專利名稱：G－eGFP蛋白及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是一種新的綠色熒光蛋白和細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白G的融合表達(dá)的蛋白(G-eGFP)，以及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前細(xì)胞內(nèi)蛋白定位及基因表達(dá)的檢測方法大多需要有底物或輔助因子，包括利用編碼半乳糖苷酶、螢火蟲熒光酶、細(xì)菌熒光酶的融合基因進(jìn)行檢測，但這些方法在活組織的應(yīng)用十分有限。目前用于抗體標(biāo)記的熒光素主要是異硫氰酸熒光素FITC或羅達(dá)明RB200。但這兩種熒光素都必須與相應(yīng)的二抗進(jìn)行偶聯(lián)之后才能應(yīng)用于蛋白的亞細(xì)胞定位中，偶聯(lián)步驟復(fù)雜，其效率關(guān)系到最終的結(jié)果，同時，化學(xué)熒光素也存在一定的低毒性和不穩(wěn)定性。而eGFP蛋白對細(xì)胞生長卻無毒，且不需要任何底物或輔助因子來發(fā)光。
維多利亞水母的綠色熒光蛋白(GFP)是一個含有238個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為26，888D的蛋白(Prasher D C，Eckenrode VK，Ward WW，Prendergast FG，Cormier MJ.1992.Primary structure of the Aequorea victoriagreen-fluorescent protein.Gene.111(2)229-33.)。因?yàn)镚FP在各種環(huán)境中穩(wěn)定，而且具有光激發(fā)的性質(zhì)(March et al.，2003.Biotechnological applicationsofgreen fluorencent protein.Appl Microbiol Biotechnol，62303-315)，因而在各種生物系統(tǒng)中被廣泛應(yīng)用。同時，具有不同光譜的GFP突變體以及GFP相關(guān)的蛋白已經(jīng)得到發(fā)展，其中增強(qiáng)型(enhanced)GFP突變體(eGFP)的熒光比野生型GFP強(qiáng)35倍。應(yīng)用共聚焦顯微鏡或更便利的熒光顯微鏡來檢測GFP與目標(biāo)蛋白或功能域的融合蛋白是十分方便的。
蛋白G是一個能結(jié)合免疫球蛋白(IgG)的細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白，從鏈球菌中分離得到。是檢測IgG的有力試劑，包括人、牛、兔、羊、鼠的IgG(Akerstrom B，Bbodin T，Reis K and Bjorck L.1985.Protein GA powerful toolfor binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies.TheJournal of immunology135(4)2589-92)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種G-eGFP融合蛋白及其制備方法和在結(jié)合抗體和亞細(xì)胞定位的應(yīng)用。
一種G-eGFP融合蛋白，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，該蛋白是蛋白G與eGFP的融合蛋白。
所述的G-eGFP融合蛋白，其編碼的蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ IDNO.2所述的氨基酸序列。
一種具有所述的G-eGFP融合蛋白的活性多肽。該活性多肽的制備方法，包括(a)將編碼的具有G-eGFP融合蛋白的多肽的核苷酸序列，即蛋白G的核苷酸序列與eGFP核苷酸序列，可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成G-eGFP融合蛋白的表達(dá)載體；(b)將步驟(a)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成G-eGFP融合蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)G-eGFP融合蛋白的條件下，培養(yǎng)步驟(b)的重組細(xì)胞；(d)分離出具有G-eGFP融合蛋白活性的多肽。
所述的適合表達(dá)G-eGFP融合蛋白的條件為25-37℃下培養(yǎng)至生長對數(shù)期OD600＝0.3-0.7，加入IPTG至終濃度為0.1-1mM，在26-37℃，180-240rpm/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)8-18h。
本發(fā)明還提供了一種分離的具有活性的G-eGFP融合蛋白的最終表達(dá)產(chǎn)物；它包括具有蛋白G的多肽，或其活性片段，或其活性衍生物，以及eGFP的多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。
本發(fā)明還提供了一種載體，它含有所述G-eGFP融合蛋白的核苷酸序列；本發(fā)明還提供了一種含有所述G-eGFP融合蛋白的核苷酸序列載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種所述的G-eGFP融合蛋白在亞細(xì)胞定位中的應(yīng)用。
本發(fā)明利用蛋白G能結(jié)合抗體(免疫球蛋白)和eGFP能激發(fā)強(qiáng)綠色熒光的特性得到了G-eGFP融合蛋白的活性多肽，該多肽可以應(yīng)用于生物化學(xué)免疫定位、亞細(xì)胞定位、抗體純化。
本發(fā)明得到的融合蛋白為蛋白G與eGFP的融合產(chǎn)物，在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”是指，該DNA片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來；還指該DNA片段或蛋白產(chǎn)物已經(jīng)于天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“G-eGFP融合蛋白或(多肽)編碼序列”是指編碼具有G-eGFP融合蛋白的多肽的核苷酸序列。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳的至少50％，更佳的至少80％，最佳的至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“G-eGFP融合蛋白”是指具有有蛋白G的核苷酸序列與eGFP核苷酸序列的多肽。該術(shù)語還包括具有G-eGFP融合蛋白相同功能的序列的變異形式，這些變異形式包括(但并不限于)若干個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括G-eGFP融合蛋白的片段和衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、重復(fù)序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度下能與G-eGFP融合蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白，以及利用抗G-eGFP融合蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
