一株代謝工程菌及其在利用多種底物生產(chǎn)香蘭素中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株代謝工程菌的構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明模擬天然香蘭素合成途徑，將相關(guān)基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌K12進(jìn)行基因改造，使其成為具有香蘭素合成能力的代謝工程大腸桿菌E-GV。本發(fā)明公開(kāi)了所述的代謝工程菌在催化多種廉價(jià)、易獲取碳源包括葡萄糖、木糖、甘油和酪氨酸等生產(chǎn)香蘭素中的應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明的代謝工程大腸桿菌可以在48小時(shí)內(nèi)將酪氨酸轉(zhuǎn)化為97.2mg/l香蘭素；在72小時(shí)內(nèi)將葡萄糖、木糖和甘油分別轉(zhuǎn)化為19.3mg/l，13.3mg/l和24.7mg/l香蘭素。本發(fā)明中構(gòu)建的代謝工程菌株具有轉(zhuǎn)化底物廉價(jià)，可以利用酪氨酸、葡萄糖、甘油和木糖等廉價(jià)碳源為底物，降低了生產(chǎn)成本，操作簡(jiǎn)便，菌株傳代穩(wěn)定。具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。CCTCC NO:M 201507720150302
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一株代謝工程菌及其在利用多種底物生產(chǎn)香蘭素中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)模擬天然香蘭素合成途徑來(lái)構(gòu)建的一株大 腸桿菌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)代謝工程菌或者代謝工程大腸桿菌），及應(yīng)用此代謝工程菌轉(zhuǎn)化多種廉 價(jià)的底物酪氨酸、葡萄糖、甘油或木糖生產(chǎn)香蘭素的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 香蘭素（Vanillin，4-羥基-3-甲氧基苯甲醛），又名香草醛，香莢蘭素。香蘭素主 要存在于天然植物香莢蘭中，香莢蘭的豆莢中大約有2%干重的香蘭素。香蘭素被譽(yù)為"香 料皇后"，是世界上產(chǎn)量最大，應(yīng)用最為廣泛的香料之一。香蘭素具有獨(dú)特香氣，在食品、飲 料、香精香料及醫(yī)藥領(lǐng)域中占據(jù)極為重要的地位。在化學(xué)工業(yè)中，香蘭素還被用作鍍鋅槽的 增白劑和鋅電鍍的活性劑，香蘭素也是生產(chǎn)多巴和罌粟堿的基礎(chǔ)原料。目前，全球?qū)ο闾m素 的年需求量已經(jīng)超過(guò)了 16, 000噸。
[0003] 植物提取法和化學(xué)合成法是香蘭素生產(chǎn)最為常用的兩種方法?；瘜W(xué)合成法是利用 丁香酚、木質(zhì)素、乙醛酸和愈創(chuàng)木酚等作為合成底物，其低廉的成本和簡(jiǎn)單的工藝使得這種 方法生產(chǎn)的香蘭素占據(jù)了絕大部分的市場(chǎng)（約90%)。然而，化學(xué)合成法會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán) 境污染，并且合成香蘭素在純度、香氣和安全性等方面都遠(yuǎn)不及天然提取的香蘭素，使得其 價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然香蘭素。植物提取法是從香莢蘭的豆莢中提取，種植區(qū)域的限制、氣候的 影響、高強(qiáng)度的體力勞動(dòng)和較低的產(chǎn)率使得天然香蘭素的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于市場(chǎng)需求，導(dǎo)致天然 香蘭素價(jià)格及其昂貴，達(dá)到合成香蘭素的300倍（高達(dá)4, 000美元/公斤）。
[0004] 美國(guó)FDA規(guī)定，植物或動(dòng)物原料通過(guò)物理、酶法或微生物轉(zhuǎn)化得到的產(chǎn)品被認(rèn)為 是天然的產(chǎn)品。因此，溫和的反應(yīng)條件、簡(jiǎn)單的提取步驟、快速高效生產(chǎn)過(guò)程和清潔無(wú)污染 等優(yōu)勢(shì)使得生物合成法（微生物轉(zhuǎn)化法）成為最具潛力的天然香蘭素合成方法。目前，已 經(jīng)報(bào)道了鏈霉菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌和腸桿菌等微生物可以轉(zhuǎn)化底物生成香 蘭素，這些底物包括了阿魏酸、丁香酚、木質(zhì)素、異丁香酚和香蘭酸等。1999年，Muheim和 Lerch利用西唐鏈霉菌轉(zhuǎn)化阿魏酸得到6. 4g/L香蘭素。2000年Rabenhorst等利用擬無(wú)枝 菌酸轉(zhuǎn)化阿魏酸，獲得11. 5g/L的香蘭素。2007年，華棟梁等利用鏈霉菌轉(zhuǎn)化阿魏酸，借 助吸附樹(shù)脂的作用，獲得19. 2g/L的香蘭素。雖然利用阿魏酸等化合物作為底物，通過(guò)微 生物發(fā)酵制備香蘭素的技術(shù)已經(jīng)得到廣泛的研究和應(yīng)用，但這些化合物較為昂貴，占據(jù)了 生產(chǎn)成本的絕大部分。因此，尋求更為廉價(jià)的底物成為香蘭素生物法制備的一個(gè)重要研究 方向。
[0005] 葡萄糖可由淀粉水解得到，價(jià)格低廉，原料充足。1998年Li等人利用基因重組的 大腸桿菌將葡萄糖通過(guò)磷酸戊糖途徑和莽草酸途徑轉(zhuǎn)化為香草酸，之后，香草酸在胞外經(jīng) 過(guò)粗糙脈孢菌中的芳醛脫氫酶還原，生成微量的香蘭素。2009年Hansen等對(duì)兩種常見(jiàn)的酵 母菌株（粟酒裂殖酵母和釀酒酵母）進(jìn)行代謝工程改造，分別向兩個(gè)菌株中引入3個(gè)和4 個(gè)不同來(lái)源的外源基因，同時(shí)對(duì)原始菌株中降解香蘭素的基因進(jìn)行敲除，改造后的菌株以 葡萄糖為初始底物，可以獲得65mg/L和45mg/L香蘭素。顯而易見(jiàn)，這種生物轉(zhuǎn)化策略底物 經(jīng)濟(jì)，代謝途徑簡(jiǎn)單可控，很有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的可能。但是，Li等人的合成策略需要胞外 純酶的催化和添加昂貴的輔因子，步驟繁瑣，并且產(chǎn)量較低，使得生產(chǎn)效率不高；Hansen等 人的合成策略在酵母中進(jìn)行，而酵母具有較強(qiáng)香蘭素代謝能力，盡管敲除了香蘭素代謝的 相關(guān)基因，但醇脫氫酶依然導(dǎo)致了副反應(yīng)的發(fā)生，使得產(chǎn)量降低和副產(chǎn)物的生成。此外，這 兩種方法都以脫氫莽草酸為前體，在一定層度上破壞了菌株自身的芳香氨基酸合成途徑。 植物中香蘭素天然合成途徑是以初級(jí)代謝產(chǎn)物酪氨酸為前體的，經(jīng)過(guò)苯丙烷途徑可以形成 香蘭素，微生物中并不存在這一合成途徑。這條途徑可以延伸微生物的芳香氨基酸合成途 徑，為香蘭素的生物合成提供了一種新思路，然而對(duì)于這條合成途徑的模擬以及在微生物 中的重構(gòu)還未見(jiàn)報(bào)道。此外，利用除葡萄糖以外的廉價(jià)碳源，如木糖和甘油來(lái)生產(chǎn)香蘭素的 研究也未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一株轉(zhuǎn)化底物廉價(jià)、操作簡(jiǎn)便、遺傳 穩(wěn)定的，用于香蘭素生產(chǎn)的代謝工程大腸桿菌。本發(fā)明所述的應(yīng)用方法以廉價(jià)易獲取碳源 (如甘油、葡萄糖、木糖等）為底物，降低了生產(chǎn)成本，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 首先本發(fā)明提供了構(gòu)建含有酪氨酸解氨酶基因、對(duì)香豆酸羥化酶基因、咖啡酸甲 基轉(zhuǎn)移酶基因、阿魏酰輔酶A合酶基因和烯酰輔酶A水合酶/醛縮酶基因元件的代謝工程 大腸桿菌的方法。
