雙酶梭菌及其用途及納米金屬硫化物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及雙酶梭菌，本發(fā)明涉及該雙酶梭菌在制備納米金屬硫化物中的應(yīng)用， 本發(fā)明還涉及該雙酶梭菌在處理重金屬污染物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，新興的生物制備納米粒子的方法即眾多的生物大分子在合適的生理?xiàng)l件 (pH、溫度、鹽度）下都是天然的納米反應(yīng)器。利用微生物體來(lái)合成納米材料的主力軍是細(xì) 菌，當(dāng)然利用真菌和病毒等其它微生物體也已制備出許多性能優(yōu)良、形貌精美的納米材料。 相對(duì)于傳統(tǒng)的物理、化學(xué)制備的方法，生物法具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如制備程序簡(jiǎn)單、細(xì)菌易 于控制、條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便和成本較低、收率高等。
[0003] 但是，現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)菌對(duì)重金屬的耐受濃度普遍不高，這限制了微生物體在制備 納米材料方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種雙酶梭菌，本發(fā)明還提供了該雙酶梭菌在制備納米金屬硫化物中 的應(yīng)用，本發(fā)明還提供了該雙酶梭菌在處理重金屬污染物中的應(yīng)用。
[0005] -種雙酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6月12日。保藏地址為北 京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
[0006] 該雙酶梭囷在制備納米金屬硫化物中的應(yīng)用。
[0007] 制備納米金屬硫化物的方法，包括以下步驟： S10.在培養(yǎng)基中加入含0. 01_5g/L金屬鹽溶液，調(diào)節(jié)pH值至4-9,滅菌后冷卻至室溫， 加入含有雙酶梭菌的菌液，獲得接種溶液； S20.將接種溶液放置于15-45°C下厭氧培養(yǎng)6~76小時(shí)； S30.獲得納米金屬硫化物。
[0008] 所述的金屬鹽溶液中的金屬元素為鎳、鈷、鋅、鎘、鐵、錳、汞、鉛、金、銀、銅中的一 種或幾種。
[0009] 所述的金屬鹽溶液為硝酸鹽溶液、鹽酸鹽溶液和硫酸鹽溶液中的一種或幾種。
[0010] 所述的金屬鹽溶液和/或培養(yǎng)基中還包括鎳、鈷、鋅、鎘、鐵、錳、汞、鉛、金、銀、銅 等元素離子的絡(luò)合物。
[0011] 所述的培養(yǎng)基中包括含硫有機(jī)質(zhì)。
[0012] 該雙酶梭菌在處理重金屬污染物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的雙酶梭菌具有高的金屬離子耐受濃度、在高重金屬濃度的環(huán)境下，能夠 保持良好的活性。能夠以原位的方法，應(yīng)用于制備納米粒子和處理重金屬污染物。
[0014] 說(shuō)明書(shū)附圖 圖1為實(shí)施例1獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0015] 圖2為實(shí)施例2獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0016] 圖3為實(shí)施例3獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0017] 圖4為實(shí)施例4獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0018] 圖5為實(shí)施例5獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0019] 圖6為不同Cd2+濃度對(duì)去除情況的影響圖（t= 37°C，ρΗ=6· 5)。
[0020] 圖7為不同Cu2+濃度對(duì)去除情況的影響圖（t= 37°C，ρΗ=6. 5)。
[0021] 圖8為pH對(duì)Cd2+去除率的影響圖（t= 37°C，Cd2+為40mg/L)。
[0022] 圖9為pH對(duì)Cu2+去除率的影響圖（t= 37°C，Cu2+為40mg/L)。
[0023] 圖10為溫度對(duì)Cd2+去除率的影響圖（ρΗ=6· 5,Cd2+為40mg/L)。
[0024] 圖11為溫度對(duì)Cu2+去除率的影響圖（ρΗ=6· 5,Cu2+為40mg/L)。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0026] -株雙酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6月12日。
