11的裝置，其中所述介電涂層是聚對(duì)二甲苯或氧化硅或氮化硅中的一種 或多種。
13.權(quán)利要求1的裝置，其中所述電極由線柵形成。
14.一種用于引導(dǎo)液體中帶電粒子移動(dòng)的裝置，其中所述粒子被引導(dǎo)進(jìn)入反應(yīng)區(qū)，所述 裝置包含(a)位于反應(yīng)區(qū)中液體的一側(cè)的涂有介電材料的第一電極；(b)位于反應(yīng)區(qū)中液體的相對(duì)側(cè)的涂有介電材料的第二電極；(c)橫穿反應(yīng)區(qū)的流體流動(dòng)通道；和(d)用于信號(hào)發(fā)生器的連接，所述信號(hào)發(fā)生器向第一電極和第二電極施加交流電壓和 直流偏壓，藉此所述電極被構(gòu)建并排列以在它們之間生成電場(chǎng)。
15.權(quán)利要求14的裝置，其中所述反應(yīng)區(qū)僅對(duì)于一顆珠子是足夠大的。
16.一種用于在微流裝置中移動(dòng)帶電分子物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)從與反應(yīng)區(qū)相通的流 體通道移動(dòng)進(jìn)入反應(yīng)區(qū)，所述方法包括步驟(a)使帶電分子物質(zhì)在流體通道中沿流動(dòng)方向流動(dòng)；(b)提供具有跨越反應(yīng)區(qū)的正極端和負(fù)極端的電場(chǎng)；和(c)通過向反應(yīng)區(qū)中的電場(chǎng)施加與分子物質(zhì)上的電荷相反的電荷來引導(dǎo)帶電分子物質(zhì) 進(jìn)入反應(yīng)區(qū)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述反應(yīng)區(qū)含有第二分子物質(zhì)，并且其中所述方法導(dǎo)致所述帶電分子物質(zhì)與所述第二分子物質(zhì)之間的反應(yīng)。
18.權(quán)利要求16的方法，其進(jìn)一步包括以至少IOOkHz的頻率將電場(chǎng)反相的步驟。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述頻率最小為IOkHz且最大為IOMHz。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述偏壓為至少1伏特。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述電場(chǎng)具有至少約5V/cm的強(qiáng)度。
22.權(quán)利要求16的方法，其中將所述偏壓反相以引導(dǎo)分子物質(zhì)退出反應(yīng)區(qū)。
23.權(quán)利要求16的方法，其中所述電場(chǎng)是電位移場(chǎng)。
24.一種在微流裝置中富集核酸包覆的珠子的方法，其包括步驟(a)使裸珠子和核酸包覆的珠子在流體通道中沿流動(dòng)方向流動(dòng)，其中所述流體通道與 反應(yīng)區(qū)相通；(b)提供具有跨越反應(yīng)區(qū)的陽極端和陰極端的電場(chǎng)；(c)通過向電場(chǎng)施加與DNA包覆的珠子上的電荷相反的電荷來引導(dǎo)核酸包覆的珠子進(jìn) 入反應(yīng)區(qū)；和(d)收集任何沒有被引導(dǎo)進(jìn)入反應(yīng)區(qū)的珠子。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述微流裝置含有多個(gè)反應(yīng)區(qū)，并且其中每個(gè)反應(yīng)區(qū)是 大小僅可容納一顆珠子的孔。
全文摘要
本發(fā)明公開了應(yīng)用電場(chǎng)來改善生物測(cè)定的方法和設(shè)備。將電場(chǎng)施加在帶有孔(well)的裝置上，所述孔接受攜帶電荷的反應(yīng)物。由此該裝置使用在第一和第二電極之間的可控電壓源，其可以被控制以向給定的電極提供正電荷和負(fù)電荷。通過電場(chǎng)的受控使用，通過電極之間的電場(chǎng)引導(dǎo)流體通道內(nèi)流體中的帶電物質(zhì)進(jìn)入或退出所述孔。本方法包括依據(jù)各種測(cè)定流程，如DNA測(cè)序、合成等，輸送流體，如在微流裝置中的輸送，并通過電場(chǎng)誘導(dǎo)移動(dòng)反應(yīng)物質(zhì)。
文檔編號(hào)B01D57/02GK101848757SQ200880024596
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日
發(fā)明者塔朗·庫拉納, 胡安·G·圣地亞哥, 莫斯塔法·羅納吉 申請(qǐng)人:里蘭斯坦福初級(jí)大學(xué)理事會(huì)