一種基于dna條形碼技術(shù)的閩南烏龍茶品種鑒定方法
【專利摘要】一種基于DNA條形碼技術(shù)快速鑒定茶葉品種的方法，屬于茶葉質(zhì)量安全領(lǐng)域，用改良的植物DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，再對特定序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、測序，建立閩南烏龍茶的基因庫，將未知品種的閩南烏龍茶的DNA序列與所建的基因庫進(jìn)行同源性分析，可快速鑒定待測閩南烏龍茶品種。經(jīng)改良的植物DNA提取試劑盒提取的茶葉樣品DNA濃度高，電泳條帶清晰；該方法能快速、準(zhǔn)確地鑒定出閩南烏龍茶產(chǎn)品的品種，避免人工感官審評主觀意識的影響和傳統(tǒng)化學(xué)檢測方法的繁雜操作，結(jié)果科學(xué)準(zhǔn)確。
【專利說明】
一種基于DNA條形碼技術(shù)的閩南烏龍茶品種鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及利用DNA條形碼技術(shù)快速鑒定閩南烏龍茶品種的方法，屬于茶葉質(zhì)量 安全領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 烏龍茶是我國的六大茶類之一，一直以來以獨特的滋味和香氣受到大眾的喜愛， 目前，市售閩南烏龍茶的所制品種主要有鐵觀音、黃旦、本山、毛蟹等，雖然這幾個品種都是 國家級的茶樹優(yōu)良品種，品質(zhì)優(yōu)良，但鐵觀首品種制成的閩南烏龍茶由于具有獨特的"觀首 韻"，因而價格較其他品種制成的閩南烏龍茶價格高。近年來閩南烏龍茶以次充好的現(xiàn)象普 遍，消費者通常無法辨別，因此，通過技術(shù)手段來明確鑒定閩南烏龍茶品種、建立規(guī)范的烏 龍茶產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐漸成為茶葉研究的重點和熱點。
[0003] 成品茶是茶葉的實際應(yīng)用形式，因此以市售烏龍茶為研究對象，進(jìn)行分子鑒定進(jìn) 而鑒別其品種，對提尚我國成品茶品種鑒定技術(shù)具有一定的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明在于提供一種利用DNA條形碼技術(shù)鑒定閩南烏龍茶品種的方法，通過該方 法可快速、準(zhǔn)確地鑒定閩南烏龍茶產(chǎn)品的品種，有利于規(guī)范閩南烏龍茶市場。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種用于鑒定閩南烏龍茶品種方法的引物，所述的引物為： 3F:5 '-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3 '； 1R:5'-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3'。
[0006] -種利用DNA條形碼技術(shù)對閩南烏龍茶進(jìn)行品種鑒定的方法，包含以下幾個步驟： (1) 茶樣的準(zhǔn)備:收集不同茶樹品種的制成的閩南烏龍茶茶葉樣品； (2) 茶葉樣品DNA的提取:試劑盒提取植物DNA的步驟為： ① 取植物組織在研缽中加入液氮充分研磨成細(xì)粉;研磨前準(zhǔn)備一個1.5mL的離心管，加 入400μ1緩沖液API和4μ1 RNase室溫備用； ② 轉(zhuǎn)移細(xì)粉20_30mg到1.5mL離心管漩渦振蕩，充分混勻幫助裂解； ③ 65°C水浴lOmin，在水浴過程中顛倒離心管2-3次，混合樣品； ④ 加入130μ1緩沖液AP2，充分混勻，冰上放置5分鐘，14000rpm離心5-10min，小心吸取 上清液到一個新的1.5mL離心管中； ⑤ 計算上清量加入1.5倍體積的AP3/E，立即吹打混勻； ⑥ 將上一步所得的混合物加入一個吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中13000rmp離心 30-60秒，倒掉收集管中的廢液； ⑦ 加入600μ1漂洗液WB，12000rmp離心30秒，棄掉廢液； ⑧ 加入600μ1漂洗液WB，12000rmp離心30秒，棄掉廢液； ⑨ 將吸附柱AC放回空收集管中，13000rmp離心2分鐘，去除漂洗液； ⑩取出吸附柱AC放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 100μΙ洗脫緩沖液 ΕΒ，室溫放置3-5min，12000rmp離心lmin，將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2min， 12000rmp離心lmin;所得的DNA可存放于2-8°C，若要長時間保存可放置于_20°C ; (3) 特定基因序列的PCR擴(kuò)增、純化:matK序列擴(kuò)增選用所述引物3F(5'-CGT-ACA-GTA-CTT-TTG-TGT-TTA-CGA-G-3'WP1R(5'-ACC-CAG-TCC-ATC-TGG-AAA-TCT-TGG-TTC-3'），PCR 擴(kuò)增總體積為20yL，反應(yīng)體系為PCR mix 10yL，引物各lyL，茶葉樣品總DNA lyL，ddH2〇 7μ 1^卩〇?反應(yīng)程序為95°(：預(yù)變性308;561€308,721€308，10個循環(huán) ；881€308,561€308,721€ 30s，25個循環(huán);72°C lOmin;純化PCR產(chǎn)物后送至鉑尚生物公司測序； (4) 序列分析:序列用HMMer注釋法切除5.8和26S端，保留特定序列的全長;經(jīng)BLAST比 對，進(jìn)行同源性分析。
