多重rna向?qū)У幕蚪M工程的制作方法
【專利說明】多重RNA向?qū)У幕蚪M工程
[0001]相關(guān)申請(qǐng)數(shù)據(jù)
[0002]本申請(qǐng)要求于2013年7月9日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/844，168的優(yōu)先權(quán)，并且將其全部?jī)?nèi)容通過引證合并于此用于所有目的。
[0003]政府利益的聲明
[0004]本發(fā)明是根據(jù)能源部的DE-FG02-02ER63445、國家科學(xué)基金會(huì)的NSF-SynBERC以及國家科學(xué)基金會(huì)的SA5283-11210的政府支持下完成的。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0005]細(xì)菌和古細(xì)菌CRISPR-Cas體系(system)憑借短的向?qū)NA形成Cas蛋白復(fù)合物以指導(dǎo)存在于侵入的外來核酸內(nèi)的互補(bǔ)序列的降解。參見DeltcheVa，E.et al.CRISPR RNAmaturat1n by trans—encoded small RNA and host factor RNase II1.Nature 471，602-607(2011)；Gasiunas，G，Barrangou，R.，Horvath，P.&Siksnys，V.Cas9_crRNAribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptiveimmunity in bacteria.proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences 109，E2579-2586(20 12);Jinek，M.et al.A programmable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337，816-821(2012);Sapranauskas,R.et al.The Streptococcus thermophiIus CRISPR/Cas systemprovides immunity in Escherichia col1.Nucleic acids research 39,9275-9282(2011);以及Bhaya，D.，Davison，M.&Barrangou，R.CRISPR_Cas systems in bacteria andarchaea:versatiIe small RNAs for adaptive defense and regulat1n.Annualreview of genetics 45，273-297(2011) D最近化胺性鏈球菌(S.pyogenes)II型CRISPR體系的體外重構(gòu)(reconst i tut 1n)證實(shí)了融合至正常反式編碼的tracrRNA( “反式激活的CRISPR RNA”)的crRNA( uCRISPR RNA”)足以指導(dǎo)Cas9蛋白序列特異地切割匹配該crRNA的革巴DNA序列D表達(dá)與革E位點(diǎn)同源的gRNA導(dǎo)致Cas9募集(recruitment)和革EDNA的降解D參見H.Deveau et al.,Phage response to CRISPR—encoded resistance in StreptococcusthermophiIus.Journal of Bacter1logy 190，1390(Feb，2008)0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本公開內(nèi)容的方面旨在使用一種或多種X向?qū)NA(核糖核酸)多重修飾在細(xì)胞中的DNA以指導(dǎo)由細(xì)胞表達(dá)的具有核酸酶活性的酶，如具有核酸酶活性的DNA結(jié)合蛋白，至該DNA(脫氧核糖核酸)上的祀位置(target locat1n)，其中，該酶剪切DNA并且使外源供體核酸插入至該DNA中，如通過同源重組^本公開內(nèi)容的方面包括在細(xì)胞上循環(huán)或者重復(fù)DNA修飾步驟以生成在細(xì)胞內(nèi)具有多重DNA修飾(modificat1n)的細(xì)胞。修飾可以包括外源供體核酸的插入。
