一種去甲萬古霉素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種去甲萬古霉素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽酸去甲萬古霉素是我國(guó)唯一一個(gè)自主研制并成功應(yīng)用于臨床的糖膚類抗生素， 由鏈霉素發(fā)酵產(chǎn)生，用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌感染。去甲萬古霉素具有和萬古霉素類似的化 學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理性質(zhì)、抗菌活性和抗菌譜，其作用機(jī)制為抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，是臨床上治 療由甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌引起的嚴(yán)重感染的首選藥物。
[0003] 去甲萬古霉素分子由兩個(gè)基本結(jié)構(gòu)組成，即糖基部分a-o-vancosamine-β-ο- glucosyl和膚基部分的中屯、屯膚核。在臨床上使用的是去甲萬古霉素鹽酸鹽。鹽酸去甲萬 古霉素為白色或類白色無定形粉末，極易溶于水，可溶于含水甲醇，不溶于高級(jí)醇類、丙酬 或乙酸，低濃度尿素可增加其水溶解度。
[0004] 去甲萬古霉素為微生物發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物，存在于發(fā)酵液中。因此，對(duì)去甲萬古 霉素的研究，一般多從發(fā)酵液固液分離開始，先得到含有目標(biāo)產(chǎn)物的濾液，再進(jìn)行進(jìn)一步的 純化除雜，得到目標(biāo)產(chǎn)物。專利CN200310109688.9公開了一種從發(fā)酵液中分離制備去甲基 萬古霉素的方法，該方法通過發(fā)酵液預(yù)處理、樹脂脫色、葡聚糖凝膠吸附及溶劑結(jié)晶等步 驟，從去甲萬古霉素發(fā)酵液中分離制備去甲萬古霉素產(chǎn)品，所得產(chǎn)品含量大于90%，但該方 法步驟繁瑣，有機(jī)溶劑消耗量大，收率低。專利CN200910198279.8公開了一種采用聚合物填 料從糖膚類粗品中分離純化糖膚類化合物的方法，所得終產(chǎn)品純度在95.0-98.5%之間，且 該工藝過程為間歇操作，效率低，不便于商業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有去甲萬古霉素生產(chǎn)技術(shù)的不足，開發(fā)一種操作方便、效 率高、成本低的去甲萬古霉素制備方法，本發(fā)明的目的可W通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。
[0006] 本發(fā)明所述一種去甲萬古霉素的制備方法，包括W下步驟： a、發(fā)酵液中加入超順磁性微球，攬拌使其吸附完全，然后分離出超順磁性微球。
[0007] b、將分離出的超順磁性微球先用水洗，再用乙醇-酸性水溶液洗脫，得到含有去甲 萬古霉素的洗脫液，洗脫液結(jié)晶、過濾、干燥，得到去甲萬古霉素粗粉。
[000引C、粗粉加水溶解，注入裝有C8填料的色譜柱，乙醇-酸性水溶液洗脫，收集HPLC純 度> 98.5%的制備液，納濾濃縮、脫水干燥，得到去甲萬古霉素產(chǎn)品。
[0009] 其中步驟a中所述超順磁性微球的粒徑為10-30μπι，粒徑分布為單分散，表面的功 能基團(tuán)為簇基基團(tuán)。
[0010] 其中步驟a中所述超順磁性微球的用量為每升發(fā)酵液添加30-50g超順磁性微球。
[0011] 其中步驟b或C所述乙醇-酸性水溶液中酸性水溶液為憐酸-憐酸鹽緩沖液，pH值為 3.8-4.2，乙醇在溶液中的體積百分比為10-15%。
[0012] 其中步驟b中所述乙醇-酸性水溶液用量為每克超順磁性微球加入2.5-3毫升。
[OOK]其中步驟帥所述洗脫液結(jié)晶為加入ο. 5mol/L的NaOH溶液調(diào)抑值至7.5-8.5。
[0014] 其中步驟C中所述C8填料粒徑為30-50μπι。
[001引其中步驟C中所述的納濾濃縮，納濾截留大小為200-500Da，濃縮液濃度為150- 200mg/ml0
[0016]其中步驟C中所述的納濾濃縮，納濾過程中補(bǔ)加去離子水或蒸饋水脫去乙醇，至乙 醇濃度小于1%。
[0017]其中步驟C中所述脫水干燥，是將納濾濃縮液用鹽酸調(diào)抑3.0-4.0后，7令凍干燥。
[0018] 本發(fā)明b步驟中所述超順磁性微球經(jīng)外加磁場(chǎng)分離，用水沖洗表面附著物后用乙 醇-酸性水溶液洗脫吸附的去甲萬古霉素，超順磁性微球再生后重復(fù)使用。