[0009] 所述酪氨酸解氨酶基因能夠與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列雜交，并且編碼具有酪 氨酸解氨酶活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，其中所述酪氨酸解氨酶來(lái)源于西班牙糖絲菌。所述對(duì) 香豆酸羥化酶基因能夠與SEQ ID N0. 2的核苷酸序列雜交，并且編碼具有對(duì)香豆酸羥化酶 活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，其中所述對(duì)香豆酸羥化酶來(lái)源于西班牙糖絲菌。所述咖啡酸甲基轉(zhuǎn) 移酶基因能夠與SEQ ID N0. 3的核苷酸序列雜交，并且編碼具有咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的 蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，其中所述咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于擬南芥。所述阿魏酰輔酶A合酶基因能 夠與SEQ ID N0. 4的核苷酸序列雜交，并且編碼具有阿魏酰輔酶A合酶活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選 地，其中所述阿魏酰輔酶A合酶來(lái)源于鏈霉菌V-1。所述烯酰輔酶A水合酶/醛縮酶基因能 夠與SEQ ID N0. 5的核苷酸序列雜交，并且編碼具有烯酰輔酶A水合酶/醛縮酶活性的蛋 白質(zhì)，優(yōu)選地，其中所述烯酰輔酶A水合酶/醛縮酶來(lái)源于鏈霉菌V-1。
[0010] 代謝工程大腸桿菌E-GV的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0011] (1)利用 PCR技術(shù)，以西班牙糖絲菌（Saccharothrix espanaensis DSM 44229)基 因組為模板，擴(kuò)增得到命名為sam8的酪氨酸解氨酶基因和命名為sam5的對(duì)香豆酸羥化酶 基因（基因序列見(jiàn)序列表）；
[0012] (2)利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟⑴中得到的sam8基因片段和pACY⑶uet-1質(zhì)粒進(jìn)行 雙酶切；優(yōu)選地，雙酶切使用的內(nèi)切酶為Ncol和EcoRI ;
[0013] (3)將步驟（2)中雙酶切后的基因片段和pACY⑶uet-1質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接，構(gòu) 建重組質(zhì)粒pACY⑶uet-sam8 ;優(yōu)選地，連接酶為T(mén)4DNA連接酶；
[0014] (4)利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（1)和⑶中得到的sam5基因片段和pACY⑶uet-sam8 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；優(yōu)選地，雙酶切使用的內(nèi)切酶為Ndel和Xhol ;
[0015] (5)將步驟（4)中雙酶切后的基因片段和pACY⑶uet-sam8質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連 接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYCDuet-sam8-sam5 ;優(yōu)選地，連接酶為T(mén)4DNA連接酶；
[0016] (6)根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將擬南芥（Arabidopsis thaliana)中的咖啡 酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因（comt)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在前端加上T7啟動(dòng)子序列（基因序列見(jiàn)序 列表），用重組PCR的方法進(jìn)行合成，并純化；
[0017] (7)利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（5)中得到的重組質(zhì)粒和步驟（6)中得到的基因片段 進(jìn)行雙酶切；優(yōu)選地，雙酶切使用的內(nèi)切酶為SacI和Notl ;
[0018] (8)將步驟（7)中雙酶切后的基因片段和質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pACYO)uet-sam8-sam5-comt ;優(yōu)選地，連接酶為 T4DNA 連接酶；
[0019] (9)利用PCR技術(shù)，以鏈霉菌（Str印tomyces sp. )V-1 (保藏號(hào)為CCTCC M 2015077)基因組為模板，擴(kuò)增得到命名為fcs的阿魏酰輔酶A合酶基因和命名為ech的烯 酰輔酶A水合酶/醛縮酶基因（基因序列見(jiàn)序列表）；
[0020] (10)利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（9)中得到的ech基因片段和pETDuet-1質(zhì)粒進(jìn)行雙 酶切；優(yōu)選地，雙酶切使用的內(nèi)切酶為Ncol和Hindlll ;
[0021] (11)將步驟（10)中雙酶切后的所述基因片段和質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重 組質(zhì)粒pETDuet-ech ;優(yōu)選地，連接酶為T(mén)4DNA連接酶；
[0022] (12)利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（9)和（11)中得到的fcs基因片段和pETDuet-ech 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；優(yōu)選地，雙酶切使用的內(nèi)切酶為Ndel和Xhol ;
[0023] (13)將步驟（12)中雙酶切后的基因片段和pETDuet-ech質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接， 構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-fcs-ech ;優(yōu)選地，連接酶為T(mén)4DNA連接酶；
[0024] (14)將步驟⑶和（13)中得到重組質(zhì)粒pACYQ)uet-sam8-sam5_comt和 pETDuet-fcs-ech 轉(zhuǎn)化入酪氨酸高產(chǎn)菌株 K12 (pCOLADuet_tyrAfbl-aroGfbl-tktA-ppsA)，經(jīng) 過(guò)篩選和驗(yàn)證后獲得代謝工程大腸桿菌，命名為E-GV。
[0025] 步驟（1)中的擴(kuò)增使用上游引物 sam8_F :5' -catgccatgggcatgacgcaggtcgtggaa cg-3'和 samS-Fj' -catgcatatgaccatcacgtcacctgc-3'，下游弓丨物 sam8-R :5' -catgga attcttatccgaaatccttcccgt-3'和 samS-Rd' -catgctcgagttaggtgccggggttgatca-3' 〇