[0007]通過引入編碼多個(gè)RNA以及多個(gè)外源供體核酸的核酸至表達(dá)酶的細(xì)胞，如通過共轉(zhuǎn)化(co-transformat1n)，的單一步驟，可以實(shí)現(xiàn)將多重外源核酸插入，其中表達(dá)該RNA并且其中在多個(gè)RNA中的每一個(gè)向?qū)г撁钢罝NA的特定位點(diǎn)，該酶剪切DNA并且將多個(gè)外源核酸中的一個(gè)插入至在此剪切位點(diǎn)處的DNA。根據(jù)這個(gè)方面，在單一循環(huán)中產(chǎn)生了在細(xì)胞中的DNA的多種改變(alterat1n)或修飾。
[0008]通過引入編碼一種或多種RNA或多個(gè)RNA以及一種或多種外源核酸或多個(gè)外源核酸的一種或多種核酸至表達(dá)酶的細(xì)胞的重復(fù)步驟或循環(huán)，可以實(shí)現(xiàn)將多重外源核酸插入至細(xì)胞中，其中表達(dá)RNA并且向?qū)г撁钢罝NA的特定位點(diǎn)，該酶剪切該DNA并且將外源核酸插入至在此剪切位點(diǎn)處的DNA，以使產(chǎn)生具有多重改變或具有外源DNA插入至在細(xì)胞內(nèi)的DNA的細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)方面，表達(dá)酶的細(xì)胞可以是表達(dá)天然的酶的細(xì)胞或者已經(jīng)遺傳地改變以表達(dá)酶(如通過引入編碼該酶的核酸至細(xì)胞并且由該細(xì)胞可以將其表達(dá))的細(xì)胞。以這樣的方式，本公開內(nèi)容的方面包括循環(huán)以下步驟:將RNA引入至表達(dá)酶的細(xì)胞，將外源供體核酸引入至細(xì)胞，表達(dá)該RNA，形成該RNA、該酶和DNA的共定位復(fù)合物(co-local izat 1ncomplex)，通過酶酶促地剪切DNA，以及將供體核酸插入至該DNA。循環(huán)或者重復(fù)以上步驟導(dǎo)致在多重基因座(loci)處的細(xì)胞的多重遺傳(genetic)修飾，S卩，具有多重遺傳修飾的細(xì)胞。
[0009]根據(jù)某些方面，通過循環(huán)以上描述的方法提供了增加同源重組率的方法。在一種實(shí)施方式中，基因組Cas9指導(dǎo)的DNA剪切經(jīng)由戲劇性地提高同源重組率刺激了外源DNA。根據(jù)某些另外的方面，外源供體核酸包含同源序列(homology sequences)或者側(cè)接剪切位點(diǎn)的臂(arms flanking the cut site)。根據(jù)某些另外的方面，外源供體核酸包括除去剪切序列的序列。根據(jù)某些另外的方面，外源供體核酸包括同源序列或者側(cè)接剪切位點(diǎn)的臂以及除去剪切位點(diǎn)的序列。以這樣的方式，Cas9可以用作為針對(duì)不包含外源供體DNA的細(xì)胞的陰性選擇(negative select1n)。因此，提供了用于鑒別具有高重組頻率的細(xì)胞的陰性選擇的方法。
[0010]根據(jù)某些方面，在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)的DNA結(jié)合蛋白或者酶包括與向?qū)NA形成復(fù)合物并且與gRNA—起向?qū)?fù)合物至雙鏈DNA序列(其中該復(fù)合物結(jié)合至DNA序列)的蛋白。根據(jù)一個(gè)方面，該酶可以是RNA向?qū)У腄NA結(jié)合蛋白，如結(jié)合至DNA并且由RNA向?qū)У腎I型CRISPR體系的RNA向?qū)У腄NA結(jié)合蛋白。根據(jù)一個(gè)方面，RNA向?qū)У腄NA結(jié)合蛋白是Cas9蛋白。
[0011]本公開內(nèi)容的這個(gè)方面可以被稱作為RNA與DNA結(jié)合蛋白的共定位至雙鏈DNA或與雙鏈DNA—起共定位。以這樣的方式，DNA結(jié)合蛋白-向?qū)NA復(fù)合物可以用于剪切雙鏈DNA的多重位點(diǎn)以便生成具有多重遺傳修飾，如外源供體DNA的多重插入的細(xì)胞。
