一種油菜轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別涉及一種油菜轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油菜是我國主要作物，油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)與產(chǎn)品均已成熟，需要對轉(zhuǎn)基因油菜的推 廣進行監(jiān)管，轉(zhuǎn)基因成分檢測是轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的技術(shù)支撐。
[0003] 現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)主要檢測核酸或蛋白質(zhì)，其中，基于核酸的檢測方法 主要流程為：提取待測樣品中的核酸，利用PCR(PolymeraseChainReact ion，聚合酶鏈反 應(yīng))的方法擴增樣品中的轉(zhuǎn)基因成分，利用實時定量、瓊脂糖電泳或芯片技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因成 分是否存在。
[0004] 在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題中的一種：
[0005] 轉(zhuǎn)基因成分多種多樣，而現(xiàn)有技術(shù)一次只能檢測其中一種或少數(shù)幾種，因此，需要 對可能的多種轉(zhuǎn)基因成份逐一進行檢測，才能確定為"非轉(zhuǎn)基因"產(chǎn)品；一般檢測的是共轉(zhuǎn) 化的轉(zhuǎn)基因成分，而不是外源基因本身，因此，對于無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因來說，采用現(xiàn)有的檢測方 法進行檢測會失效;檢測基本上是定性檢測，但定量檢測又有其現(xiàn)實需求，例如，相鄰田塊 的轉(zhuǎn)基因油菜品種的少量花粉被傳到了非轉(zhuǎn)基因品種上，在定性檢測時，非轉(zhuǎn)基因品種將 被誤判為轉(zhuǎn)基因品種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明實施例提供了一種油菜轉(zhuǎn)基因成分的檢測方 法。所述技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明實施例提供了一種油菜轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法，所述方法包括：
[0008] 確定待測樣品中需要檢測的轉(zhuǎn)基因成分、所述待測樣品中的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述 待測樣品的外源標(biāo)準(zhǔn)基因，所述待測樣品為油菜植株或所述油菜植株的一部分；
[0009] 制備用于擴增所述轉(zhuǎn)基因成分、所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測試區(qū) 域的多重擴增引物；
[0010] 對所述待測樣品進行抽樣并混合，得到混合樣品；
[0011] 提取所述混合樣品的基因組；
[0012] 向所述混合樣品的基因組中加入所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因，得到混合核酸；
[0013] 利用所述多重擴增引物對所述混合核酸進行擴增，得到擴增產(chǎn)物，利用所述擴增 產(chǎn)物構(gòu)建高通量測序文庫；
[0014] 對所述高通量測序文庫進行高通量測序，得到測序片段組；
[0015] 分析所述測序片段組，獲得所述待測樣品中所述轉(zhuǎn)基因成分的測序片段的數(shù)量、 所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量；
[0016] 根據(jù)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量，判斷實驗是否成功；
[0017] 若所述實驗成功，則計算所述待測樣品種中所述轉(zhuǎn)基因成分的含量；
[0018] 根據(jù)所述轉(zhuǎn)基因成分的含量判斷所述待測樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。
[0019] 具體地，所述轉(zhuǎn)基因成分為外源功能基因、抗性標(biāo)記基因、啟動子、終止子和外源 插入旁側(cè)序列中的至少一種。
[0020] 具體地，所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因為所述待測樣品的基因組中的單拷貝基因。
[0021 ]具體地，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于所有生物中。
[0022] 具體地，所述判斷實驗是否成功的方法為：當(dāng)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù) 量和所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量均2 α?時，則實驗成功；當(dāng)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的 測序片段的數(shù)量或所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量〈α?時，則實驗失敗;其中，α?為判 定閾值。
[0023] 具體地，所述判定所述待測樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分的方法為：當(dāng)需要檢測的任 意一種所述轉(zhuǎn)基因成分的含量2 α2時，判定所述待測樣品含有轉(zhuǎn)基因成分；當(dāng)所有所述轉(zhuǎn) 基因成分的含量<α2時，判定所述待測樣品不含有轉(zhuǎn)基因成分;其中，α2為判定閾值。
[0024] 具體地，計算所述待測樣品種中所述轉(zhuǎn)基因成分的含量的方法為:第m種所述轉(zhuǎn)基 因成分的含量的計算公式為