[0026] 上述步驟（9)中的擴(kuò)增使用上游引物 fcs_F :5 ' -catggaattccatatgcgcaaccag ggtctgggc-3 '和 ech_F :5 ' -catgccatgggcatgagcacagcggtcggcaacggg-3 '，下游弓丨物 fcs-R ：5r -catgctcgagtcagccgaagcggcggcggacctcgcc-3'和 ech-Rd' -catgaagcttcta cttctccgggtcgaaggcgctcag-3; 〇
[0027] 本發(fā)明提供了一株代謝工程大腸桿菌E-GV，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號(hào)為CCTCC M 2015077,保藏單位地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，分類(lèi)命名：大腸桿菌 Escherichia coli。保藏時(shí)間：2015 年 3 月 2 日
[0028] 本發(fā)明還提供了一種利用代謝工程大腸桿菌E-GV生產(chǎn)香蘭素的方法，以酪氨酸、 葡萄糖、甘油或木糖為底物，以代謝工程大腸桿菌E-GV菌株為生物催化劑。其步驟如下：
[0029] (1)斜面培養(yǎng)：將所述代謝工程大腸桿菌E-GV接種到含有卡那霉素、氯霉素和氨 芐霉素的LB固體培養(yǎng)基斜面上，37°C培養(yǎng)11-13小時(shí)；優(yōu)選地，卡那霉素的濃度為100 y g/ mL ;氯霉素的濃度為20 y g/mL ;氨芐霉素的濃度為100 y g/mL ;
[0030] (2)種子培養(yǎng)：將步驟（1)培養(yǎng)菌株E-GV，接種到含有卡那霉素、氯霉素和氨芐霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，制得種子；優(yōu)選地，卡那霉素的濃度為100 y g/mL ;氯 霉素的濃度為20 y g/mL ;氨芐霉素的濃度為100 y g/mL ;
[0031] (3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：將步驟⑵中得到的種子接種到同時(shí)含有卡那霉素、氯霉素、氨芐 霉素和底物的LB或改良M9液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3-5小時(shí)至0D 6。。達(dá)到0. 5-0. 6,加入 IPTG和底物，26°C誘導(dǎo)培養(yǎng)48-72小時(shí)，得到含香蘭素的轉(zhuǎn)化液；優(yōu)選地，卡那霉素的濃度 為100 y g/mL ;氯霉素的濃度為20 y g/mL ;氨芐霉素的濃度為100 y g/mL ;IPTG終濃度為 0. 25mM ；
[0032] 其中：上述步驟⑴~⑶中所述的LB培養(yǎng)基配方是：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/ L, NaCl 10g/L, pH 7. 0 ；
[0033] 上述步驟（3)中所述的改良M9培養(yǎng)基配方是：lg/L NH4Cl，6g/L Na2HP04,3g/ L KH2P04,0.5g/L NaCl，2mmol MgS04*7H20,0.1mmol CaCl2*2H20,0.03mg/L H3B03，lmg/L thiamine, 0. 94mg/L ZnCl2, 0. 5mg/L CoCl2, 0. 38mg/L CuCl2, 1. 6mg/L MnCl2, 3. 6mg/L FeCl2 和0? 5g/L酵母膏。
[0034] (4)香蘭素的提?。簩⒉襟E（3)中制得的轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2以下，加入等 體積乙酸丁酯，混勻后室溫靜置1. 5-2. 5小時(shí)，離心后將上層液體進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的粉 末即為香蘭素；優(yōu)選地，離心轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時(shí)間為15分鐘。
[0035] 進(jìn)一步，步驟（3)中在LB培養(yǎng)基中加入底物酪氨酸的初始濃度為2g/L，反應(yīng)時(shí)間 為48小時(shí)。
[0036] 進(jìn)一步，步驟（3)中在改良M9培養(yǎng)基中加入底物葡萄糖、甘油或木糖的初始濃度 為l〇g/L，反應(yīng)時(shí)間為72小時(shí)。
[0037] 樣品檢測(cè)：將步驟（4)制得的香蘭素粉末，用HPLC和LC-ESI-MS檢測(cè)樣品的純度 和結(jié)構(gòu)。
[0038] 本發(fā)明中構(gòu)建的代謝工程菌株轉(zhuǎn)化底物廉價(jià)，操作簡(jiǎn)便，菌株傳代穩(wěn)定?？梢岳?用酪氨酸、葡萄糖、甘油和木糖等廉價(jià)碳源為底物，香蘭素的最高產(chǎn)量分別為97. 2mg/l， 19. 3mg/l，13. 3mg/l和24. 7mg/l，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)周期為48-72小時(shí)。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例3利用大腸桿菌E-GV轉(zhuǎn)化酪氨酸生產(chǎn)香蘭素中香蘭素的濃 度和重組菌株生長(zhǎng)隨時(shí)間變化圖。
[0040] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例3中香蘭素的LC-ESI-MS檢測(cè)圖譜。
[0041] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例4利用大腸桿菌E-GV轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)香蘭素中香蘭素的濃 度和重組菌株生長(zhǎng)隨時(shí)間變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步的說(shuō)明：下述實(shí)施例是說(shuō)明性的， 不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn) 方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可 從商業(yè)途徑得到。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 代謝工程大腸桿菌E-GV的構(gòu)建：
[0045] 本實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下：
[0046] LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7. 0。在使用 前進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌121°C，20min。
[0047] LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉。在使用前進(jìn)行高溫高壓蒸汽 滅菌 121°C，20min。
[0048] (1)擴(kuò)增酪氨酸解氨酶基因（sam8)和對(duì)香豆酸羥化酶基因（sam5)片段：
[0049] 利用 PCR 技術(shù)，以西班牙糖絲菌（Saccharothrix espanaensis DSM 44229)基因 組為模板，擴(kuò)增得到命名為sam8的酪氨酸解氨酶基因和命名為sam5的對(duì)香豆酸羥化酶基 因（基因序列見(jiàn)序列表）；