[0012]根據(jù)某些方面，提供了一種在表達(dá)酶的細(xì)胞中進(jìn)行對(duì)于靶DNA的多重改變的方法，該酶同與互補(bǔ)于靶DNA的RNA形成共定位復(fù)合物并且以位點(diǎn)特異性方式切割靶DNA，該方法包括(a)將編碼與靶DNA互補(bǔ)的一種或多種RNA的第一外來核酸引入至細(xì)胞中，并且該第一外來核酸向?qū)钢涟蠨NA，其中一種或多種RNA和酶是用于靶DNA的共定位復(fù)合物的成員，將編碼一種或多種供體核酸序列的第二外來核酸引入至細(xì)胞中，其中表達(dá)一種或多種RNA和一種或多種供體核酸序列，其中一種或多種RNA和酶共定位至靶DNA，該酶切割靶DNA并且將供體核酸插入至靶DNA中以在細(xì)胞中產(chǎn)生改變的DNA，并且重復(fù)步驟(a)多次以產(chǎn)生對(duì)于在細(xì)胞中的DNA的多重改變。
[0013]根據(jù)一個(gè)方面，細(xì)胞是真核細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)方面，細(xì)胞是酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)方面，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0014]根據(jù)一個(gè)方面，該RNA為約1至約500個(gè)之間的核苷酸。根據(jù)一個(gè)方面，該RNA為約20至約100個(gè)之間的核苷酸。
[0015]根據(jù)一個(gè)方面，該一種或多種RNA是向?qū)NA。根據(jù)一個(gè)方面，該一種或多種RNA是tracrRNA-crRNA 融合體。
[0016]根據(jù)一個(gè)方面，該DNA是基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA、或者外源DNA。
[0017]通過以下實(shí)施方式及其附圖的描述以及權(quán)利要求，本發(fā)明的某些實(shí)施方式的進(jìn)一步特征和優(yōu)勢(shì)將變得更加充分地明白易懂。
【附圖說明】
[0018]通過以下結(jié)合附圖的示例性實(shí)施方式的詳細(xì)描述將更完全地理解本實(shí)施方式的上述及其他特征和優(yōu)勢(shì)，其中:
[0019]圖1是經(jīng)由Cas9的RNA向?qū)У幕蚪M切割的示意圖。
[0020]圖2是示出了在酵母中使用Cas9進(jìn)行多重基因組工程的示意圖。
[0021]圖3是示出了使用靶向在酵母中對(duì)于耐熱性關(guān)鍵性的四個(gè)基因座的寡核苷酸的等位基因替換的示意圖。
[0022]圖4是示出了在一次循環(huán)和二次循環(huán)之后每個(gè)細(xì)胞的修飾數(shù)目的圖表。
[0023]圖5A是具有突變型的菌株的表。圖5B示出了各種菌株對(duì)熱休克的耐熱性。
[0024]圖6A示出了用于轉(zhuǎn)化頻率的圖表數(shù)據(jù)。圖6B示出了用于單個(gè)的重組頻率的圖表數(shù)據(jù)。圖6C示出了用于在can I和KanMX基因座處的共重組頻率的圖表數(shù)據(jù)。
[0025]圖7示出了用于兩個(gè)基因座的多重線性盒整合的圖表數(shù)據(jù)。
[0026]圖8A示出了在30°C處雙倍時(shí)間內(nèi)的倍數(shù)變化的圖表數(shù)據(jù)。圖8B示出了在37°C處雙倍時(shí)間內(nèi)的倍數(shù)變化的圖表數(shù)據(jù)。圖SC示出了利用從靜止期晚期的培養(yǎng)液接種的細(xì)胞在42°C處雙倍時(shí)間內(nèi)的倍數(shù)變化的圖表數(shù)據(jù)。圖8D示出了利用從對(duì)數(shù)期晚期的培養(yǎng)液接種的細(xì)胞在42°C處雙倍時(shí)間內(nèi)的倍數(shù)變化的圖表數(shù)據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0〇27] 本公開內(nèi)容的實(shí)施方式是基于外源DNA(exogenous DNA)、核酸酶(如DNA結(jié)合蛋白)與向?qū)NA的重復(fù)使用從而共定位DNA，并且利用插入外源DNA(如通過同源重組)將DNA消化或切割。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，易于知道這樣的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合DNA以用于各種目的。這樣的DNA結(jié)合蛋白可以是天然存在的。在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)所包括的DNA結(jié)合蛋白包括可以由RNA向?qū)У哪切?