一種水稻稻曲病抗性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種水稻稻曲病抗性檢測方法，本發(fā)明選育水稻稻曲病抗性品種雜交種F1，并對雜交種F1通過分子標記得到抗水稻稻曲病的基因位點，并確定水稻稻曲病在第11號染色體上的位置。本發(fā)明涉及的水稻稻曲病抗性檢測方法，通過檢測水稻品種第11號染色體上引物標記的帶型數(shù)據(jù)，評估其對水稻稻曲病的抗性，大大提高抗稻曲病水稻的選擇效率。
【專利說明】
一種水稻稻曲病抗性檢測方法
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種水稻稻曲病抗性檢測方法，具體涉及在水稻稻曲病抗性品種的11 號染色體上分子標記出水稻稻曲病抗性基因的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻稻曲病別名青粉病、偽黑穗病，是一種由稻曲病菌引起的水稻穗部谷粒病害。 稻曲病不僅影響水稻產(chǎn)量，而且對人類健康構(gòu)成重大威脅。感稻曲病水稻的穗粒內(nèi)形成菌 絲塊膨大后形成大于谷粒數(shù)倍的稻曲球，逐漸膨大，內(nèi)外穎裂開，增加水稻的秕谷率、青米 率和碎米率，局部地塊甚至減產(chǎn)20%~30 %。稻曲病菌能產(chǎn)生稻曲毒素，當?shù)竟戎泻?〇. 5 %的病粒時，能使人畜中毒。
[0003] 稻曲病是一種世界性的病害，在美洲、非洲和亞洲等許多國家和地區(qū)都有大面積 的發(fā)生，病害嚴重時，發(fā)病率可高達40%以上。在我國，隨著一些矮桿緊湊型水稻品種的推 廣以及栽培方式、技術(shù)條件的改變，水稻稻曲病的發(fā)生愈來愈突出，成為我國水稻生產(chǎn)的主 要病害，在一些稻區(qū)，稻曲病甚至超過稻瘟病而成為水稻生產(chǎn)的重大病害。
[0004] 在歷史上，稻曲病一直屬于為害較輕的次要病害，只是近十多年的迅猛發(fā)展，才上 升為水稻生產(chǎn)的重大病害。由于歷史上未能獲得足夠的重視，稻曲病防治的有關基礎研究 仍然薄弱?，F(xiàn)有技術(shù)防治水稻稻曲病主要方法是利用化學藥劑，化學藥劑的使用不可避免 地對環(huán)境造成污染和破壞?，F(xiàn)有技術(shù)還有的通過在生產(chǎn)過程中改進栽培技術(shù)條件對水稻稻 曲病進行防治的措施，但收效甚微。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)在水稻生產(chǎn)上對水稻稻曲病的防治對策在一定程度上增加了水稻生產(chǎn) 的成本，并且加重了環(huán)境壓力。
[0006] 利用水稻品種抗性被認為是目前防治稻曲病最經(jīng)濟、有效的手段。將栽培水稻或 野生稻中的水稻稻曲病抗性基因轉(zhuǎn)育到主栽稻品種中，是獲得安全的水稻稻曲病抗性品種 的最有效方法，但現(xiàn)有技術(shù)育種的進程緩慢且未有專門針對水稻稻曲病抗體的育種方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種水稻稻曲病抗性檢測方法，選育 水稻稻曲病抗性品種雜交種Fl，并運用SSR分子標記從水稻稻曲病抗性品種中在11號染色 體上標記出水稻稻曲病抗性基因。
[0008] 具體步驟如下：
[0009] (1)雜交種Fl的獲得：以水稻稻曲病抗源湘優(yōu)66為母本，水稻稻曲病高感品種紅蓮 優(yōu)6號為父本，二者正季播種，于實驗秧田，單株移栽，株行距為30 X 30cm; -般大田肥水和 病蟲草害管理，至植株正常生長到揚花期，將湘優(yōu)66植株的稻穗浸入39~46°C的溫水中，浸 泡6~10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及未開穎的小花，用紙袋將湘優(yōu)66植株 的稻穗套好并作標記，待用。當紅蓮優(yōu)6號植株進入開花期時，將紅蓮優(yōu)6號植株上稻穗的花 藥均勻落到紙袋中湘優(yōu)66植株稻穗的柱頭上，人工授粉完成后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交 稻穗的籽粒成熟，即獲得雜交種Fl。
[0010] (2)雜交種Fl的花藥愈傷誘導：雜交種Fl正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/ 2為標準取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個稻穗，保持稻穗濕潤 放入冰箱中，在4°C下低溫預處理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒 處理2~10分鐘，晾干后用剪開花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進行誘導培養(yǎng)，在22~ 28°C下暗培養(yǎng)2~3天后，轉(zhuǎn)移至第二培養(yǎng)基中，于25~29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗 下進行繼代培養(yǎng)，50天后將獲得的雜交種Fl的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移 植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通過篩選即獲得水稻稻曲病抗性品種。
[0011] 所述第一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，煙酸0.5mg/ L，瓊脂7.5g/L;激動素 KT 2. Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸 0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/L，秋水仙堿 0 · 3mg/L; pH 值為6 · 0。
[0012]所述第二培養(yǎng)基的成分為:1^基本培養(yǎng)基190〇1^/1、肌醇10〇11^/1，甘氨酸2.〇1^/ L，維生素 BI 0.4mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAAO · 5mg/L，生物素0 · lmg/L， 甲基亞硝基脲0 · 8mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣0 · 4mg/L，水解蛋白1 · Og/L;以及濃度20%的水稻稻曲病菌 粗毒素提取液，pH值為6.0。
[0013] 所述水稻稻曲病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染水稻稻曲病水稻的穗頸部 剪下，清潔表面后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產(chǎn)生后加入營養(yǎng)瓊脂繼 續(xù)培養(yǎng)，得到菌株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分 鐘、過濾、以500~1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細菌性基腐病菌粗 毒素。
