一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌ytk1及其在煙葉烘烤中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物技術領域，具體公開了一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YTK1及其在煙葉烘烤中的應用。所述菌株于2016年5月6日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），菌種保藏號為GDMCC No：60033。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)菌株YTK1環(huán)境適應性強、能夠耐受高溫生長且長勢好、同時能夠高效降解煙葉淀粉含量及改善煙葉色香味，經(jīng)所述菌株處理過的烘烤煙葉能夠充分降解淀粉，可用于制備煙葉改良噴施菌劑。GDMCC No：6003320160506
【專利說明】
一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌YTK1及其在煙葉烘烤中的應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及微生物技術領域，具體地，涉及一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌YTKl及其在煙葉烘烤中的應用。
【背景技術】
[0002]煙草是葉用經(jīng)濟作物，其生產(chǎn)效益高低主要取決于煙葉質量的優(yōu)劣。近年來隨著新品種選育、集約化培育、平衡施肥等生產(chǎn)新技術的推廣應用，我國烤煙煙葉量水平有所提高，但與國外優(yōu)質煙葉還是有一定的差距。淀粉是煙葉中重要的基礎有機化合物，在鮮煙葉中一般含有25?40%左右，烘烤過程中發(fā)生顯著的變化，碳水化合物的降解、轉化、消耗和積累狀況決定著煙葉內(nèi)在品質和外觀商品等級的優(yōu)劣。煙葉分解產(chǎn)物中，來自淀粉降解產(chǎn)物糖與氣基酸反應的占80%左右，而在煙氣中占85%左右。初烤后煙葉殘留的淀粉是對煙葉色、香、味不利的化合物，嚴重影響煙葉的外觀和內(nèi)在質量。在C/N平衡的條件下，煙葉中淀粉含量越低越好，可溶性糖和還原糖在抽吸時裂解物產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物對平衡由煙堿和含氮化合物抽吸過程中產(chǎn)生的堿性煙氣有積極作用。因此對淀粉代謝的研究已引起了廣泛的關注，同時由于目前國內(nèi)初烤煙葉淀粉含量較高，所以近幾年對淀粉降解研究也正成為一個執(zhí)占
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[0003]芽孢桿菌是土壤和自然界的優(yōu)勢微生物種群，廣泛存在于自然界中，大多為非致病性細菌，對人畜無害，并且很多種類都具有抑制植物病害生長的能力。芽胞桿菌大多為內(nèi)生芽胞，繁殖速度快，抗逆能力強，易定殖在植物根際表面。密集烤房實行機械設備通風，由于葉間隙風速大、強制排濕進而影響煙層溫濕度、風速的分布，造成煙葉失水方式變化，烤后煙葉普遍存在顏色偏淡、成熟度下降、香氣減弱，究其原因煙葉淀粉降解不充分，糖轉化不完全所致。微生物的自養(yǎng)異養(yǎng)需要碳源和氮源，煙葉中就含有微生物生長繁殖的碳源和氮源，十分適于進行微生物發(fā)酵培養(yǎng)，而其自養(yǎng)異養(yǎng)所產(chǎn)生的生理生化作用對煙葉品質造成一定影響。芽孢桿菌能夠在逆境中存活和生長，在較低水分高溫條件下的烘烤煙葉中能夠充分的利用淀粉以及高效產(chǎn)淀粉酶，從而降低煙草淀粉含量，所以篩選耐高溫高效降解淀粉功能微生物在煙草應用上具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供了一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌(feciHtASamyl ol iquefa ciaos)YTKl，所述菌株YTKI能夠附著于煙葉表面，進入煙葉組織，與煙葉葉肉組織共生，在較低濕度條件下利用煙葉淀粉作為自身代謝的能源，以及高效產(chǎn)淀粉酶，充分降解了煙葉淀粉含量，從而改善煙葉品質。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌YTKl在煙葉烘烤中的應用。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的。
[0007]一株解淀粉芽抱桿菌amyloliquefaciens)YVL\，所述菌株YTKl于2016年5月6日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，菌種保藏號為GDMCC No:60033，所述菌株分類命名為解淀粉芽孢桿菌YTKl;保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5層。