[0050] PCR引物：sam8基因上游引物 sam8_F :5' -catgccatgggcatgacgcaggtcgtggaacg-3'，下游引物 sam8-R:5' -catggaattcttatccgaaatccttcccgt-3'。其中下劃線(xiàn)所標(biāo)示的 堿基序列分別是Ncol和EcoRI的酶切位點(diǎn)。sam5基因上游引物sam5_F :5' -catgcatatg accatcacgtcacctgc-3'，下游弓丨物 sam5_R :5' -catgctcgagttaggtgccggggttgatca-3' 〇 其中下劃線(xiàn)所標(biāo)示的堿基序列分別是Ndel和Xhol的酶切位點(diǎn)。
[0051] 將得到的PCR產(chǎn)物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行切膠 回收。
[0052] (2)利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟⑴中得到的sam8基因片段和pACY⑶uet-1質(zhì)粒進(jìn)行 雙酶切；優(yōu)選地，雙酶切使用的內(nèi)切酶為Ncol和EcoRI ;
[0053] 將含有pACYCDuet-1質(zhì)粒的大腸桿菌Transl-Tl按照1 %接種量，接種至5mL LB 液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h。將培養(yǎng)后的菌體利用普通質(zhì)粒小提試劑盒提取 質(zhì)粒，同時(shí)利用NEB的限制性?xún)?nèi)切酶Ncol和EcoRI進(jìn)行雙酶切。
[0054] (3)將步驟（2)中雙酶切后的基因片段和pACY⑶uet-1質(zhì)粒分別用Axygen公司 的 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 進(jìn)行回收，用 T4DNA 連接酶（購(gòu)買(mǎi)自 New England Biolabs公司）進(jìn)行連接，連接在16°C水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為10h。獲得連接后的重組 質(zhì)粒 pACYCDuet_sam8。
[0055] (4)將步驟⑴中得到的sam5基因片段和步驟⑶中得到的pACY⑶uet_sam8質(zhì) 粒分別利用NEB的限制性?xún)?nèi)切酶Ndel和Xhol進(jìn)行雙酶切。將酶切后的sam5基因片段和 pACYCDuet_sam8 質(zhì)粒分別用 Axygen 公司的 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 進(jìn)行切膠回 收。
[0056] (5)將步驟⑷中雙酶切后的基因片段和pACY⑶uet-sam8質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連 接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYCDuet-sam8-sam5 ;優(yōu)選地，連接酶為T(mén)4DNA連接酶；用T4DNA連接酶 (購(gòu)買(mǎi)自New England Biolabs公司）進(jìn)行連接，連接在16°C水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為 10h。獲得連接后的重組質(zhì)粒pACYO)uet-sam8-sam5 〇
[0057] (6)合成咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因（comt)片段：
[0058] 用軟件JCat，根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將擬南芥（Arabidopsis thaliana) 中的咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶comt基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在前端加上T7啟動(dòng)子和SacI酶切位 點(diǎn)，末端加上Notl酶切位點(diǎn)。用軟件DNAWorks設(shè)計(jì)引物，用重組PCR的方法進(jìn)行基因合成， 并用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit對(duì)DNA片段進(jìn)行切膠回收。
[0059] (7)將步驟（6)中得到的comt基因片段和步驟（5)中得到的 pACYCDuet-sam8-sam5質(zhì)粒分別利用NEB的限制性?xún)?nèi)切酶SacI和Notl進(jìn)行雙酶切。
[0060] (8)將步驟（7)中酶切后的comt基因片段和pACYO)uet-sam8-sam5質(zhì)粒分別用 Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行切膠回收，用T4DNA連接酶（購(gòu)買(mǎi)自 New England Biolabs公司）進(jìn)行連接，連接在16°C水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為10h。獲得 連接后的重組質(zhì)粒 pACYCDuet-sam8-sam5-comt 〇
[0061] (9)利用PCR技術(shù)，以鏈霉菌（Str印tomyces sp. )V-1 (保藏號(hào)為CCTCC M 2015077)基因組為模板，擴(kuò)增得到命名為fcs的阿魏酰輔酶A合酶基因和命名為ech的烯 酰輔酶A水合酶/醛縮酶基因（基因序列見(jiàn)序列表）；
[0062] PCR 引物：fcs 基因上游引物 fcs_F :5 ' -catggaattccatatgcgcaaccagggtctgg gc_3'，下游引物 fcs-R :5 ' -catgctcgagtcagccgaagcggcggcggacctcgcc-3'。其中下劃 線(xiàn)所標(biāo)示的堿基序列分別是Ndel和Xhol的酶切位點(diǎn)。ech基因上游引物ech-F W -catg ccatgggcatgagcacagcggtcggcaacggg-3'，下游弓丨物ech_R :5' -catgaagcttctacttctccgg gtcgaaggcgctcag-3'。其中下劃線(xiàn)所標(biāo)示的堿基序列分別是Ncol和Hindlll的酶切位點(diǎn)。
[0063] 將得到的PCR產(chǎn)物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行切膠 回收。
[0064] (10)將含有pETDuet-1質(zhì)粒的大腸桿菌Transl-Tl按照1 %接種量，接種至5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 Oh。將培養(yǎng)后的菌體利用普通質(zhì)粒小提試劑盒（天 根生化科技有限公司）提取質(zhì)粒。
[0065] 利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（9)中得到的ech基因片段和pETDuet-1質(zhì)粒進(jìn)行雙 酶切；優(yōu)選地，雙酶切使用的內(nèi)切酶為Ncol和Hindlll ;將酶切后的ech基因片段和 pETDuet-1質(zhì)粒分別用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行切膠回收。
[0066] (11)將步驟（10)中回收的ech基因片段和質(zhì)粒用T4DNA連接酶（購(gòu)買(mǎi)自New England Biolabs公司）進(jìn)行連接，連接在16°C水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為10h。獲得連接 后的重組質(zhì)粒pETDuet-ech 〇