[0014] (3)預處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細粉，加入體積百分比2%的β-巰基 乙醇，震蕩，加入50mM的三(羥甲基）氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質(zhì)量體 積百分比為2%的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質(zhì)量體積百分比為5%的十六烷基三甲基溴化銨 CTAB，混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將 混合物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄 上清液得到DNA沉淀物。
[0015] 所述水稻葉片與β-疏基乙醇、Tri s-HCl、PVP、CTAB的質(zhì)量體積比mg/yLAxL/yLAiL 為1:1 ~5:1 ~5:3~8:8~12,優(yōu)選為1:3:3:5:10。
[0016] 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm，優(yōu)選為900rpm。
[0017] (4)SSR引物：用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物， 所述296對SSR引物含54對自行合成引物。
[0018] (5)PCR反應:PCR反應體系為：總體積為10yL，0.5yL15mM的脫氧核糖核苷三磷酸 dNTP，1 · 2yLl0 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補水至IOyL; PCR擴 增程序為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最后 得到的PCR擴增產(chǎn)物4 °C保存Ih。
[0019] (6)染色：向PCR擴增產(chǎn)物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入10%的聚丙烯酰胺 PAGE的點樣孔，恒壓180V電泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作 用下染色。
[0020] (7)檢測：根據(jù)定位群體各單株分子標記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參 數(shù)，進行基因和分子標記位點的遺傳連鎖分析；檢測水稻稻曲病的抗性數(shù)量性狀基因座 QTL，LOD值的閾值定為2.5~3.0，按P = 0.005的概率值檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上 的位置。
[0021 ]本發(fā)明涉及的一種水稻稻曲病抗性檢測方法，以水稻稻曲病抗源湘優(yōu)66為母本， 水稻稻曲病高感品種紅蓮優(yōu)6號為父本，選育水稻稻曲病抗性品種雜交種F1。通過對雜交種 Fl通過花藥愈傷誘導培育的新品種進行分子標記得到抗稻曲病基因位點qRBSDV17,位于第 11號染色體分子標記RM4504與RM3133之間。本發(fā)明涉及的水稻稻曲病抗性染色體的分子標 記方法，可以通過檢測某一品種第11號染色體上下游兩個引物標記的帶型數(shù)據(jù)，評估其對 水稻稻曲病的抗性，大大提高抗稻曲病水稻的選擇效率。
[0022]本發(fā)明通過分子標記的方法對水稻稻曲病的抗性進行評估，避免使用化學藥劑增 加水稻生產(chǎn)的成本且避免對環(huán)境造成污染和破壞，無需多世代重復雜交回交，縮短了育種 周期。
【附圖說明】
[0023]圖1為11號染色體上抗稻曲病基因位點qRBSDV17在染色體上的位置。
[0024] 圖2為11號染色體上抗稻曲病基因位點評估水稻品種對水稻稻曲病的抗性的電泳 圖譜。M: Mark; 1:湘優(yōu)66; 2:紅蓮優(yōu)6號;3 :F1;4-11 :抗病單株;12-20:感病單株。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過具體實施例，進一步對本發(fā)明的技術(shù)方案進行具體說明。應該理解，下面 的實施例只是作為具體說明，而不限制本發(fā)明的范圍，同時本領域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明 所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
[0026] 實施例1
[0027] (1)雜交種Fl的獲得:正季收集來源于15個省份共225份水稻品種進行抗水稻稻曲 病田間誘發(fā)鑒定，結(jié)果表明，不同省區(qū)水稻品種對稻曲病的抗性存在明顯差異，品種湘優(yōu)66 水稻稻曲病抗性較好，大田發(fā)病率僅有5%，屬于高抗水平。以水稻稻曲病抗源湘優(yōu)66為母 本，水稻稻曲病高感品種紅蓮優(yōu)6號為父本，二者正季播種，于實驗秧田，單株移栽，株行距 為30 X 30cm; -般大田肥水和病蟲草害管理，至植株正常生長到揚花期，將湘優(yōu)66植株的稻 穗浸入39~46°C的溫水中，浸泡6~10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及未開穎 的小花，用紙袋將湘優(yōu)66植株的稻穗套好并作標記，待用。當紅蓮優(yōu)6號植株進入開花期時， 將紅蓮優(yōu)6號植株上稻穗的花藥均勻落到紙袋中湘優(yōu)66植株稻穗的柱頭上，人工授粉完成 后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交稻穗的籽粒成熟，即獲得雜交種Fl。
[0028] (2)雜交種Fl的花藥愈傷誘導：
[0029]雜交種Fl正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/2為標準取穗，取穗后用70%乙 醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個稻穗，保持稻穗濕潤放入冰箱中，在4tC下低溫預處 理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒處理2~10分鐘，晾干后用剪開 花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進行誘導培養(yǎng)，在22~28°C下暗培養(yǎng)2~3天后，轉(zhuǎn)移 至第二培養(yǎng)基中，于25~29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下進行繼代培養(yǎng)，50天后將獲 得的雜交種Fl的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟， 通過篩選即獲得水稻稻曲病抗性品種。