[0008]所述菌株YTKl的分離與篩選步驟如下:(I)分離:將采集的新鮮煙葉剪碎，置于滅菌培養(yǎng)皿中，經(jīng)雙氧水浸泡、升汞浸泡、無菌水漂洗后，置于LB液體培養(yǎng)基中37 0C ,120 r/min擴大培養(yǎng)2 d，經(jīng)80 °C水浴30 min殺死非芽孢桿菌，取上述菌液置于LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)2 d，挑取長勢較好的菌落進行傳代培養(yǎng)，再通過簡單染色(石碳酸復紅染色)和顯微鏡鏡檢(油鏡)觀察，將純化菌株接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2?3 d，80 °C水浴30 min后于LB固體培養(yǎng)基上涂平板獲得芽孢桿菌；(2)篩選:將步驟(I)得到的芽孢桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基上，在50?70 °C范圍內(nèi)每隔2 °(:作為一個處理，10個處理，重復3次，恒溫培養(yǎng);刮取菌體，用無菌水稀釋成10—3菌體濃度，取2 yL菌液接種于淀粉瓊脂平板上37 °C培養(yǎng)I?2 d，經(jīng)即配碘液染色，觀察透明圈，獲得降解淀粉功能的芽孢桿菌。
[0009]優(yōu)選地，所述菌株YTKl呈桿狀，產(chǎn)芽孢，菌株YTKl菌落在LB培養(yǎng)基平板上生長速度較快，在液體培養(yǎng)基中形成菌膜，在固體培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色，不透明，表面粗糙，邊緣不規(guī)則。
[0010]優(yōu)選地，所述菌株YTKl對濃度為1.5%NaCl、300 yg/mL氨芐青霉素、100 yg/mL鏈霉素和四環(huán)素、5 yg/mL氯霉素和紅霉素均具有耐受性;對卡拉霉素、慶大霉素和新霉素耐受性小于5 yg/mLo
[0011]優(yōu)選地，所述菌株YTKl能利用以淀粉、吐溫40、吐溫80、L-阿拉伯半糖、D-阿拉伯半糖、鹿糖、D-葡萄糖、麥芽糖、D-甘露糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、蜜二糖、龍膽二糖、D-纖維二糖、棉子糖、木糖、菊糖、松三糖、D-核糖、海藻糖、甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、山梨醇、木糖醇、己六醇、肌醇、半乳糖醇、山梨糖醇、側金盞花醇、甲酸鈉、丙酸鈣、a-酮戊二酸、丙酮酸鈉、羥基苯乙酸、苯甲酸鈉、葡萄糖酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、水楊酸鈉、烏頭酸、蘋果酸、γ-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、水楊苷、甘油、羥甲基纖維素、N-乙酰葡萄糖胺、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、胱氨酸、L-羥脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸為碳源的培養(yǎng)基上生長
優(yōu)選地，所述菌株YTKl的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]本發(fā)明還提供上述的耐高溫解淀粉芽孢桿菌YTKl在煙葉烘烤中的應用。
[0013]優(yōu)選地，所述應用的具體方法為將OD6qq=I的YTKl菌株的菌懸液噴施于烘烤前的煙葉表面。
[0014]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
(I)本發(fā)明篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌YTKl生長速度快、對環(huán)境適應性強、抗逆性強。
[0015](2)本發(fā)明篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌YTKl，具有在煙葉高溫烘烤過程中高效降解淀粉的能力，經(jīng)所述菌株處理過的烘烤煙葉能夠充分降解烘烤煙葉淀粉含量，一定程度上降低煙絲燃吸時產(chǎn)生的焦糊氣味、刺激性和雜氣，增加煙草光亮色澤，有效改善煙草品質，可用于制備煙葉改良噴施菌劑。
【附圖說明】
[0016]圖1為菌株YTKl在點接于淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后經(jīng)即配碘液染色所顯示的淀粉透明圈。
[0017]圖2為菌株YTKl制成的菌懸液噴施于烘烤前的煙葉表面上，再經(jīng)烤房烘烤過后所呈現(xiàn)的煙葉外觀形態(tài)，左側為CK，右圖為經(jīng)YTKl處理后煙葉。
【具體實施方式】
[0018]下面結合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。
[0019]實施例1耐高溫解淀粉芽孢桿菌YTKl的分離和篩選