[0007] 步驟(1)中選取不同品種的閩南烏龍茶產(chǎn)品作為實驗對象。
[0008] 步驟(2)中，①②③替換為:取20-30mg的茶葉樣品，用液氮速凍，在液氮中研磨至 粉末，加入已加600yL API緩沖液和6-8yg蛋白酶K的1.5mL離心管中，在42°C恒溫水浴鍋中 水浴15h。
[0009] 步驟(3)對所提取樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得高純度的matK片段。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點在于： 使用改良的植物DNA提取試劑盒，成功提取出一定濃度的樣品DNA，電泳條帶清晰，克服 了原試劑盒和常用植物DNA提取方法提取樣本DNA濃度低、無電泳條帶的情況;將DNA條形碼 技術(shù)應(yīng)用于閩南烏龍茶產(chǎn)品的品種鑒定，極大程度減少了感官審評的造成的誤差，提高產(chǎn) 品品種的鑒定效率，有利于閩南烏龍產(chǎn)品市場的規(guī)范。
【附圖說明】
[0011 ]圖1不同閩南烏龍茶產(chǎn)品的總DNA電泳圖，從左至右分別為鐵觀音A、鐵觀音B、鐵觀 音C、Maker、Maker、金觀音、本山、鐵觀音D、黃金桂、Maker。
[0012] 圖2不同品種的matK序列的PCR產(chǎn)物電泳圖，從右至左分別為DNA maker、鐵觀音、 鐵觀音、本山、本山、黃旦、黃旦、大葉烏龍、大葉烏龍、福建水仙、金觀音、毛蟹、佛手。
【具體實施方式】 [0013] 實施例1 (1)茶樣的準(zhǔn)備:所選樣品為福建省主要閩南烏龍茶產(chǎn)地不同茶樹品種制成的閩南烏 龍茶茶葉樣品，詳細(xì)信息見表1。
[0014] 表1樣品信息表 (2)上述茶葉樣品DNA的提?。禾崛》椒ㄖ饕菍Π聛砩锕镜男滦椭参锘蚪M DNA快速提取試劑盒進(jìn)行改良。試劑盒提取植物DNA的步驟為:①取適量植物組織在研缽中 加入液氮充分研磨成細(xì)粉；研磨前準(zhǔn)備一個1.5mL的離心管，加入400μ1緩沖液API和4μ lRNase室溫備用;②轉(zhuǎn)移細(xì)粉20-30mg到前面準(zhǔn)備的1.5mL離心管漩渦振蕩，充分混勻幫助 裂解;③65°C水浴lOmin，在水浴過程中顛倒離心管3次，混合樣品;④加入130μ1緩沖液AP2， 充分混勾，冰上放置5分鐘，14000rpm離心5-10min，小心吸取上清液到一個新的1.5mL離心 管中；⑤計算上清量加入1.5倍體積的AP3/E，立即吹打混勻;⑥將上一步所得的混合物加入 一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rmp離心50秒，倒掉收集管中的廢液;⑦加入 600μ1漂洗液WB，12000rmp離心30秒，棄掉廢液;⑧加入600μ1漂洗液WB，12000rmp離心30秒， 棄掉廢液;⑨將吸附柱AC放回空收集管中，13000rmp離心2分鐘，盡量去除漂洗液;⑩取出吸 附柱AC放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 100μΙ洗脫緩沖液EB，室溫放置 4min，12000rmp離心lmin，將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rmp離心 lmin。所得的DNA可存放于2-8°C，若要長時間保存可放置于_20°C。
[0015] 改良的步驟為:取20-30mg的茶葉樣品，用液氮速凍，在液氮中研磨至粉末，加入已 加600μ1 API緩沖液和6-8yg蛋白酶K的1.5mL離心管中，在42°C恒溫水浴鍋中水浴15h，后續(xù) 步驟參照艾德來生物公司的新型植物基因組DNA快速提取試劑盒的說明書中的步驟④-⑩， 最后加入3ylRNase在37°C水浴鍋中水浴30min。茶葉樣品DNA的提取:提取方法主要是對艾 德來生物公司的新型植物基因組DNA快速提取試劑盒進(jìn)行改良。先取20-30mg的茶葉樣品， 用液氮速凍，在液氮中研磨至粉末，加入已加600μ1 API緩沖液和6-8yg蛋白酶K的1.5mL離 心管中，在42°C恒溫水浴鍋中水浴15h，后續(xù)步驟參照艾德來生物公司的新型植物基因組 DNA快速提取試劑盒的說明書。
[0016] (3 )特定基因序列的PCR擴(kuò)增、純化:matK序列擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增總體積為20yL，反應(yīng)體 系為PCR mix 10yL(Genstar Biosolutions Co.)，上下游引物各 lyL，茶葉樣品總 DNA lyL， ddH20 YyUPCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性3〇8;561€3〇8,721€3〇8，10個循環(huán) ；881€3〇8,561€ 3〇8,721：3〇8,25個循環(huán) ;72°(：1〇1^11。純化?0?產(chǎn)物送至鉑尚生物公司測序。
[0017] (4)序列分析:測序后得到的序列利用Chromas軟件檢查峰圖，要求峰圖質(zhì)量達(dá)到 數(shù)據(jù)分析要求，再利用DNASTAR進(jìn)行正反序列的拼接。用所得的序列建立閩南烏龍茶產(chǎn)品的 基因庫。數(shù)據(jù)庫中的基因序列片段用軟件MAFFT7.237自動比對，并借助軟件優(yōu)化比對結(jié)果。 將比對結(jié)果導(dǎo)入Mega6.0軟件，計算出閩南烏的種內(nèi)最大變異值。
