提高滸苔多糖生物活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)化工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過對降解滸苔多糖進(jìn)行異羥肟酸化修 飾從而增強(qiáng)其生物活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 滸苔是我國東南沿海的一種大型經(jīng)濟(jì)性綠藻，資源豐富，本身可以食用，并含有多 種活性物質(zhì)，如滸苔多糖，脂類色素，酸類等。據(jù)文獻(xiàn)報道，講苔多糖具有提高哺乳動物免疫 力、降血脂、消炎抗菌以及抗氧化等生理功能。因此將滸苔開發(fā)成功能食品有很好的前景。 滸苔水提多糖主要為水溶性的硫酸多糖，分子量大，生物活性相對較低。如果將其降解成分 子量相對較小的產(chǎn)物，則由于游離出更多的活性基團(tuán)，則可能會使其生物活性得到提高。另 外，通過化學(xué)修飾在多糖分子中引入一些功能基也能使多糖的生物得到提高。已有文獻(xiàn)報 道了滸苔多糖的硫酸化、磷酸化和乙?；揎棧?jīng)修飾之后的滸苔多糖的抗氧化活性顯著 提高；也有報道滸苔多糖經(jīng)硒化后提高抗菌活性，但尚未有同時提高滸苔多糖抗菌和抗氧 化活性的方法報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是一種能提高滸苔多糖的抗氧化、抗菌等生物活性的方 法。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種將降解的滸苔多糖進(jìn)行異羥肟酸化修飾 的方法;包括以下步驟：
[0005] (1)將滸苔粗多糖(EP)通過氧化氫-維生素 C聯(lián)合法進(jìn)行降解。通過研究反應(yīng)溫度、 維生素 C以及過氧化氫濃度和反應(yīng)時間對降解產(chǎn)物的總抗氧化能力的影響，得到最佳的降 解反應(yīng)條件。將水解液經(jīng)濃縮、醇沉、離心、透析、冷凍干燥，得到粉末狀的降解滸苔多糖 (DEP) 0
[0006] (2)以氯乙酸為羧甲基化試劑，與降解滸苔多糖反應(yīng)制備羧甲基化滸苔多糖 (CDEP)。研究反應(yīng)溫度、氯乙酸濃度和反應(yīng)時間對產(chǎn)物的羧甲基取代度的影響，并通過響應(yīng) 面試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件。在經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)條件下得到羧甲基化滸苔多糖(CDEP)用于 下一步反應(yīng)。
[0007] (3)在1-乙基-3-(3_二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)存在下，CDEP與羥胺偶聯(lián)，得到 異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)。
[0008] 本發(fā)明的方案具體如下，一種提高滸苔多糖生物活性的方法，包括以下步驟：
[0009] 1)、降解：
[0010]將滸苔粗多糖(EP)溶于蒸餾水配成濃度為1~20mg/mL的滸苔粗多糖溶液，升溫至 30~50°C后分別加入過氧化氫和維生素 C，直至過氧化氫和維生素 C的終濃度均為6~ 12mmol/L(例如為9mmol/L);然后保溫攪拌進(jìn)行降解反應(yīng)2~4h，從而實(shí)現(xiàn)對滸苔粗多糖進(jìn) 行降解；
[0011] 將所得的反應(yīng)液濃縮至為原體積的1/2~1/4(約1/3)，得濃縮液；用4倍濃縮液體 積的體積濃度為95%乙醇沉淀，于3~5°C靜置10~12h(4°C、過夜），離心(8000rpm，20min)， 取沉淀用水進(jìn)行復(fù)溶，所述沉淀與水的用量比為18~22mg/ml (例如約為20mg/ml)，用截留 分子量為3500Da的透析袋透析46~50h(例如48h)，將所得的透析液冷凍干燥，得到降解滸 苔多糖(DEP，為粉末狀）；
[0012] 備注說明：降解滸苔多糖(DEP)不具備抗菌活性；
[0013] 2)、羧甲基化：
[0014] 將0.3g的降解滸苔多糖(DEP，為粉末狀)溶于12.5ml二甲基亞砜(DMSO)中，室溫下 攪拌1.5~2.5h;然后加入質(zhì)量濃度20 %氫氧化鈉溶液5ml，于35~45°C攪拌2.5~3.5h，得 反應(yīng)液I;
[0015] 將氯乙酸溶于12.5ml二甲基亞砜(DMSO)和質(zhì)量濃度20%氫氧化鈉溶液5ml中，配 制得濃度為2~6moI/L(較佳濃度為4moI/L)的氯乙酸溶液，作為反應(yīng)液Π ;將反應(yīng)液Π 與上 述反應(yīng)液I等體積混合（注：從而使得到的反應(yīng)液中氯乙酸終濃度為1~3mol/L，較佳為 2mol/L)，然后于45~65°C反應(yīng)2~6小時(較佳為55°C反應(yīng)4小時）；