分離純化:將南雄煙草研究所試驗基地采摘的新鮮煙葉帶回實驗室，稱取5 g新鮮煙葉樣本，用蒸餾水洗凈，然后剪碎葉片置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用3%的雙氧水(H2O2)浸泡4 min(以除去根表面的腐爛物質)，無菌水洗滌一次，再用0.1%的升汞(HgCl2)浸泡5 min，無菌水中振動洗滌5?7次，每次5?10 min，并將最后一次洗滌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，以檢測消毒是否徹底。將表面消毒徹底的煙葉樣本接種于80 ml LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中37 0C ,120 r/min擴大培養(yǎng)2天后，于恒溫循環(huán)水浴槽中設置溫度80 °C水浴30 min，殺死非芽孢菌，用滅菌槍頭吸取50 yLUOO yL和200 yL菌液分別在LB固體培養(yǎng)基上涂平板，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2?3天，觀察菌體的生長情況，用接種環(huán)挑取長勢較好并不同形態(tài)特征的菌苔，用平板劃線法進行反復傳代培養(yǎng)，直至菌落的顏色、形狀、大小、質地和透明度一樣。最后通過簡單染色(石碳酸復紅染色)和顯微鏡鏡檢(油鏡)，進一步觀察其形態(tài)，以長度均一、寬度一致、染色情況統(tǒng)一為菌株純化標準。將純化后的菌株再次接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2?3天，800C水浴30 min后于LB固體培養(yǎng)基上涂平板，若能形成菌落，確認為芽孢菌，于LB固體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，暫存于4 °C冰箱。
[0020]篩選:(I)從冰箱中取出保存的菌株，在超凈工作臺中用經(jīng)酒精燈燒紅冷卻后的接種環(huán)沾取少量菌體，接種于LB固體培養(yǎng)基中，分別放置于不同溫度條件下的電熱恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度設置在50?70 °C范圍內(nèi)，每隔2 °C作為一個處理，共10個溫度處理下進行篩選(每個處理平行重復3次)。
[0021](2)從平板上用燒紅冷卻后的接種環(huán)刮取菌體1/3環(huán)，轉接于裝有I mL無菌蒸餾水的離心管中，再從中吸取100 yL混勾菌懸液轉移至另一裝有900 yL無菌水的離心管中，重復此操作，分別稀釋為10—\ 10—2、10—3菌體濃度，充分振蕩搖勻，于超凈工作臺中取2 yL 10—3菌體溶液點接于淀粉瓊脂平板上(每種處理平行重復3次)，待菌液自然干燥后倒扣固定放置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)I?2天。當菌體長到一定圓形大小時，吸取一定量即配碘液滴在菌落邊緣上，觀察菌落周圍透明圈，如圖1所示。
[0022]試驗結果表明，該菌株在溫度設置范圍內(nèi)60°C以下都能生長且長勢較好，經(jīng)碘液檢測的菌落出現(xiàn)明顯透明圈，說明該菌能夠較好的降解淀粉。因此，采用上述方法成功篩選獲得一株能夠耐受高溫生長且具降解淀粉功能的菌株，命名為YTK1。
[0023]保存:將分離純化后的菌株YTKl在LB平板上培養(yǎng)I?2d后，收集平板上的菌體。保存于15%滅菌甘油管中(-20 0O0
[0024]實施例2解淀粉芽孢桿菌YTKl的鑒定
所述菌株呈桿狀，產(chǎn)芽孢。菌落在LB培養(yǎng)基平板上生長速度較快，液體培養(yǎng)基中形成菌膜，在固體培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色，不透明，表面粗糙，邊緣不規(guī)則。37 °C，生長48小時，菌落直徑8?12 mnupH生長范圍較廣，可耐pH 3?10，最適生長溫度是37°C及最佳生長pH值6?7。對濃度為1.5%NaCl、300 yg/mL氨芐青霉素、100 yg/mL鏈霉素和四環(huán)素、5 yg/mL氯霉素和紅霉素均具有耐受性;而對卡拉霉素、慶大霉素和新霉素耐受性差，低濃度(5 yg/mL)的這幾種抗生素就能抑制其生長。兼性厭氧，能利用以淀粉、吐溫40、吐溫80、L-阿拉伯半糖、D-阿拉伯半糖、鹿糖、D-葡萄糖、麥芽糖、D-甘露糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、蜜二糖、龍膽二糖、D-纖維二糖、棉子糖、木糖、菊糖、松三糖、D-核糖、海藻糖、甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、山梨醇、木糖醇、己六醇、肌醇、半乳糖醇、山梨糖醇、側金盞花醇、甲酸鈉、丙酸鈣、a-酮戊二酸、丙酮酸鈉、羥基苯乙酸、苯甲酸鈉、葡萄糖酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、水楊酸鈉、烏頭酸、蘋果酸、γ-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、水楊苷、甘油、羥甲基纖維素、N-乙酰葡萄糖胺、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、胱氨酸、L-羥脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸為碳源的培養(yǎng)基上生長。
[0025]所述菌株通過16S rDNA擴增和測序，測序結果如SEQ ID NO:1所示，將獲得的DNA序列輸入GenBank進行比對，初步確定所述菌株在分類學中的菌株種屬的位置。結果發(fā)現(xiàn)所述菌株屬于芽孢桿菌屬，與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus a?7_/o_/i<7we/acie/3s)模式菌株DSM7相似性為99.50%。