發(fā)明還提供了G-eGFP融合蛋白或多肽的類似物，這些類似物與G-eGFP融合蛋白多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工種或進(jìn)一步加工步驟種進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括G-eGFP融合蛋白多肽編碼序列及其片段的反義序列，這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)G-eGFP融合蛋白的表達(dá)。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞，較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如Tn細(xì)胞、CHO細(xì)胞。COS細(xì)胞等。
Protein G與eGFP蛋白融合表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)過純化后立即可用，不存在偶聯(lián)的效率等問題。因而在蛋白的亞細(xì)胞高效定位中有很好的應(yīng)用前景。另外，Protein G與eGFP融合蛋白在各種通過抗體檢測的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面如蛋白印跡雜交、流式細(xì)胞儀檢測等方面也有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1 G-eGFP融合基因的核苷酸序列和氨基酸序列。方框表示插入的酶切位點(diǎn)，下劃線表示Protein G氨基酸序列，灰色表示eGFP氨基酸序列。
圖2 G-eGFP fusion protein融合蛋白的SDS-PAGE分析。泳道1BL21；泳道2BL21 with pET21b；泳道3表達(dá)G-eGFP在細(xì)胞總蛋白；泳道4不可溶的蛋白部分；泳道5可溶性蛋白部分。泳道6純化的后的G-eGFP蛋白；泳道7蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量。
圖3 亞細(xì)胞定位檢測的實(shí)例圖片。通過共聚焦激光掃描，利用G-eGFP蛋白檢測棉鈴蟲核型多角體病毒感染棉鈴蟲細(xì)胞后Ha orf29基因和Ha orf3基因在細(xì)胞中表達(dá)的情況。A)Ha orf29熒光觀察的情況。B)Haorf29白光觀察的情況。C)Ha orf33熒光觀察的情況。D)Ha orf33白光觀察的情況。
具體實(shí)施例方式
G-eGFP基因序列的合成根據(jù)鏈球菌(Streptococcus sp.GX7805)蛋白G中結(jié)合抗體區(qū)氨基酸序列(數(shù)據(jù)來源GenBank Y00428)，優(yōu)化設(shè)計(jì)了密碼子，由上海生工生物工程有限公司提供所設(shè)計(jì)的核苷酸序列(見附圖1G-eGFP融合基因的核苷酸序列和氨基酸序列。方框表示插入的酶切位點(diǎn)，下劃線表示ProteinG氨基酸序列，灰色表示eGFP氨基酸序列。)與鏈球菌Streptococcus蛋白G編碼核苷酸序列和氨基酸序列85％相同，15％不同，兩端設(shè)BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)的序列合成合成后克隆到pMD18-T載體中。eGFP基因編碼區(qū)從pEGFP-N1中通過PCR擴(kuò)增獲得(張傳溪、孫建新、施惠娟、陳哲宇、吳祥甫“EGFP基因在粉紋夜蛾細(xì)胞中的高效表達(dá)”《動物學(xué)研究》，1999 20(6)468-470)，兩端分別加有HindIII和XhoI酶切位點(diǎn)。(見附圖1G-eGFP融合基因的核苷酸序列和氨基酸序列。方框表示插入的酶切位點(diǎn)，下劃線表示Protein G氨基酸序列，灰色表示eGFP氨基酸序列。)G-eGFP基因序列載體的構(gòu)建將合成的蛋白G基因編碼片段用BamHI和HindIII切下，pET-21b質(zhì)粒載體相應(yīng)位點(diǎn)中，再將中eGFP基因編碼區(qū)用HindIII和XhoI切下，也插入pET-21b質(zhì)粒載體相應(yīng)位點(diǎn)中。最后蛋白G核苷酸序列和EGFP的核苷酸序列通過HindIII酶切位點(diǎn)連接在一起，形成G-EGFP融合蛋白基因，經(jīng)序列測定驗(yàn)證無誤。pET-21b質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)，一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(Ori)，一個IPTG可調(diào)控啟動子/操縱子，一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)，并在表達(dá)產(chǎn)物后端連接上可用于表達(dá)蛋白純化的His-Tag。將構(gòu)建好的含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化商品名為TG1的E.coli菌株，37℃培養(yǎng)過夜后，用堿裂解法提取質(zhì)粒。用BamHI和XhoI雙酶切消化質(zhì)粒1.5h，在濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠電泳上鑒定插入片段的大小。