[0067] (12)將步驟（9)中得到的fcs基因片段和步驟（11)中得到的pETDuet-ech質(zhì) 粒分別利用NEB的限制性?xún)?nèi)切酶Ndel和Xhol進(jìn)行雙酶切。將酶切后的fcs基因片段和 pETDuet-ech 質(zhì)粒分別用 Axygen 公司的 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 進(jìn)行回收。
[0068] (13)將步驟（12)中回收的fcs基因片段和質(zhì)粒用T4DNA連接酶（購(gòu)買(mǎi) 自New England Biolabs公司）進(jìn)行連接，反應(yīng)時(shí)間為10h，獲得連接后的重組質(zhì)粒 pETDuet-fcs-ech〇
[0069] (14)將5 y L步驟⑶中得到的重組質(zhì)粒pACYCDuet-sam8-sam5_comt和5 y L步 驟（13)中得到重組質(zhì)粒pETDuet-fcs-ech通過(guò)熱激的方法轉(zhuǎn)化入酪氨酸高產(chǎn)菌株K12 (pC OLADuet-tyrAfbl-aroGfbl-tktA-ppsA)感受態(tài)細(xì)胞中。將熱激后的菌液涂布到含有l(wèi)OOyg/ mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)。在平板上挑取單菌落至5mL LB液體培養(yǎng)基（含有100 y g/mL卡那霉 素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中，30°C搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分 鐘；將培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，獲得代謝工程大腸桿菌E-GV。
[0070] (15)代謝工程大腸桿菌E-GV的保存：將步驟（14)獲得的代謝工程大腸桿菌E-GV 接種于含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，置于30°C搖床中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘；在無(wú)菌操作下，取過(guò)夜培養(yǎng) 物lmL加入到滅菌的1. 5mL離心管中，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心3min。丟棄上清，用滅菌的15%甘 油溶液將菌體沉淀重懸，制備成為甘油保藏管，于_20°C冰箱中可保存半年至一年。每隔半 年，取出甘油保藏管中保存的代謝工程大腸桿菌E-GV進(jìn)行活化，并重新保存甘油保藏管。
[0071] 實(shí)施例2
[0072] 利用實(shí)施例1制得的代謝工程大腸桿菌E-GV轉(zhuǎn)化酪氨酸生產(chǎn)香蘭素
[0073] 本實(shí)施例中所用的菌株為代謝工程大腸桿菌E-GV(保藏編號(hào)為CCTCC M 2015077)〇
[0074] 本實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下：
[0075] LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7. 0。在使用 前進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌121°C，20min。
[0076] LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉。在使用前進(jìn)行高溫高壓蒸汽 滅菌 121°C，20min。
[0077] 本實(shí)施例使用大腸桿菌E-GV生產(chǎn)香蘭素的步驟如下：
[0078] (1)斜面培養(yǎng)：將代謝工程大腸桿菌E-GV接種到含有卡那霉素、氯霉素和氨芐霉 素的LB固體培養(yǎng)基斜面上（含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐 霉素），37°C培養(yǎng)11-13小時(shí)；
[0079] (2)種子培養(yǎng)：將步驟⑴培養(yǎng)的菌株E-GV，用接種環(huán)接種到5mL LB液體培養(yǎng)基 (含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中進(jìn)行菌株活化， 37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，制得種子；
[0080] (3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：按照1 % (體積比）接種量將步驟⑵中得到的種子接種到50mL LB液體培養(yǎng)基（含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中， 37°C培養(yǎng)3-5小時(shí)至0D6。。達(dá)到0. 5-0. 6,加入0. 2mM IPTG和初始濃度為2g/L的酪氨酸， 26°C誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時(shí)，得到含香蘭素的轉(zhuǎn)化液；
[0081] (4)香蘭素的提?。簩⒉襟E（3)中制得的轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2以下，加入等 體積乙酸丁酯，混勻后室溫靜置1. 5-2. 5小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后將上層液體進(jìn) 行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的粉末即為香蘭素；
[0082] (5)樣品檢測(cè)：將步驟（4)制得的香蘭素粉末，用LC-ESI-MS鑒定樣品結(jié)構(gòu)，鑒定 結(jié)果如圖2所示，確定所得樣品為香蘭素。用HPLC檢測(cè)，圖1為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中香蘭素濃度隨 時(shí)間的變化圖，香蘭素的最高產(chǎn)量為97. 2mg/l ;
[0083] HPLC方法使用Agilentl200液相色譜儀，色譜柱為Eclipse XDB-C18柱 (4. 6X 150mm)，流動(dòng)相A為水（含1 %三氟乙酸），流動(dòng)相B為乙腈（含1 %三氟乙酸），流 速為1111171^11，梯度洗脫程序?yàn)椋?分鐘，95%流動(dòng)相4+5%流動(dòng)相8;8分鐘，20%流動(dòng)相 A+80 %流動(dòng)相B ; 10分鐘，80 %流動(dòng)相A+20 %流動(dòng)相B ; 11分鐘，95 %流動(dòng)相A+5 %流動(dòng)相 B。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為310nm，柱溫為30°C，香蘭素出峰時(shí)間為5. 5分鐘。
[0084] 實(shí)施例3
[0085] 利用代謝工程大腸桿菌E-GV轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)香蘭素
[0086] 本實(shí)施例中所用的菌株為代謝工程大腸桿菌E-GV(保藏編號(hào)為CCTCC M 2015077)〇
[0087] 本實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下：
[0088] LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7. 0。在使用 前進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌121°C，20min。
[0089] LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉。在使用前進(jìn)行高溫高壓蒸汽 滅菌 121°C，20min。