[0026]因此，通過形態(tài)學特征、生理生化特性及16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株RF2鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus a?j^oJi<7t/e/acie/3s)。將所述菌株保藏已于2016年5月6日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，菌種保藏號為GDMCC No:60033，所述菌株分類命名為解淀粉芽孢桿菌(feciHus amyloliquefaciens)\VL\ ;保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5層。
[0027]實施例3解淀粉芽孢桿菌YTKl在煙葉烘烤過程中降解淀粉的效果
將供試菌株YTKl在芽孢優(yōu)化液體培養(yǎng)基中擴培48 h，取100 mL培養(yǎng)液中的上清菌懸液測定0D6QQ，然后將菌懸液稀釋至OD6qq=I，轉入無菌噴壺中，均勻的噴施于烘烤前的煙葉(同一批次同一品種同一部位)表面上，此處理設為試驗組。對照組在烘烤前煙葉上噴施等量的清水。然后放入烤房進行烘烤，烘烤結束后從烤房取出，觀察煙葉色澤并拍照(如圖2所示)。將烘烤完畢的煙葉采用碘顯色法進行測定煙葉淀粉含量。結果表明:對照組煙葉色澤暗淡無光澤，淀粉含量為61.96±0.7 mg/g;試驗組煙葉色澤光亮，煙葉氣味比對照組更醇香，淀粉含量為42.18±0.5 mg/g，同比對照組煙葉淀粉含量降低了31.92%。
[0028]通過試驗結果可得，解淀粉芽孢桿菌YTKl能夠有效的降解煙葉淀粉含量，主要因為該菌能夠附著于煙葉表面，進入煙葉組織，與煙葉葉肉組織共生，在較低濕度高溫烘烤條件下利用煙葉淀粉作為自身代謝的能源，且高效產(chǎn)淀粉酶，充分降解煙葉淀粉含量，改善煙葉品質。
【主權項】
1.一株耐高溫解淀粉芽孢桿菌(feciHus a?72o2i(7ye/acie/3s)YTKl，其特征在于，所述菌株于2016年5月6日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，菌種保藏號為GDMCCNo:60033ο2.根據(jù)權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTKl呈桿狀，產(chǎn)芽孢，菌落在LB培養(yǎng)基平板上生長速度較快，在液體培養(yǎng)基中形成菌膜，在固體培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色，不透明，表面粗糙，邊緣不規(guī)則。3.根據(jù)權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTKI對濃度為1.5%NaCl、300yg/mL氨芐青霉素、100 yg/mL鏈霉素和四環(huán)素、5 yg/mL氯霉素和紅霉素均具有耐受性;對卡拉霉素、慶大霉素和新霉素耐受性小于5 yg/mLo4.根據(jù)權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTKl能利用以淀粉、吐溫40、吐溫80、L-阿拉伯半糖、D-阿拉伯半糖、鹿糖、D-葡萄糖、麥芽糖、D-甘露糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、蜜二糖、龍膽二糖、D-纖維二糖、棉子糖、木糖、菊糖、松三糖、D-核糖、海藻糖、甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、山梨醇、木糖醇、己六醇、肌醇、半乳糖醇、山梨糖醇、側金盞花醇、甲酸鈉、丙酸鈣、a-酮戊二酸、丙酮酸鈉、羥基苯乙酸、苯甲酸鈉、葡萄糖酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、水楊酸鈉、烏頭酸、蘋果酸、γ-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、水楊苷、甘油、羥甲基纖維素、N-乙酰葡萄糖胺、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、脯氨酸、色氨酸、纈氨酸、絲氨酸、精氨酸、胱氨酸、L-羥脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸為碳源的培養(yǎng)基上生長。5.根據(jù)權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTKl的16SrDNA序列如SEQ IDNO:1所示。6.權利要求1所述的耐高溫解淀粉芽孢桿菌YTKl在煙葉烘烤中的應用。7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用的具體方法為將OD6qq=I的YTKl菌株的菌懸液噴施于烘烤前的煙葉表面上。
【文檔編號】C12R1/07GK106047747SQ201610330522
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】賀廣生, 王勇, 張國華, 譚志遠, 王行, 王軍, 彭桂香
【申請人】中國煙草總公司廣東省公司, 華南農(nóng)業(yè)大學, 中國煙草總公司河南省公司, 廣東省煙草南雄科學研究所