[0030] 所述第一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，煙酸0.5mg/ L，瓊脂7.5g/L;激動素 KT 2. Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸 0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/L，秋水仙堿 0 · 3mg/L; pH 值為6 · 0。
[0031]所述第二培養(yǎng)基的成分為:15基本培養(yǎng)基190〇11^/1、肌醇10〇11^/1，甘氨酸2.〇1^/ L，維生素 BI 0.4mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAAO · 5mg/L，生物素0 · lmg/L， 甲基亞硝基脲0 · 8mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣0 · 4mg/L，水解蛋白1 · Og/L;以及濃度20%的水稻稻曲病菌 粗毒素提取液，pH值為6.0。
[0032]所述水稻稻曲病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染水稻稻曲病水稻的穗頸部 剪下，清潔表面后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產(chǎn)生后加入營養(yǎng)瓊脂繼 續(xù)培養(yǎng)，得到菌株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分 鐘、過濾、以500~1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細菌性基腐病菌粗 毒素。
[0033] (3)預處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細粉，加入體積百分比2%的β-巰基 乙醇，震蕩，加入50mM的三(羥甲基）氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質(zhì)量體 積百分比為2%的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質(zhì)量體積百分比為5%的十六烷基三甲基溴化銨 CTAB，混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將 混合物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄 上清液得到DNA沉淀物。
[0034] 所述水稻葉片與β-巰基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的質(zhì)量體積比mgAiLAiL/yLAiL 為1:3:3:5:10。
[0035] 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm。
[0036] (4)SSR引物：用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物， 所述296對SSR引物含54對自行合成引物。
[0037] (5) PCR反應:PCR反應體系為：總體積為I OyL，0.5yL 15mM的脫氧核糖核苷三磷酸 dNTP，1 · 2yLl0 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補水至IOyL; PCR擴 增程序為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最后 得到的PCR擴增產(chǎn)物4 °C保存Ih。
[0038] (6)檢測:PCR擴增產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺PAGE經(jīng)硝酸銀染色后，再用NaOH顯色。
[0039]向PCR擴增產(chǎn)物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入PAGE的點樣孔，恒壓180V電 泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作用下染色。
[0040] (7)根據(jù)定位群體各單株分子標記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用 Mapmaker/Exp3.0軟件進行基因和分子標記位點的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將 交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM)。
[0041 ] (8)米用基于復合區(qū)間作圖法軟件Windows QTL Cartographer V2.5檢測水稻稻 曲病的抗性QTL，LOD值的閾值定為2.7，按P = O . 005概率值檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色 體上的位置。在11號染色體上檢測到1個水稻稻曲病抗性QTULOD值為3.88,貢獻率為 17.9%，命名為qRBSDV17，位于第ll號染色體分子標記RM4504:SEQIDN0.1/SEQIDN0.2 與分子標記RM3133:SEQ ID N0.3/SEQ ID從).4之間（如圖1)。
[0042] (9)用第11號染色體分子標記RM4504引物：如果用分子標記RM4504引物：SEQ ID N0.1/SEQIDN0.2能夠擴增出127bp的擴增片段，或用分子標記RM3133:SEQIDN0.3/SEQ ID N O . 4能夠擴增出9 8 b p的擴增片段，則標志著水稻材料內(nèi)存在抗水稻稻曲病位點 qRBSDV17(如圖2)，通過檢測第11號染色體上該兩個引物標記的帶型數(shù)據(jù)，評估該植株對水 稻稻曲病的抗性。
【主權(quán)項】
