迷你蛋白及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一類迷你蛋白及其應(yīng)用。所述迷你蛋白以白蛋白結(jié)合域的3?α螺旋束為骨架蛋白，并且在所述骨架蛋白的三維結(jié)構(gòu)表面、N端、C端中的至少一處引入有陽離子性氨基酸，并經(jīng)所述陽離子性氨基酸至少連接p53與MDM2/MDMX結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點。本發(fā)明的迷你蛋白兼具入胞以及與白蛋白、MDM2/MDMX結(jié)合的能力，并可良好抑制p53和MDM2/MDMX之間的相互作用，可用于制備抗癌藥物等，可用于規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用。
【專利說明】
迷你蛋白及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011 本發(fā)明涉及一類迷你蛋白，特別是一種可用于擔(dān)當(dāng)MDM2/MDMX和p53間相互作用抑 制劑的迷你蛋白，且此類迷你蛋白同時具有結(jié)合血清白蛋白的能力。
【背景技術(shù)】
[0002] p53是人類最重要的抑癌基因之一，由其表達(dá)產(chǎn)生的P53蛋白是抑癌功能執(zhí)行者。 P53通過參與調(diào)控細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡，抑制不正常或潛在腫瘤細(xì)胞的增 殖。所有腫瘤的發(fā)生發(fā)展都伴隨P53的失活或缺失，而通過恢復(fù)p53的活性則能達(dá)到抗腫瘤 效果。除了 P53基因缺失、突變引起的p53蛋白失活，還有一部分腫瘤并未發(fā)生p53基因的突 變，但由于受負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白的影響，導(dǎo)致P53活性結(jié)構(gòu)域被封閉或被泛素化降解，因此無法 阻止腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。
[0003] MDM2(鼠雙微粒體murine double minute2)是一類重要的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白。其既能 通過結(jié)合P53蛋白的反式激活結(jié)構(gòu)域抑制其轉(zhuǎn)錄因子活性，又能通過其E3泛素連接酶的活 性介導(dǎo)P53蛋白降解。MDM2的同源蛋白MDMX同樣起著下調(diào)p53水平的功能。正常細(xì)胞內(nèi)P53與 MDM2/MDMX處于一種負(fù)反饋式的平衡狀態(tài)，部分腫瘤過高表達(dá)MDM2/MDMX破壞了這一平衡而 導(dǎo)致p53失活。
[0004] 因此，抑制MDM2蛋白和p53相互作用是當(dāng)前國外腫瘤治療研究中的一個熱點?；?P53-MDM2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息，模擬結(jié)合態(tài)的ρ53 (α螺旋結(jié)構(gòu))得到同樣能特異性結(jié)合MDM2的 分子，通過競爭性抑制Ρ53與MDM2結(jié)合，使得ρ53處于游離的活性狀態(tài)，從而實現(xiàn)抗腫瘤的目 的。根據(jù)這一作用原理，此類功能分子被稱為P53-MDM2抑制劑。此后解析出的p53-MDMX復(fù)合 物的結(jié)構(gòu)顯示它們的結(jié)合方式與P53-MDM2結(jié)合方式幾乎相同。因此，針對MDM2設(shè)計的抑制 劑可能同樣能夠抑制P53-MDMX相互作用。
[0005] 目前針對P53-MDM2/MDMX研究較多的主要有小分子化合物及多肽類抑制劑。小分 子抑制劑由于其設(shè)計靈活多樣，滲透性好，易到達(dá)病灶位置等優(yōu)點。如：羅氏公司從2004年 報道了第一個用于抑制MDM2的小分子抑制劑以來，從未間斷此類抑制劑的研發(fā)工作，其開 發(fā)出的Nutlins小分子抑制劑2010年即已進(jìn)入I期臨床實驗階段，其他制藥公司的小分子抑 制劑也相繼進(jìn)入I期臨床實驗，但都處在驗證階段。小分子化合物體積較小，所含的功能基 團(tuán)較少，很難滿足同時與多個位點相互作用，另外其不穩(wěn)定易被代謝及組織靶向性差等缺 點，因此應(yīng)用前景不是很樂觀。多肽類抑制劑由于其結(jié)構(gòu)種類多變和較多的側(cè)鏈基團(tuán)，往往 結(jié)合或拮抗靶蛋白的能力更強(qiáng)、特異性更好。