[0019] 超順磁性微球預(yù)處理及再生方式為每克微球加入3-5ml的2moL/L的HC1，靜態(tài)浸泡 2-4小時(shí)后過濾，除去鹽酸，然后用去離子水洗涂至pH值4.0-5.0。
[0020] 由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明取得的技術(shù)進(jìn)步為： 1)超順磁性微球?qū)θゼ兹f古霉素的活性組分具有高選擇性，該介質(zhì)的引入使純化工藝 大大簡(jiǎn)化，無需經(jīng)過過濾、脫色、吸附等工序，粗粉制備時(shí)間由72小時(shí)縮短為16小時(shí)，收率由 70%提高到85% W上，介質(zhì)用量減少60%，廢水排放量大幅降低。2 )粗粉經(jīng)裝有C8填料的工業(yè) 制備色譜分離提純，可W得到純度大于99%的去甲萬古霉素產(chǎn)品，且溶劑用量極劇減少。3) 所述方法具有操作簡(jiǎn)便、溶媒用量少，產(chǎn)品收率高的優(yōu)點(diǎn)，適合于商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為去甲萬古霉素粗粉HPLC檢測(cè)圖譜 圖2為去甲萬古霉素精粉HPLC檢測(cè)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面用具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但并不W任何方式意味著對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行限制。下列實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0023] 去甲萬古霉素發(fā)酵液可按照現(xiàn)有技術(shù)制得，本發(fā)明所使用的去甲萬古霉素發(fā)酵液 由華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。大孔樹脂X-5、D312,上海華震科技有限公司；超順磁性微 球、C8填料，聚合物微球化iPS25-300,蘇州納微生物科技有限公司；乙醇、丙酬等試劑均為 市售。高效液相色譜儀器包括996型檢測(cè)器、515累，Waters公司生產(chǎn);二元層析系統(tǒng)，江蘇漢 邦科技有限公司。
[0024] 超順磁性微球預(yù)處理及再生方式為每克微球加入3-5ml的2moL/L的HC1，靜態(tài)浸泡 2-4小時(shí)后過濾，除去鹽酸，然后用去離子水洗涂至pH值4.0-5.0。
[0025] 實(shí)施例1 取去甲萬古霉素發(fā)酵液300ml，發(fā)酵單位為1372化g/ml，加入20WI1的超順磁性微球9g， 攬拌吸附30分鐘，吸附完畢，分離出發(fā)酵液中的超順磁性微球，加入20ml水洗涂。
[0026] 在超順磁性微球中加入25ml 10%的乙醇-憐酸鹽緩沖液(pH3.8)，洗脫吸附的去甲 萬古霉素，洗脫液用0.5mol/L的化0H溶液調(diào)抑7.5，靜置，結(jié)晶完全，過濾、干燥，得到去甲萬 古霉素粗粉4.7g，含量為74.7%(去甲萬古霉素粗粉HPLC檢測(cè)圖譜見圖1 )，收率為85.3%。
[0027] 粗粉加14ml水溶解，注入裝有30μπι C8填料的色譜柱(DAC-50)，洗脫劑為10%的乙 醇-憐酸鹽緩沖液(pH3.8)，根據(jù)色譜峰收集流出液，合并HPLC含量大于98.5%的流出液，用 截留大小為200Da的卷式納濾膜納濾，補(bǔ)加蒸饋水脫去乙醇，至乙醇濃度小于1%，濃縮至去 甲萬古霉素濃度為150mg/ml，然后用0.5mo 1/L的鹽酸調(diào)pH3.5，冷凍干燥，得到去甲萬古霉 素精粉2.6g，含量為99.1%(去甲萬古霉素精粉HPLC檢測(cè)圖譜見圖2)，收率為73.4%。
[0028] 實(shí)施例2 取去甲萬古霉素發(fā)酵液化，發(fā)酵單位為1467祉g/ml，加入10皿的超順磁性微球150g，攬 拌吸附20分鐘，吸附完畢，分離出發(fā)酵液中的超順磁性微球，加入300ml水洗涂。
[00巧]在超順磁性微球中加入370ml 12%的乙醇-憐酸鹽緩沖液(PH4.0)，洗脫吸附的去 甲萬古霉素，洗脫液用0.5mo 1 /L的化0H溶液調(diào)抑8.5，靜置，結(jié)晶完全，過濾、干燥，得到去 甲萬古霉素粗粉51g，含量為73.5%，收率為85.1%。
[0030] 粗粉加100ml水溶解，注入裝有50μπι C8填料的色譜柱(DAC-80)，洗脫劑為15%的乙 醇-憐酸鹽緩沖液(ρΗ4.0)，根據(jù)色譜峰收集流出液，合并HPLC含量大于98.5%的流出液，用 截留大小為300Da的卷式納濾膜納濾，補(bǔ)加去離子水脫去乙醇，至乙醇濃度小于1%，濃縮至 去甲萬古霉素濃度為200mg/ml，然后用0.5mol