[0027] 細(xì)菌的獲取： 1、采集與富集天然菌株 從浙江某地一家電鍍公司廢水排放口處采取液樣和固樣，放入裝有30mL己滅菌的生 理鹽水的錐形瓶中，放搖床振蕩30min，連續(xù)稀釋至10 - 6倍，然后用移液槍吸取lmL所需 濃度的菌懸液，注入富集培養(yǎng)基內(nèi)并置于35°C電子恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-4天。用肉眼觀察 培養(yǎng)基內(nèi)是否有菌生長(zhǎng)。
[0028] 2、菌的馴化 取富集樣品lmL，接種于馴化培養(yǎng)基中，在35°C、200r/min的搖床上培養(yǎng)72h，再取培 養(yǎng)液lmL進(jìn)行傳代馴化。每72h接種傳代1次。經(jīng)過(guò)若干代重金屬離子馴化后，選擇生長(zhǎng) 代謝旺盛、菌絲球豐富、分布均勻者供平板分離初篩。
[0029] 3、初篩方法 蘸取馴化菌液于分離平板上劃線，35°C培養(yǎng)48h-72h，觀察菌體生長(zhǎng)情況，挑選生長(zhǎng)優(yōu) 良的單菌落接種于斜面試管中。
[0030] 4、復(fù)篩方法 將初篩得到的菌株分別接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，在35 °C、200r/min的搖床 上培養(yǎng)72h，每12h測(cè)1次培養(yǎng)基中剩余的重金屬離子濃度，淘汰去除重金屬離子能力較低 的菌株，將能力較高的菌株接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基中，35°C下進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
[0031] 5、菌種的純化 菌種的純化實(shí)驗(yàn)采用改良的Brewer皿厭氧瓊脂平板進(jìn)行操作。復(fù)篩培養(yǎng)液中取10ml 菌液，放入事先充滿氮?dú)獠в袛?shù)粒玻璃珠的無(wú)氧滅菌的培養(yǎng)瓶中，在振蕩器中振蕩1小 時(shí)后將污泥中菌膠團(tuán)徹底打碎，然后用充滿氮?dú)獾拿撗鯚o(wú)菌水或脫氧無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行 10倍為基準(zhǔn)的梯度稀釋?zhuān)瑢⑻荻认♂尯蟮木悍謩e接種于固體培養(yǎng)基之中制成滾管，培養(yǎng) 3天。挑取單菌落轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基中。重復(fù)以上操作若干次，直至管內(nèi)菌落和顯微鏡下 的細(xì)胞形態(tài)一致認(rèn)為是純菌株，再進(jìn)一步用電鏡確認(rèn)。將分離純化的發(fā)酵細(xì)菌轉(zhuǎn)接于液體 培養(yǎng)基中，35°C、200r/min振蕩培養(yǎng)3天，再次檢測(cè)培養(yǎng)液中重金屬離子剩余濃度，確定獲 取對(duì)重金屬離子去除能力較高的功能菌。
[0032] 6、菌的鑒定 首先在商品哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基厭氧平板（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司）， 用無(wú)菌接種環(huán)挑取獲得的功能菌種接種于平板，放置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察平板 上菌種的生長(zhǎng)狀況和細(xì)胞形態(tài)，直至平板上菌落和顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)一致認(rèn)為是純菌 株；其次通過(guò)對(duì)菌株菌落、液體培養(yǎng)特征、細(xì)胞形態(tài)觀察、生理生化特征實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)其 16SrDNA序列分析研究，最后確定為一株雙酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6 月12日。
[0033] 在1L培養(yǎng)基中加入0. 5g硫酸亞鐵，滅菌冷卻后再接種5%已經(jīng)培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行 培養(yǎng)，然后通過(guò)不斷增加硫酸亞鐵的濃度對(duì)菌株進(jìn)行馴化，最終獲得對(duì)亞鐵離子具有耐受 性的優(yōu)勢(shì)菌株，最大耐受濃度為5g/L硫酸亞鐵。
[0034]雙酶梭菌細(xì)菌形態(tài)：細(xì)小菌落、干燥；革蘭陽(yáng)性、芽孢桿菌?；旧磻?yīng)：觸酶-、氧化酶-、吲哚+、克氏雙糖-/_ (生長(zhǎng)不良)。
[0035