[0090] 改良 M9 培養(yǎng)基：lg/L NH4C1, 6g/L Na2HP04, 3g/L KH2P04, 0? 5g/L NaCl, 2mmol MgS04 ? 7H20, 0. lmmol CaCl2 ? 2H20, 0. 03mg/L H3B03, lmg/L thiamine, 0. 94mg/L ZnCl2, 0? 5mg/L CoCl2, 0? 38mg/L CuCl2, 1. 6mg/L MnCl2, 3. 6mg/L FeCljP 0? 5g/L 酵母膏。
[0091] 本實(shí)施例使用代謝工程大腸桿菌E-GV生產(chǎn)香蘭素的步驟如下：
[0092] (1)斜面培養(yǎng)：將代謝工程大腸桿菌E-GV接種到含有卡那霉素、氯霉素和氨芐霉 素的LB固體培養(yǎng)基斜面上（含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐 霉素），37°C培養(yǎng)11-13小時(shí)；
[0093] (2)種子培養(yǎng)：將步驟⑴培養(yǎng)的菌株E-GV，用接種環(huán)接種到5mL LB液體培養(yǎng)基 (含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中進(jìn)行菌株活化， 37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，制得種子；
[0094] (3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：按照1 % (體積比）接種量將步驟⑵中得到的種子接種到50mL 改良M9培養(yǎng)基（含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中， 37°C培養(yǎng)3-5小時(shí)至0D6。。達(dá)到0. 5-0. 6,加入0. 2mM IPTG和初始濃度為10g/L的葡萄糖， 26°C誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)，得到含香蘭素的轉(zhuǎn)化液；
[0095] (4)香蘭素的提取：將步驟（3)中制得的轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2以下，加入等 體積乙酸丁酯，混勻后室溫靜置1. 5-2. 5小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后將上層液體進(jìn) 行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的粉末即為香蘭素；
[0096] (5)樣品檢測(cè)：將步驟（4)制得的香蘭素粉末，用LC-ESI-MS鑒定樣品結(jié)構(gòu)，確定 所得樣品為香蘭素。用HPLC檢測(cè)，圖3為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中香蘭素濃度隨時(shí)間的變化圖，香蘭素 的最高產(chǎn)量為19. 3mg/l ;
[0097] HPLC方法使用Agilentl200液相色譜儀，色譜柱為Eclipse XDB-C18柱 (4. 6X 150mm)，流動(dòng)相A為水（含1 %三氟乙酸），流動(dòng)相B為乙腈（含1 %三氟乙酸），流 速為1111171^11，梯度洗脫程序?yàn)椋?分鐘，95%流動(dòng)相4+5%流動(dòng)相8;8分鐘，20%流動(dòng)相 A+80%流動(dòng)相B ;10分鐘，80%流動(dòng)相A+20%流動(dòng)相B ;11分鐘，95%流動(dòng)相A+5%流動(dòng)相 B。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為310nm，柱溫為30°C，香蘭素出峰時(shí)間為5. 5分鐘。
[0098] 實(shí)施例4
[0099] 利用代謝工程大腸桿菌E-GV轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)香蘭素
[0100] 本實(shí)施例中所用的菌株為代謝工程大腸桿菌E-GV(保藏編號(hào)為CCTCC M 2015077)〇
[0101] 本實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下：
[0102] LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7. 0。在使用 前進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌121°C，20min。
[0103] LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉。在使用前進(jìn)行高溫高壓蒸汽 滅菌 121°C，20min。
[0104] 改良 M9 培養(yǎng)基：lg/L NH4C1, 6g/L Na2HP04, 3g/L KH2P04, 0? 5g/L NaCl, 2mmol MgS04 ? 7H20, 0. lmmol CaCl2 ? 2H20, 0. 03mg/L H3B03, lmg/L thiamine, 0. 94mg/L ZnCl2, 0? 5mg/L CoCl2, 0? 38mg/L CuCl2, 1. 6mg/L MnCl2, 3. 6mg/L FeCljP 0? 5g/L 酵母膏。
[0105] 本實(shí)施例使用代謝工程大腸桿菌E-GV生產(chǎn)香蘭素的步驟如下：
[0106] (1)斜面培養(yǎng)：將大腸桿菌E-GV接種到含有卡那霉素、氯霉素和氨芐霉素的LB固 體培養(yǎng)基斜面上（含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）， 37°C培養(yǎng)11-13小時(shí)；
[0107] (2)種子培養(yǎng)：將步驟（1)培養(yǎng)的菌株E-GV，用接種環(huán)接種到5mL LB液體培養(yǎng)基 (含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中進(jìn)行菌株活化， 37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，制得種子；
[0108] (3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：按照1 % (體積比）接種量將步驟⑵中得到的種子接種到50mL 改良M9培養(yǎng)基（含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中， 37 °C培養(yǎng)3-5小時(shí)至0D6。。達(dá)到0. 5-0. 6，加入0. 2mM IPTG和初始濃度為10g/L的木糖，26 °C 誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)，得到含香蘭素的轉(zhuǎn)化液；
[0109] (4)香蘭素的提?。簩⒉襟E（3)中制得的轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2以下，加入等 體積乙酸丁酯，混勻后室溫靜置1. 5-2. 5小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后將上層液體進(jìn) 行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的粉末即為香蘭素；
[0110] (5)樣品檢測(cè)：將步驟（4)制得的香蘭素粉末，用LC-ESI-MS鑒定樣品結(jié)構(gòu)，確定 所得樣品為香蘭素。用HPLC檢測(cè)，香蘭素的最高產(chǎn)量為13. 3mg/l ;