[0018] (5)未知品種閩南烏龍茶鑒定:選擇未知品種的閩南烏龍茶，按照步驟(2)提取其 總DNA，再根據(jù)步驟(3)進(jìn)行操作，獲得未知品種閩南烏龍茶的DNA條形碼序列，與步驟(4)所 建的基因庫進(jìn)行比對。主要根據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，遺傳距離最小的對應(yīng)的物種即為待測閩 南烏龍茶的品種。（建議對具體的實施結(jié)果進(jìn)行分析） 表l.matK通用引物序列
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修 飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于鑒定閩南烏龍茶品種方法的引物，其特征在于:所述的引物為： 3F:5 '-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3 '； IR:5'-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3'。2. -種基于DNA條形碼技術(shù)的閩南烏龍茶品種鑒定方法，其特征在于:所述方法包括以 下步驟： (1) 茶樣的準(zhǔn)備:收集不同茶樹品種的制成的閩南烏龍茶茶葉樣品； (2) 茶葉樣品DNA的提取:試劑盒提取植物DNA的步驟為： ① 取植物組織在研缽中加入液氮充分研磨成細(xì)粉;研磨前準(zhǔn)備一個1.5mL的離心管，加 入400μ1緩沖液APl和4μ1 RNase室溫備用； ② 轉(zhuǎn)移細(xì)粉20_30mg到1.5mL離心管漩渦振蕩，充分混勻幫助裂解； ③ 65°C水浴lOmin，在水浴過程中顛倒離心管2-3次，混合樣品； ④ 加入130μ1緩沖液AP2,充分混勻，冰上放置5分鐘，HOOOrpm離心5-10min，小心吸取 上清液到一個新的1.5mL離心管中； ⑤ 計算上清量加入1.5倍體積的AP3/E，立即吹打混勻； ⑥ 將上一步所得的混合物加入一個吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中13000rmp離心 30-60秒，倒掉收集管中的廢液； ⑦ 加入600μ1漂洗液WB，12000rmp離心30秒，棄掉廢液； ⑧ 加入600μ1漂洗液WB，12000rmp離心30秒，棄掉廢液； ⑨ 將吸附柱AC放回空收集管中，13000rmp離心2分鐘，去除漂洗液； ⑩ 取出吸附柱AC放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 100μΙ洗脫緩沖液 EB，室溫放置3-5min，12000rmp離心Imin，將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2min， 12000rmp離心lmin;所得的DNA可存放于2-8°C，若要長時間保存可放置于_20°C ; (3) 特定基因序列的PCR擴(kuò)增、純化:matK序列擴(kuò)增選用權(quán)利要求1中所述引物3F(5'_ CGT-ACA-GTA-CTT-TTG-TGT-TTA-CGA-G-3，）和1R(5，-ACC-CAG-TCC-ATC-TGG-AAA-TCT-TGG-17(：-3'），？0財廣增總體積為2(^1^反應(yīng)體系為?0?1^11(^1^引物各叫1^茶葉樣品總0嫩1 yL，CldH2O 7yL;PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性30s; 56°C30s，72°C30s，10個循環(huán)；88°C30s，56°C 3〇8,721：3〇8,25個循環(huán);72°(：1〇1^11;純化?0?產(chǎn)物后送至鉑尚生物公司測序 ； (4) 序列分析:序列用HMMer注釋法切除5.8和26S端，保留特定序列的全長;經(jīng)BLAST比 對，進(jìn)行同源性分析。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于DNA條形碼技術(shù)的閩南烏龍茶品種鑒定方法，其特征 在于:步驟(1)中選取不同品種的閩南烏龍茶產(chǎn)品作為實驗對象。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于DNA條形碼技術(shù)的閩南烏龍茶品種鑒定方法，其特 征在于:步驟(2)中，①②③替換為:取20-30mg的茶葉樣品，用液氮速凍，在液氮中研磨至粉 末，加入已加600yL APl緩沖液和6-8yg蛋白酶K的1.5mL離心管中，在42°C恒溫水浴鍋中水 浴 15h〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于DNA條形碼技術(shù)的閩南烏龍茶品種鑒定方法，其特征 在于:步驟(3)對所提取樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得高純度的matK片段。6. -種如權(quán)利要求1所述的引物在鑒定閩南烏龍茶品種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK105950749SQ201610400202
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】孫威江, 郭義紅, 陳志丹
【申請人】福建農(nóng)林大學(xué)