[0016] 將所得的反應(yīng)液冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至中性（可用0.5mol/L的HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)pH，中 性，即，pH=7.0)，加水稀釋(水與反應(yīng)液的體積比約為1:1)，然后用3500Da的透析袋透析46 ~50h(例如48h)，將透析液濃縮至原體積的1/2~1/4(例如1/3)，冷凍干燥，得到即羧甲基 化降解滸苔多糖(⑶EP，即，白色粉末狀的羧甲基化衍生物）；
[0017] 3)、與羥胺偶聯(lián)：
[0018]將羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)溶于蒸餾水中配制成濃度為1~3g/100ml(例如 為2g/100ml)的羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)溶液，調(diào)節(jié)pH至4.0~4.5(用I.ON HCl溶液調(diào) 節(jié)），然后加入EDC · HCl，攪拌1.5~2.5h(例如2h)，再加入鹽酸羥胺和4-二甲氨基吡啶 (DMAP)，繼續(xù)攪拌1 ·5~2· 5h(例如2h)，調(diào)節(jié)pH至5 ·8~6 · 2(例如為6·0，用1 ·ON NaOH溶液調(diào) 節(jié)），室溫攪拌1.5~2.5h(例如2h)，再調(diào)節(jié)pH至8.8~9.2(例如為9.0,用1.0 N的NaOH溶液）， 繼續(xù)室溫攪拌22~26h(例如24h) ;EDC · HCl與羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)中羧甲基的摩 爾比為l~4:3(較佳為l~1.2:3)，鹽酸羥胺與EDC·HCl的摩爾比為5.5~6 :l，4-二甲氨基 吡啶(DMAP)的摩爾量為EDC · HCl的5~15.5% ;
[0019] EDC · HCl代表1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；
[0020] 備注說明：CDEP中羧甲基的摩爾數(shù)由其羧甲基取代度(DS)計算得到；
[0021] 將所得的反應(yīng)液旋蒸濃縮至為原體積的1/2~1/4(例如1/3)，得濃縮液；用4倍濃 縮液體積的體積濃度95 %乙醇沉淀，于3~5°C靜置10~12h (4°C、過夜），離心（8000rpm， 20min)取沉淀，用乙醇洗滌沉淀（洗3~5次），用水復(fù)溶，所述沉淀與水的用量比為18~ 22mg/ml(例如20mg/ml)，用截留分子量為3500Da透析袋透析46~50h(例如48h)，將透析液 濃縮至原體積的1/2~1/4(例如1/3,可利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮），冷凍干燥，得到異羥肟酸化 降解滸苔多糖(HCDEP)。
[0022] 該異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)為降解滸苔多糖的異羥肟酸化衍生物。
[0023] 作為本發(fā)明的提高滸苔多糖生物活性的方法的改進(jìn)：異羥肟酸化降解滸苔多糖 (HCDEP)具有較低分子量(30~13kDa)，其鐵螯合容量為0.2~1.2mmol/g。
[0024] 作為本發(fā)明的提高滸苔多糖生物活性的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0025] 所述步驟1)、2)、3)中的冷凍干燥均是：于-45~-55°C冷凍干燥22~26小時（例如 為于-50°C冷凍干燥24小時）。
[0026]在本發(fā)明中，室溫一般是指10~30°C。
[0027]備注說明：本發(fā)明滸苔粗多糖按文獻(xiàn)文獻(xiàn)報道方法制備(Jie Xu，Li_Li Xu，Qin-Wei Zhou，Shu-Xian Hao,Tao Zhou,Hu-Jun Xie.Enhanced in vitro antioxidant activity of polysaccharides from Enteromorpha Pro I if era by enzymatic degradation.Journal of Food Biochemistry.doi: 10.1111/jfbc. 12218)。講苔粗多糖 (EP)中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、硫酸根的含量分別為49.2%、15.7%、0.8%和12.3% ;用高效 凝膠滲透層析法測得其多糖分子量為1480kDa。本發(fā)明的降解滸苔多糖(DEP)中總糖、糖醛 酸、蛋白質(zhì)、硫酸根的含量分別為51.9%、15.5%、0.65 %和13.9%;多糖分子量為44kDa。組 成分析表明DEP與EP相比，除分子量降低外，基本組成沒有明顯變化。
[0028] 多糖的羧甲基的取代度:指每個單糖結(jié)構(gòu)單元上連接的羧甲基的平均數(shù)。
[0029] 本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：
[0030] 1.與未降解的滸苔粗糖(EP)和降解滸苔多糖(DEP)相比，本發(fā)明得到的異羥肟酸 化降解滸苔多糖(HCDEP)的體外抗氧化活性顯著提高。
[0031] 2.未降解的滸苔粗糖(EP)和降解滸苔多糖(DEP)沒有顯示出抗菌活性，本發(fā)明得 到的HCDEP則對幾種革蘭氏陽性菌和陰性菌都顯示出明顯的抑制作用。