1. 一種水稻稻曲病抗性檢測方法，其特征在于:其步驟如下： (1) 雜交種F1的獲得：以水稻稻曲病抗源湘優(yōu)66為母本，水稻稻曲病高感品種紅蓮優(yōu)6 號為父本，二者正季播種，于實驗秧田，單株移栽，株行距為30 X 30cm; -般大田肥水和病蟲 草害管理，至植株正常生長到揚花期，將湘優(yōu)6 6植株的稻穗浸入3 9~4 6 °C的溫水中，浸泡6 ~10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及未開穎的小花，用紙袋將湘優(yōu)66植株的 稻穗套好并作標記，待用；當紅蓮優(yōu)6號植株進入開花期時，將紅蓮優(yōu)6號植株上稻穗的花藥 均勻落到紙袋中湘優(yōu)66植株稻穗的柱頭上，人工授粉完成后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交稻 穗的籽粒成熟，即獲得雜交種F1; (2) 雜交種F1的花藥愈傷誘導：雜交種F1正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/2為 標準取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個稻穗，保持稻穗濕潤放入 冰箱中，在4°C下低溫預處理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒處理2 ~10分鐘，晾干后用剪開花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進行誘導培養(yǎng)，在22~28°C 下暗培養(yǎng)2~3天后，轉(zhuǎn)移至第二培養(yǎng)基中，于25~29°C、光周期16h7500lx光照8h黑暗下進 行繼代培養(yǎng)，50天后將獲得的雜交種F1的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移植到 大田，等待稻穗籽粒成熟，通過篩選即獲得水稻稻曲病抗性品種； (3) 預處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細粉，加入體積百分比2%的β-巰基乙醇， 震蕩，加入50mM的三(羥甲基)氨基甲烷Tr i s-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質(zhì)量體積百分 比為2 %的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質(zhì)量體積百分比為5 %的十六烷基三甲基溴化銨CTAB， 混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將混合 物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄上清 液得到DNA沉淀物； 所述水稻葉片與巰基乙醇、Tr i s-HCl、PVP、CTAB的質(zhì)量體積比mg/WyLAiLAxL為1:1 ~5:1~5:3~8:8~12; 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm; (4) SSR引物：用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物，所述 296對SSR引物含54對自行合成引物； (5) PCR反應:PCR反應體系為：總體積為10yL，0.5yL15mM的脫氧核糖核苷三磷酸dNTP， 1 · 2yL10 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補水至 10yL; PCR擴增程 序為:94°C預變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最后得到 的PCR擴增產(chǎn)物4°C保存lh; (6) 染色：向PCR擴增產(chǎn)物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入10%的聚丙烯酰胺PAGE 的點樣孔，恒壓180V電泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作用下 染色； (7) 檢測：根據(jù)定位群體各單株分子標記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，進 行基因和分子標記位點的遺傳連鎖分析;檢測水稻稻曲病的抗性數(shù)量性狀基因座QTL，L0D 值的閾值定為2.5~3.0，按P = 0.005的概率值檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻稻曲病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述第 一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2. Omg/L，煙酸0.5mg/L，瓊脂7.5g/L;激 動素 KT2 · Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/ L，秋水仙堿Ο · 3mg/L; pH值為6 · 0。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻稻曲病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述第 二培養(yǎng)基的成分為：MS基本培養(yǎng)基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2 . Omg/L，維生素 B10 · 4mg/L，維生素 B60 · 5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAA0 · 5mg/L，生物素0 · lmg/L，甲基亞硝基 脲0.8mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣0.4mg/L，水解蛋白1. Og/L;以及濃度20 %的水稻稻曲病菌粗毒素提取 液，pH值為6.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種水稻稻曲病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述水 稻稻曲病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染水稻稻曲病水稻的穗頸部剪下，清潔表面 后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產(chǎn)生后加入營養(yǎng)瓊脂繼續(xù)培養(yǎng)，得到菌 株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分鐘、過濾、以500~ 1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細菌性基腐病菌粗毒素。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻稻曲病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(3)所述水 稻葉片與β-巰基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的質(zhì)量體積比mg/yL/yLAiLAiL為1:3:3:5:10; 所述兩次離心分散的速率為900rpm。
【文檔編號】A01H1/02GK106086196SQ201610495879
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】孟劍華, 許建中, 安劍石
【申請人】無錫南理工科技發(fā)展有限公司