2013年，羅氏公司開發(fā)出了一種采用環(huán)化方式 來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的α螺旋短肽雙抑制劑，以解決線性多肽生理環(huán)境下極易被酶降解而不穩(wěn)定的 缺點。但是，事實上絕大多數(shù)P53-MDM2/MDMX多肽抑制劑的研究受到很大限制，主要有兩大 原因：第一，p53、MDM2/MDMX位于細(xì)胞內(nèi)，但多肽本身不具有入胞能力;第二，進(jìn)入體內(nèi)后，抑 制劑的體內(nèi)循環(huán)時間太短，易被腎臟代謝排出體外，無法發(fā)揮藥效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的之一在于提供一類迷你蛋白或其突變體，其具有入胞能力和結(jié) 合血清白蛋白的能力，在體內(nèi)循環(huán)滯留時間長，可用于抑制MDM2/MDMX和p53之間相互作用， 以便治療癌癥，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。
[0007] 本發(fā)明的目的之二在于提供所述迷你蛋白的用途。
[0008] 為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：
[0009] 本發(fā)明實施例提供了一類迷你蛋白，其以白蛋白結(jié)合域的3_〇螺旋束為骨架蛋白， 所述骨架蛋白的三維結(jié)構(gòu)表面、N端、C端中的至少一處引入有陽離子性氨基酸，并且所述骨 架蛋白還經(jīng)所述陽離子性氨基酸至少連接P53與MDM2/MDMX結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點。
[0010] 進(jìn)一步的，所述骨架蛋白包括天然存在的或人工合成的3-α螺旋迷你蛋白。
[0011] 進(jìn)一步的，所述陽離子性氨基酸分布于所述迷你蛋白的Ν端和/或C端。
[0012] 進(jìn)一步的，所述陽離子性氨基酸分布于3_〇螺旋束的外表面。
[0013] 進(jìn)一步的，所述陽離子性氨基酸包括精氨酸或賴氨酸。
[0014] 進(jìn)一步的，所述骨架蛋白的三維結(jié)構(gòu)表面的凈電荷與所述迷你蛋白自身分子量的 比值大于1。
[0015]進(jìn)一步的，所述Ρ53與MDM2/MDMX結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點為苯丙氨酸(F)、酪氨酸 (Υ)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)，且該四個關(guān)鍵氨基酸位點處于同一個α螺旋束上。
[0016]進(jìn)一步的，所述苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸位點沿從Ν端到C端的方向依次 分布在同一個α螺旋束上的第η、(η+3)、(η+4)、(η+7)個位點，η為正整數(shù)。
[0017 ]本發(fā)明實施例提供了所述的迷你蛋白在制備用于抑制MDM2/MDMX和ρ 5 3之間相互 作用的抑制劑中的用途。
[0018] 本發(fā)明實施例提供了一種Ρ53與MDM2/MDMX相互作用的抑制劑，其包含所述迷你蛋 白。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點至少在于:提供的迷你蛋白兼具入胞以及與白蛋 白、MDM2/MDMX的結(jié)合能力，并可良好抑制ρ5 3和MDM2/MDMX之間的相互作用，并可用于制備 抗癌藥物等，且可進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用。
【附圖說明】
[0020] 圖1本發(fā)明一典型實施方案之中一類迷你蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021] 圖2a-圖2b分別是本發(fā)明實施例1中野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接的小蛋白與MDM2/ MDMX結(jié)合的熒光偏振檢測圖譜；
[0022]圖3a_圖3b分別是本發(fā)明實施例2中野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接的小蛋白與白蛋白的 親和能力檢測圖譜；
[0023] 圖4是本發(fā)明實施例3中野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基 酸性氨基酸引入(兩者都引入)的各種小白蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)測定結(jié)果；