[0111] HPLC方法使用Agilentl200液相色譜儀，色譜柱為Eclipse XDB-C18柱 (4. 6X 150mm)，流動(dòng)相A為水（含1 %三氟乙酸），流動(dòng)相B為乙腈（含1 %三氟乙酸），流 速為1111171^11，梯度洗脫程序?yàn)椋?分鐘，95%流動(dòng)相4+5%流動(dòng)相8;8分鐘，20%流動(dòng)相 A+80%流動(dòng)相B ;10分鐘，80%流動(dòng)相A+20%流動(dòng)相B ;11分鐘，95%流動(dòng)相A+5%流動(dòng)相 B。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為310nm，柱溫為30°C，香蘭素出峰時(shí)間為5. 5分鐘。
[0112] 實(shí)施例5
[0113] 利用代謝工程大腸桿菌E-GV轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)香蘭素
[0114] 本實(shí)施例中所用的菌株為代謝工程大腸桿菌E-GV(保藏編號(hào)為CCTCC M 2015077)〇
[0115] 本實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基的組成如下：
[0116] LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7. 0。在使用 前進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌121°C，20min。
[0117] LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉。在使用前進(jìn)行高溫高壓蒸汽 滅菌 121°C，20min。
[0118] 改良 M9 培養(yǎng)基：lg/L NH4C1, 6g/L Na2HP04, 3g/L KH2P04, 0? 5g/L NaCl, 2mmol MgS04 ? 7H20, 0. lmmol CaCl2 ? 2H20, 0. 03mg/L H3B03, lmg/L thiamine, 0. 94mg/L ZnCl2, 0? 5mg/L CoCl2, 0? 38mg/L CuCl2, 1. 6mg/L MnCl2, 3. 6mg/L FeCljP 0? 5g/L 酵母膏。
[0119] 本實(shí)施例使用代謝工程大腸桿菌E-GV生產(chǎn)香蘭素的步驟如下：
[0120] (1)斜面培養(yǎng)：將大腸桿菌E-GV接種到含有卡那霉素、氯霉素和氨芐霉素的LB固 體培養(yǎng)基斜面上（含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）， 37°C培養(yǎng)11-13小時(shí)；
[0121] ⑵種子培養(yǎng)：將步驟⑴培養(yǎng)的菌株E-GV，用接種環(huán)接種到5mL LB液體培養(yǎng)基 (含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中進(jìn)行菌株活化， 37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，制得種子；
[0122] (3)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：按照1 % (體積比）接種量將步驟⑵中得到的種子接種到50mL 改良M9培養(yǎng)基（含有100 y g/mL卡那霉素、20 y g/mL氯霉素和100 y g/mL氨芐霉素）中， 37 °C培養(yǎng)3-5小時(shí)至0D6。。達(dá)到0. 5-0. 6，加入0. 2mM IPTG和初始濃度為10g/L的甘油，26 °C 誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)，得到含香蘭素的轉(zhuǎn)化液；
[0123] (4)香蘭素的提?。簩⒉襟E⑶中制得的轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2以下，加入等 體積乙酸丁酯，混勻后室溫靜置1. 5-2. 5小時(shí)，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后將上層液體進(jìn) 行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的粉末即為香蘭素；
[0124] (5)樣品檢測(cè)：將步驟（4)制得的香蘭素粉末，用LC-ESI-MS鑒定樣品結(jié)構(gòu)，確定 所得樣品為香蘭素。用HPLC檢測(cè)，香蘭素的最高產(chǎn)量為24.7mg/l ;
[0125] HPLC方法使用Agilentl200液相色譜儀，色譜柱為Eclipse XDB-C18柱 (4. 6X 150mm)，流動(dòng)相A為水（含1 %三氟乙酸），流動(dòng)相B為乙腈（含1 %三氟乙酸），流 速為1111171^11，梯度洗脫程序?yàn)椋?分鐘，95%流動(dòng)相4+5%流動(dòng)相8;8分鐘，20%流動(dòng)相 A+80%流動(dòng)相B ;10分鐘，80%流動(dòng)相A+20%流動(dòng)相B ;11分鐘，95%流動(dòng)相A+5%流動(dòng)相 B。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為310nm，柱溫為30°C，香蘭素出峰時(shí)間為5. 5分鐘。
[0126] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng) 造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員 依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書(shū)所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種代謝工程大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所用基因元件為酪氨酸解氨酶基 因、對(duì)香豆酸羥化酶基因、咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因、阿魏酰輔酶A合酶基因和烯酰輔酶A水 合酶/醛縮酶基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的代謝工程大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，其所述酪氨酸 解氨酶基因與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列雜交，并且編碼具有酪氨酸解氨酶活性的蛋白質(zhì)， 其中所述酪氨酸解氨酶來(lái)源于西班牙糖絲菌；所述對(duì)香豆酸羥化酶基因與SEQ ID NO. 2的 核苷酸序列雜交，并且編碼具有對(duì)香豆酸羥化酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述對(duì)香豆酸羥化酶 來(lái)源于西班牙糖絲菌；所述咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因與SEQ ID NO. 3的核苷酸序列雜交，并且 編碼具有咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于擬南芥；所 述阿魏酰輔酶A合酶基因與SEQ ID NO. 4的核苷酸序列雜交，并且編碼具有阿魏酰輔酶A 合酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述阿魏酰輔酶A合酶來(lái)源于鏈霉菌V-1 ;所述烯酰輔酶A水合酶 /醛縮酶基因與SEQ ID N0.5的核苷酸序列雜交，并且編碼具有烯酰輔酶A水合酶/醛縮酶 活性的蛋白質(zhì)，其中所述烯酰輔酶A水合酶/醛縮酶來(lái)源于鏈霉菌V-1。