G-eGFP蛋白的表達(dá)將鑒定好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化商品名為BL21的E.coli菌株，BL21含有多拷貝的重組質(zhì)粒，其表達(dá)lac I阻遏物并攜帶氨芐抗性(Ampr)，在含Ampr的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，BamHI和XhoI雙酶切后瓊脂糖電泳鑒定插入了正確大小的片段。挑取正確的克隆后接種至5ml含Ampr的LB中在37℃下培養(yǎng)至生長對數(shù)期(OD600＝0.5)，加入IPTG()至終濃度為0.33Mm，接著在28℃，180rpm/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)12h。以4000rpm/min的轉(zhuǎn)速離心菌液，棄去上清，用PBS重懸浮沉淀(140mM NaCl，2.7Mm KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4)，用超聲波破碎細(xì)胞。接著，在懸浮液中加入SDS-PAGE上樣緩沖液，并煮沸5min。在含8％聚丙烯酰胺的SDS-PAGE膠上分析樣品。
G-eGFP蛋白的純化用Ni NTA商品樹脂柱純化G-eGFP蛋白。收集菌液，用超聲裂解法破碎細(xì)胞，以1×Ni NTA Bind Buffer(300mM NaCl，50mM磷酸鈉緩沖液，10mM咪唑，pH8.0)為平衡液以及結(jié)合液，蛋白液用經(jīng)預(yù)平衡的NiNTA商品樹脂柱過柱，再用20ml 1×Ni NTA Wash Buffer(300mM NaCl，50mM磷酸鈉緩沖液，20mM咪唑，pH8.0)洗去雜蛋白，然后用含250mM咪唑的1×Ni-NTA Elute Buffer進(jìn)行洗脫。最后用ddH2O對蛋白進(jìn)行透析并凍干保存。除非特別指明，純化的所有步驟都在4℃進(jìn)行。
G-eGFP蛋白的抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)G-eGFP蛋白偶聯(lián)到激活的CNBr Sepharose 4 Fast Flow(根據(jù)美國Amersham公司的操作手冊進(jìn)行，方法如下取少量激活的CNBr 4，溶于1mM HCl中，室溫靜置30分鐘，使其充分膨脹。用15倍體積的1mM HCl平衡之后，按1∶2(蛋白體積∶柱床體積)的體積在4℃進(jìn)行吸附過夜。以至少5倍柱床體積的coupling buffer(0.1M NaHCO3，PH8.3，含0.5M NaCl)洗去多余的配體。用blocking buffer(0.1M Tris-HCl)在4℃封閉2h。接著，以0.1M acetate buffer(含0.5M NaCl，PH3-4)和0.1M Tris-HCl(含0.5M NaCl，PH8-9)輪流洗三次，存于20％乙醇中。
兔多抗融解在RIPA buffer(50mM Tris-HCl，1％NP-40，0.25％脫氧膽酸鈉，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF，1mg/ml抑肽酶，1mg/ml亮氨酸，1mg/ml抑肽素，1mM Na3VO4，1mM NaF)中，并與偶聯(lián)Sepharose的G-eGFP蛋白在4℃結(jié)合。然后，用RIPA buffer洗sepharose柱床，除去未結(jié)合的IgG。用PBS重懸浮柱床，加入上樣緩沖液后，煮沸進(jìn)行SDS-PAGE分析其結(jié)合抗體的能力。
G-eGFP蛋白在亞細(xì)胞定位中的應(yīng)用G-eGFP蛋白同時可以用于通過共聚焦激光掃描在活細(xì)胞中進(jìn)行蛋白定位。在此緊舉一例在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用。單層細(xì)胞在合適的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)后感染病毒，48小時后用1×PBS洗三次，然后用1×PBS配制的4％多聚甲醛固定。用滲透液處理細(xì)胞。固定好的細(xì)胞在分別依次與目標(biāo)蛋白的多克隆抗體和G-eGFP蛋白反應(yīng)后，用共聚焦激光掃描檢測目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。同時，由于G-eGFP蛋白能結(jié)合抗體和發(fā)綠色熒光特性及良好的穩(wěn)定性，在各種通過抗體檢測的研究和臨床醫(yī)學(xué)方面如蛋白印跡雜交、流式細(xì)胞儀檢測等方面也有廣闊的應(yīng)用前景。
SEQUENCE LISTING<110>浙江大學(xué)<120>G-eGFP蛋白及其制備方法與應(yīng)用<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>951<212>DNA<213>G-eGFP蛋白<220>
<221>Protein G核苷酸序列<222>(7)...(222)<220>
<221>eGFP核苷酸序列<222>(229)...(945)<400>1ggatccatga cttacaaact gatcctgaac ggtaaaaccc tgaaaggcga aaccactact 60gaagcagtag acgcggctac ggcagaaaaa gttttcaaac agtacgctaa cgacaacggt 120gttgatggtg aatggaccta tgatgatgcg accaagacct tcaccgtaac cgaattcaaa 180ccagaagtga tcgatgcgtc tgaactgacc ccggccgtga ccaagcttat ggtgagcaag 240ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 300ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 360ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 420ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 480
ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 540ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 600gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 660aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 720aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 780cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 840cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 900gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagctcga g 951<210>2<211>317<212>PRT<213>G-eGFP蛋白<220>