[0024] 圖5是本發(fā)明實施例4中野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基 酸性氨基酸引入的各種小白蛋白的溶血檢測結(jié)果；
[0025] 圖6是本發(fā)明實施例5中野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基 酸性氨基酸引入的各種小白蛋白的入胞能力比較結(jié)果；
[0026] 圖7是本發(fā)明實施例6中野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基 酸性氨基酸引入的各種小白蛋白的穩(wěn)定性檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0027]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的諸多缺陷，本案發(fā)明人經(jīng)長期研究和大量實踐，得以提出本發(fā)明 的技術(shù)方案，其主要是通過核酸定點突變、分子克隆及多肽合成等技術(shù)，將P53與MDM2/MDMX 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點"嫁接"在白蛋白結(jié)合域的3_〇螺旋束骨架蛋白上，形成一類迷你蛋 白（其典型結(jié)構(gòu)可參閱圖1)，使其既保留與白蛋白的結(jié)合能力，又具有與MDMD2/MDMX的結(jié)合 能力，發(fā)揮P53和MDM2/MDMX的抑制劑作用。
[0028]前述的"抑制相互作用"或"抑制劑作用"意味著阻止或減少一種或多種分子、肽、 蛋白、酶或受體的直接或間接的結(jié)合，或者阻止或減少一種或多種分子、肽、蛋白、酶或受體 的正?；钚浴?br>[0029]前述的"p53和MDM2/MDMX的抑制劑"是用來描述所述迷你蛋白及其突變體能與 MDM2/MDMX結(jié)合，從而釋放p53,使p53行使其抑癌功能，從而殺死癌細(xì)胞的能力。
[0030] 前述的"MDM2/MDMX"是指mdm2/mdmx基因表達(dá)而得到的蛋白。在此術(shù)語的意義內(nèi)， MDM2/MDMX包括所有被mdm2/mdmx編碼的蛋白，其突變體、另路剪接蛋白和磷酸化蛋白以及 包括其它動物的MDM2/MDMX同源物及類似物，例如人同源HDM2或人類似物HDMX。
[0031] 以下結(jié)合若干實施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋說明。
[0032] 如下各實施例中述及的迷你小蛋白均由多肽合成公司合成提供。
[0033]表1實施例1-6中各小蛋白的序列
[0034]
[0035] 實施例1野生型及關(guān)鍵氨基酸嫁接的小蛋白與MDM2/MDMX的結(jié)合檢測
[0036] 取含50nM FITC-p53與luM MDM2/MDMX的混合物，將野生型（1號）及關(guān)鍵氨基酸嫁 接的小蛋白（2號)及p53多肽分別從37.5uM倍比稀釋12個濃度，并與前述混合物相互作用半 小時，再在酶標(biāo)儀上檢測其焚光偏振強(qiáng)度，計算前述小蛋白與MDM2/MDMX的抑制濃度，結(jié)果 可參閱圖2。
[0037]實施例2野生型及關(guān)鍵氣基酸嫁接的小蛋白與白蛋白的未和能力檢測 [0038]首先，將白蛋白HSA(20ug/ml)固定在CM5芯片上，將實施例1中所述的1號、2號小蛋 白配制成濃度為0、〇. 2ug/ml、0.4ug/ml、0.8ug/ml、1.6ug/ml、3.2ug/ml的溶液，這些溶液中 采用的緩沖液均為HBS-EP。
[0039] 實施例3野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基酸性氨基酸引入 的各種小白蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)測定
[0040] 將前述的1號、2號蛋白、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基酸性氨基酸引入的3號、4 號、5號小蛋白用F>BS緩沖液配制成濃度為0.4mg/ml的溶液，置于圓二色光譜儀上，檢測其α 螺旋情況，測試結(jié)果可參閱圖4。
[0041]實施例4野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基酸性氨基酸引入 的各種小白蛋白的溶血檢測
[0042] 將前述的1號、2號、3號、4號、5號小蛋白用PBS分別配成濃度為150uM、75uM、 37 · 5uM、18 · 75uM、9 · 375uM、4 · 6875uM、0uM的、且含5%Triton100 的溶液，并與 107個紅細(xì)胞 37 °C共孵育lh，檢測450nm處的吸收值，結(jié)果可參閱圖5。