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的代謝工程大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 利用PCR技術(shù)，以西班牙糖絲菌Saccharothrix espanaensis DSM 44229基因組為 模板，擴(kuò)增得到命名為sam8的酪氨酸解氨酶基因和命名為sam5的對(duì)香豆酸羥化酶基因； (2) 利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（1)中得到的sam8基因片段和pACYCDuet-Ι質(zhì)粒進(jìn)行雙酶 切； (3) 將步驟（2)中雙酶切后的基因片段和pACYCDuet-Ι質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重 組質(zhì)粒 pACYCDuet_sam8 ; (4) 利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟⑴和（3)中得到的sam5基因片段和pACY⑶uet-sam8質(zhì) 粒進(jìn)行雙酶切； (5) 將步驟（4)中雙酶切后的基因片段和pACY⑶uet-sam8質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接，構(gòu) 建重組質(zhì)粒 pACYCDuet-sam8_sam5 ; (6) 根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性將擬南芥Arabidopsis thaliana中命名為comt的 咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在前端加上T7啟動(dòng)子序列，用重組PCR的方法 進(jìn)行合成，并純化； (7) 利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（5)中得到的重組質(zhì)粒和步驟（6)中得到的基因片段進(jìn)行 雙酶切； (8) 將步驟（7)中雙酶切后的基因片段和質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pACYCDuet-sam8-sam5_comt ; (9) 利用PCR技術(shù)，以鏈霉菌Str印tomyces sp. V-1保藏號(hào)為CCTCC Μ 206065基因組 為模板，擴(kuò)增得到命名為fcs的阿魏酰輔酶Α合酶基因和命名為ech的烯酰輔酶Α水合酶 /醛縮酶基因； (10) 利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（9)中得到的ech基因片段和pETDuet-Ι質(zhì)粒進(jìn)行雙酶 切； (11) 將步驟（10)中雙酶切后的基因片段和pETDuet-Ι質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重 組質(zhì)粒 pETDuet-ech ; (12) 利用內(nèi)切酶分別對(duì)步驟（11)中得到的fcs基因片段和pETDuet-ech質(zhì)粒進(jìn)行雙 酶切； (13) 將步驟（12)中雙酶切后的基因片段和pETDuet-ech質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建 重組質(zhì)粒 pETDuet-fcs-ech ; (14) 將步驟（8)和（13)中得到重組質(zhì)粒pACYQ)uet-sam8-sam5-comt和 pETDuet-fcs-ech 轉(zhuǎn)化入酪氨酸高產(chǎn)菌株 K12pC0LADuet-tyrAfbl-aroGfbl-tktA_ppsA，經(jīng)過(guò) 篩選和驗(yàn)證后獲得代謝工程大腸桿菌，命名為E-GV。4. 一種根據(jù)權(quán)利要求1的構(gòu)建方法構(gòu)建的代謝工程大腸桿菌E-GV，保藏編號(hào)為CCTCC M2015077，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。5. -種利用代謝工程大腸桿菌生產(chǎn)香蘭素的方法，其特征在于分別以酪氨酸、葡萄糖、 甘油或木糖為底物，以代謝工程大腸桿菌E-GV菌株為生物催化劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用代謝工程大腸桿菌生產(chǎn)香蘭素的方法，其特征在于包括 以下步驟： (1) 斜面培養(yǎng)：將保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2015077的代謝工程大腸桿菌E-GV接種到含有 卡那霉素、氯霉素和氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基斜面上，37°C培養(yǎng)11-13小時(shí)； (2) 種子培養(yǎng)：將步驟（1)培養(yǎng)菌株E-GV，接種到含有卡那霉素、氯霉素和氨芐霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，制得種子； ⑶轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：將步驟⑵中得到的種子接種到同時(shí)含有卡那霉素、氯霉素、氨芐霉素 和底物的LB或改良M9液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3-5小時(shí)至0D6。。達(dá)到0. 5-0. 6,加入IPTG 和底物，26°C誘導(dǎo)培養(yǎng)48~72小時(shí)，得到含香蘭素的轉(zhuǎn)化液； 其中：上述步驟⑴~（3)中所述的LB培養(yǎng)基配方是：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L， NaCl 10g/L, pH 7. 0 ； 上述步驟（3)中所述的改良M9培養(yǎng)基配方是：lg/L NH4C1，6g/L Na2HP04, 3g/L KH2P04, 0· 5g/L NaCl, 2mmol MgS04 · 7H20, 0· lmmol CaCl2 · 2H20, 0· 03mg/L H3B03, lmg/L thiamine, 0. 94mg/L ZnCl2, 0. 5mg/L CoCl2, 0. 38mg/L CuCl2, 1. 6mg/L MnCl2, 3. 6mg/L FeCl2 和0· 5g/L酵母膏。 (4)香蘭素的提取：將步驟（3)中制得的轉(zhuǎn)化液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2以下，加入等體積 乙酸丁酯，混勻后室溫靜置1. 5-2. 5小時(shí)，離心后將上層液體進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的粉末即 為香蘭素。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)香蘭素的方法，其特征在于所述步驟（3)中在LB培養(yǎng)基 中加入底物酪氨酸的初始濃度為2g/L，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)香蘭素的方法，其特征在于所述步驟（3)中在改良M9培 養(yǎng)基中加入底物葡萄糖、甘油或木糖的初始濃度為l〇g/L，反應(yīng)時(shí)間為72小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK106032538SQ201510122147
【公開(kāi)日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2015年3月20日
【發(fā)明人】許平, 倪俊, 陶飛, 張兆斌
【申請(qǐng)人】愛(ài)普香料集團(tuán)股份有限公司, 上海愛(ài)普植物科技有限公司