其中，i為所述第m種轉(zhuǎn)基因成分的 第i個測試區(qū)域，nl為所述第m種轉(zhuǎn)基因成分的所述測試區(qū)域的個數(shù)，bi為所述第m種轉(zhuǎn)基因 成分的第i個所述測試區(qū)域的所述測序片段的數(shù)量，k為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因，n3為所述 內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的個數(shù)，j為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的第j個測試區(qū)域，n2為所述第k種內(nèi)源 標(biāo)準(zhǔn)基因的所述測試區(qū)域的個數(shù)，aj為所述第k種內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的第j種所述測試區(qū)域的所 述測序片段的數(shù)量;N為所有所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的所述測試區(qū)域的總數(shù)。
[0025 ]具體地，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的質(zhì)量與所述混合樣品的基因組的總質(zhì)量的比例大于 1/100000。
[0026] 本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明提供的檢測方法可以在 不同待測樣品、不同檢測的目標(biāo)基因間通用，可以一次性檢測任意多種需要檢測的轉(zhuǎn)基因 成分，從而判定待測樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分，該方法可以實現(xiàn)定量檢測，且檢測結(jié)果幾乎 沒有下限，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是現(xiàn)有技術(shù)達不到的。
【具體實施方式】
[0027] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施方式作進一 步地詳細描述。本發(fā)明實施例中未注明或詳細描述的操作流程或操作規(guī)范均為普通分子生 物學(xué)技術(shù)人員所熟知的操作。本發(fā)明實施例中未注明的試劑或生物材料均為市場上銷售的 常用試劑或生物材料，均為普通分子生物學(xué)技術(shù)人員所熟知的，且可以在市場上購買到。 [0028] 實施例
[0029] 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙丙氨酰磷抗性(Biolaphos resistance，Bar)基因?qū)胭F 油恢15油菜品種，自交純化3代后，獲得改造的貴油恢15油菜品種種子，作為本實施例的待 測油菜品種。其中，貴油恢15油菜是轉(zhuǎn)基因油菜受體品種，由貴州農(nóng)學(xué)院油菜研究室育成， 本實施例中使用的貴油恢15油菜種子由江漢大學(xué)保存和繁殖。
[0030] 油菜植物品種轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，具體步驟如下：
[0031] 步驟1、確定待測樣品中需要檢測的轉(zhuǎn)基因成分、待測樣品中的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和待 測樣品的外源標(biāo)準(zhǔn)基因，具體方法如下:待測樣品為油菜植株或油菜植株的一部分，其中， 油菜植株可以為油菜植株的根、莖、葉、花、果實和種子等器官，也可以是2種及2種以上的不 同器官的混合物，如葉和莖的混合物，油菜植株的一部分可以為油菜植株的根、莖、葉、花、 果實和種子等至少一個器官中的一部分。在本實施例中，待測樣品為改造后的貴油恢15油 菜的種子，轉(zhuǎn)基因成分、內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和外源標(biāo)準(zhǔn)基因均2 1個，轉(zhuǎn)基因成分可以為外源功 能基因、抗性標(biāo)記基因、啟動子、終止子和外源插入旁側(cè)序列中的至少一種，即通過轉(zhuǎn)基因 技術(shù)手段向貴油恢15油菜品種中轉(zhuǎn)入不存在于貴油恢15油菜品種中的外源核酸序列；內(nèi)源 標(biāo)準(zhǔn)基因為待測樣品的基因組中的單拷貝基因。在本實施例中，內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因通過NCBI (http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)在待測樣品基因組上比對時為單一序列；外源標(biāo)準(zhǔn)基因 不存在于所有生物中，在本實施例中，所使用的外源標(biāo)準(zhǔn)基因為ERCC04基因，其在NCBI上同 源比對時，未發(fā)現(xiàn)同源序列，可以判定外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于所有生物中。在本實施例中， 檢測的轉(zhuǎn)基因成分共5種，內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因1種，外源標(biāo)準(zhǔn)基因1種，其相關(guān)信息見表1，表1中所 列轉(zhuǎn)基因成分不僅包括Bar基因，Bar基因為外源功能基因，還包括其他轉(zhuǎn)基因成分，這些轉(zhuǎn) 基因成分在轉(zhuǎn)基因作物中廣泛使用，因此，本實施例提供的檢測方法具有通用性。表1中的 基因序列有兩種表不方式，一種是直接與出基因序列，另一種是NBCI的基因編號，表1中的 測序區(qū)域中的數(shù)字代表堿基的位置，該基因的第1個堿基的位置定義為1。
[0032] 表1為實施例一中被檢測基因的相關(guān)信息與檢測結(jié)果
[0033]
[0034]
[0035] 表1中"/"表示無。
[0036] 步驟2、制備用于擴增轉(zhuǎn)基因成分、內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和外源標(biāo)準(zhǔn)基因的多重擴增引 物，具體方法如下：
[0037] 多重擴增引物的獲取過程如下：登錄賽默飛世爾公司多重PCR引物在線設(shè)計網(wǎng)頁 https ://ampl iseq · com/