[0043]實施例5野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基酸性氨基酸引入 的各種小白蛋白的入胞能力比較
[0044]將前述的1號、2號、3號、4號、5號小蛋白用PBS分別配成濃度為50uM的溶液，并與銥 化合物Ir(ppy)(H2〇)2以1:1標(biāo)記，使其標(biāo)記上綠色焚光。將由此形成的標(biāo)記蛋白用高糖DMEM 培養(yǎng)基稀釋至濃度為2uM，并與Hela細(xì)胞在37°C共孵育24小時，再于共聚焦顯微鏡及流式細(xì) 胞儀上檢測其入胞情況，結(jié)果可參閱圖6。
[0045]實施例6野生型、關(guān)鍵氨基酸嫁接、關(guān)鍵氨基酸嫁接及陽離子氨基酸性氨基酸引入 的各種小白蛋白的穩(wěn)定性檢測
[0046] 將前述的1號、2號、3號、4號、5號小蛋白用roS分別配成濃度為30uM、15uM、7.5uM、 3.75uM的溶液，并與與純血清37°C共孵育48h，再以SDS-PAGE電泳定量小蛋白的保留率，結(jié) 果可參閱圖7。
[0047]應(yīng)當(dāng)理解，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì) 節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。 因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范 圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范 圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一類迷你蛋白，其特征在于所述迷你蛋白以白蛋白結(jié)合域的3-〇螺旋束為骨架蛋白， 所述骨架蛋白的三維結(jié)構(gòu)表面、N端、C端中的至少一處引入有陽離子性氨基酸，并且所述骨 架蛋白還經(jīng)所述陽離子性氨基酸至少連接P53與MDM2/MDMX結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的迷你蛋白，其特征在于:所述骨架蛋白包括天然存在的或人工 合成的3-α螺旋迷你蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的迷你蛋白，其特征在于:所述陽離子性氨基酸分布于所述迷你 蛋白的Ν端和/或C端。4. 根據(jù)權(quán)利要求1、3或4所述的迷你蛋白，其特征在于:所述陽離子性氨基酸分布于3-α 螺旋束的外表面。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的迷你蛋白，其特征在于:所述陽離子性氨基酸包括 精氨酸或賴氨酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的迷你蛋白，其特征在于:所述骨架蛋白的三維結(jié)構(gòu) 表面的凈電荷與所述迷你蛋白自身分子量的比值大于1。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的迷你蛋白，其特征在于:所述ρ53與MDM2/MDMX結(jié)合的關(guān)鍵氨基 酸位點分別為苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Υ)、色氨酸(W)、亮氨酸(L)，該四個關(guān)鍵氨基酸位點處 于同一個α螺旋束上。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的迷你蛋白，其特征在于:所述苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨 酸位點沿從Ν端到C端的方向依次分布在同一個α螺旋束上的第η、（η+3)、（η+4)、（η+7)個位 點，η為正整數(shù)。9. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述迷你蛋白在制備用于抑制MDM2/MDMX和ρ53之間相互作 用的抑制劑中的用途。10. -種ρ53與MDM2/MDMX相互作用的抑制劑，其特征在于包含權(quán)利要求1-9中任一項所 述的迷你蛋白。
【文檔編號】C07K14/47GK105936646SQ201610072523
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年2月2日
【發(fā)明人】費浩, 賈俊麗, 丁皓中
【申請人】中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所