【附圖說明】
[0032]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0033]圖1是由本發(fā)明實(shí)施例1-1得到的異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)與降解滸苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果。
[0034]圖2是由本發(fā)明實(shí)施例1-1得到的異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)與降解滸苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的超氧陰離子自由基清除能力的測定結(jié)果。
[0035]圖3是由本發(fā)明實(shí)施例1-1得到的異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)與降解滸苔多 糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的羥基自由基清除能力的測定結(jié)果。
[0036] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1-1得到的異羥肟酸化降解滸苔多糖(HCDEP)與降解滸苔多糖 (DEP)以及未降解多糖(EP)的總抗氧化能力的測定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例1-1、異羥肟酸化降解滸苔多糖的制備：
[0038] (1)稱取Ig滸苔粗多糖(EP)溶解于IOOmL蒸餾水中，30°C水浴加熱，依次加入維生 素 C和過氧化氫，使得二者的終濃度均為9mmo 1/L，保溫攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)液濃縮(于60~ 70°C進(jìn)行減壓濃縮）至為原體積的1/3，用4倍濃縮液體積95 %乙醇沉淀，4°C過夜，離心 (8000rpm，20min)，取沉淀用水復(fù)溶(所述沉淀與水的用量比約為20mg/ml)，用截留分子量 為3500Da的透析袋透析48h，將透析液冷凍干燥(于-50°C冷凍干燥24小時），得到粉末狀的 降解滸苔多糖(DEP)。
[0039] (2)取0.3g的降解滸苔多糖(DEP)溶于12.5mL的DMSO中，室溫攪拌2h，加入質(zhì)量濃 度20%的氫氧化鈉溶液5mL，加熱至40°C攪拌3h。取6.62g(0.07mol)的氯乙酸加入5mL的 NaOH溶液（質(zhì)量濃度20 % )和12.5mL的DMSO中，溶解后加入到上述反應(yīng)體系中，使得氯乙酸 終濃度為2. Omol/L，在55°C反應(yīng)4h，將反應(yīng)液冷卻至室溫，用0.5mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至中性 (即，pH=7)，加水稀釋(水與反應(yīng)液的體積比約為1:1)，然后用3500Da的透析袋透析48h，將 透析液濃縮（于60~70°C進(jìn)行減壓濃縮）至為原體積的1/3,凍干（于-50°C冷凍干燥24小 時），得到羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)，羧甲基的取代度為0.774。降解滸苔多糖的羧甲基 化的成功用紅外光譜和核磁共振碳譜得到確證。
[0040] (3)稱取0 · 3g(含1 · 42mo 1羧甲基）羧甲基化衍生物（CDEP)溶于15mL蒸餾水中，用 1.0N HCl溶液調(diào)節(jié)pH至4.3,加入0.1g(0.52mmol)EDC · 'HCl使羧基活化，攪拌2h，再加入 0.2g(2.89mmol)鹽酸羥胺，同時加入0.01g(0.08mmol)4-二甲氨基吡啶(DMP)作為催化劑， 繼續(xù)攪拌2h，用1.0 N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，室溫攪拌2h，再用1.0 N的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至 9.0，繼續(xù)室溫攪拌24h，將反應(yīng)液旋蒸濃縮為原體積的1/3，得濃縮液；用4倍濃縮液體積的 濃度為95%乙醇沉淀，4°C靜置過夜，離心(8000rpm，20min)取沉淀，用乙醇洗滌沉淀4次(每 次洗滌時，用量約為5ml)，用水復(fù)溶(所述沉淀與水的用量比約為20mg/ml)，于3500Da透析 48h，將透析液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/3，-50°C冷凍干燥24h，得到異羥肟酸化降解 滸苔多糖(HCDEP)0.23g，測得其分子量為55.4kDa。異羥肟酸化降解滸苔多糖的結(jié)構(gòu)用傅立 葉紅外光譜和核磁共振碳譜進(jìn)行了確證；并用光譜滴定法測定了其鐵螯合容量為 0.417mmol/g(測定方法見實(shí)驗(yàn)1)。
[0041 ]實(shí)驗(yàn) 1、
[0042] 鐵螯合容量的測定:取HCDEP 150mg，溶解于IOmL 50mM的NH4HCO3緩沖液中，得到樣 品濃度為15mg/mL;取11份1.0 mL的樣品溶液