<221>Protein G氨基酸序列<222>(3)...(74)<220>
<221>eGFP氨基酸序列<222>(77)...(315)<400>2Gly Ser Met Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly1 5 10 15Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe20 25 30Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp35 40 45Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Phe Lys Pro Glu Val Ile50 55 60Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Lys Leu Met Val Ser Lys
65 70 75 80Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp85 90 95Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly100 105 110Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly115 120 125Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly130 135 140Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe145 150 155 160Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe165 170 175Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu180 185 190Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys195 200 205Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser210 215 220His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val225 230 235 240Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val His Tyr Leu245 250 255Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His260 265 270Met Val Leu Leu Glu Phe Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr275 280 285Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn Val Thr Ala Ala290 295 300Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Glu305 310 31權(quán)利要求
1.一種G-eGFP融合蛋白，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
2.一種G-eGFP融合蛋白，其編碼的蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ IDNO.2所述的氨基酸序列。
3.一種具有權(quán)利要求1所述的G-eGFP融合蛋白的活性多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的活性多肽的制備方法，包括(a)將編碼的具有G-eGFP融合蛋白的多肽的核苷酸序列，即蛋白G的核苷酸序列與eGFP核苷酸序列，可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成G-eGFP融合蛋白的表達(dá)載體；(b)將步驟(a)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成G-eGFP融合蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)G-eGFP融合蛋白的條件下，培養(yǎng)步驟(b)的重組細(xì)胞；(d)分離出具有G-eGFP融合蛋白活性的多肽。
5.如權(quán)利要求4所述的活性多肽的制備方法，其特征在于所述的適合表達(dá)G-eGFP融合蛋白的條件為25-37℃下培養(yǎng)至生長對數(shù)期OD600＝0.3-0.7，加入IPTG至終濃度為0.1-1mM，在26-37℃，180-240rpm/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)8-18h。
6.一種含權(quán)利要求1所述的G-eGFP融合蛋白核苷酸序列的重組載體。
7.一種含權(quán)利要求6所述重組載體的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1所述的G-eGFP融合蛋白在亞細(xì)胞定位中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種G－eGFP融合蛋白及其制法和用途，G－eGFP融合蛋白具有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。G－eGFP融合蛋白是Protein G與eGFP蛋白的融合，表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)過純化后立即可用，不存在偶聯(lián)的效率等問題。因而在蛋白的亞細(xì)胞高效定位中有很好的應(yīng)用前景。另外，G－eGFP融合蛋白在各種通過抗體檢測的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面如蛋白印跡雜交、流式細(xì)胞儀檢測等方面也有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K14/195GK101050468SQ20061015530
公開日2007年10月10日 申請日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月19日
發(fā)明者張傳溪, 楊章女, 孫建新 申請人:浙江大學(xué)