放射性標記方法
【專利說明】放射性標記方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于體內(nèi)成像的放射性藥物領(lǐng)域，具體地講，涉及用放射性同位素 18f 標記生物靶向分子的方法。本發(fā)明提供制備氨基氧官能化生物分子的凍干組合物的方法和 使用純化物質(zhì)的放射性標記方法。本發(fā)明也提供凍干組合物和包含此類純化組合物的盒。 本發(fā)明特別適用于自動合成器裝置。
[0002] 發(fā)明背景 W0 2004/080492 A1公開一種放射性氟化生物靶向載體的方法，所述方法包括使式（I) 的化合物與式(Π )的化合物反應(yīng)： 或者， 使(III)的化合物與式(IV)的化合物反應(yīng) 其中： R1為醛部分;酮部分;受保護醛，例如，乙縮醛;受保護酮，例如，縮酮;或可用氧化劑快 速且有效地氧化成醛或酮的官能團，例如，二醇或N-末端絲氨酸殘基； R2為選自伯胺、仲胺、羥胺、肼、酰肼、氨基氧、苯肼、氨基脲和氨基硫脲的基團； R3為選自伯胺、仲胺、羥胺、肼、酰肼、氨基氧、苯肼、氨基脲或氨基硫脲的基團； R4為醛部分;酮部分;受保護醛，例如，乙縮醛;受保護酮，例如，縮酮;或可用氧化劑快 速且有效地氧化成醛或酮的官能團，例如，二醇或N-末端絲氨酸殘基； 以分別得到式(V)或(VI)的綴合物； 其中 X為-CO-NH-、-NH-、-ο-、-NHCONH-或-NHCSNH-，優(yōu)選-CO-NH-、-NH-或-ο-; Y為Η、烷 基或芳基取代基;并且 式(II)、（IV)、(V)和(VI)化合物中的接頭選自： 其中： η為0至20的整數(shù)； m為1至10的整數(shù)； P為〇或1的整數(shù)； Z為0或S。
[0003] Poethko等[J.Nucl .Med.，堅(5)，892-902 (2004)]公開一種用放射性同位素 18F 放射性標記肽的方法，其中使氨基氧?能化肽與[18F]_氟苯甲醛如下縮合，以得到具有肟醚 鍵的經(jīng)標記的肽： Schottelius等[Bioconj ·Chem.，19(6), 1256-1268 (2008)]進一步發(fā)展Poethko等 的方法。Schottelius等使用一種氨基氧官能化肽，其中用N_Boc(Boc=叔丁基氧基羰基)保 護基保護氨基氧基的胺。所需的氨基氧官能化肽在[ 18F]_氟苯甲醛存在下通過在酸性pH(pH =2)在75°C下N-Boc基團去保護而原位產(chǎn)生。3〇11〇1^61;[118等使用5倍摩爾過量的1300保護前 體，因為去保護在反應(yīng)條件下不是定量的。
[0004] Mezo等[J.Pept.Sci·，立，39-46 (2010)]描述與Boc保護的氨基氧官能化肽的 以上肟配位化學相關(guān)的一些問題。因此，已知Boc-氨基氧反應(yīng)劑可使生成的Boc-保護氨基 氧-肽?；a(chǎn)生不合乎需要的副產(chǎn)物。也已知官能化肽的游離氨基氧基的反應(yīng)性對羰基化 合物高。因此，與在反應(yīng)混合物或在任何隨后純化步驟中存在的任何外來的醛或酮可能發(fā) 生不需要的縮合。這些醛或酮可以為所用溶劑中存在的微量丙酮或甲醛（例如，來自增塑 劑hMezo等關(guān)注解決抗癌藥和[ 18F]_氟苯甲醛二者綴合到肽的這個問題。在10倍摩爾過量 游離(氨基氧）乙酸(Aoa)作為'羰基捕獲劑'存在下，通過進行Boc-氨基氧肽去保護，Mezo等 解決這一問題。然后凍干去保護的氨基氧-肽和過量Aoa，并在4°C儲存。在肟配位反應(yīng)前立 刻重組經(jīng)凍干的混合物，并通過HPLC或Sep-Pak plus C18柱分離過量AoaJezo等提供一個 實例，其中用此技術(shù)使非放射性(即，19F) 4-氟苯甲醛綴合到氨基氧-官能化的生長抑素肽。 Mezo等未提供關(guān)于18F-放射性標記的任何數(shù)據(jù)。
[0005] W0 2012/072736公開將替代保護基化學用于官能化生物分子的氨基氧基。受保護 氨基氧基具有下式： 其中R1和R2獨立選自Ch烷基、Cu氟烷基或C4-6芳基。
[0006] WO 2012/072736教導(dǎo)優(yōu)選使受保護氨基氧基原位去保護，即，在要綴合到的放射 性醛存在下，不用中間分離。然而，W0 2012/072736的實施例3公開用這種受保護氨基氧基 官能化的肽的去保護，隨后直接凍干，以提供經(jīng)分離產(chǎn)物。直接得到的該凍干組合物被描述 為純的。然而，W0 2012/072736未認識到乙酸鹽生成副產(chǎn)物的副反應(yīng)問題，如本發(fā)明所教 導(dǎo)。
[0007]因此，仍需要制備和放射性標記肽和其它生物靶向分子的替代或改進方法。
[0008] 本發(fā)明 本發(fā)明提供一種制備具有與其綴合的氨基氧官能基團的生物靶向分子(BTM)的凍干組 合物的方法。
[0009] 本發(fā)明提供純化的氨基氧官能化BTM作為這種純化物質(zhì)的凍干組合物及其隨后用 于放射性標記的用途。本發(fā)明由于增加受保護前體溶解提供更有效的去保護步驟。由于去 保護發(fā)生在層析純化所用的流動相，該方法更有效，因為不需要分離純化的受保護氨基氧 衍生物。這特別重要，因為節(jié)省凍干步驟，因為受保護氨基氧衍生物一般通過凍干分離，凍 干是一個耗時過程。在用于放射性標記時，凍干物質(zhì)更容易溶解，這對BTM的有效標記和純 化是重要的。
[0010]發(fā)明詳述 在第一個方面，本發(fā)明提供一種制備氨基氧官能化生物靶向分子凍干組合物的方法， 所述方法包括： (i) 用流動相反相層析純化式(IA)的受保護化合物：
[BTMJ-X1 (IA) 以在所述流動相得到純化化合物IA; (ii) 使來自步驟(i)的純化化合物IA去保護，以得到式(IIA)的氨基氧化合物的溶液： [BTM]-〇-NH2 (IIA) (iii) 凍干來自步驟(ii)的溶液，以得到式(IIA)的所述氨基氧化合物的凍干組合物； 其中：
[BTM]為生物靶向分子； X1為下式的受保護氨基氧基： 其中R1和R2獨立選自烷基、氟烷基或C4-6芳基。
[0011] 術(shù)語"生物靶向部分"（BTM)是指給予后在哺乳動物體的體內(nèi)具體部位選擇性吸收 或定位的化合物。這些部位可例如牽涉具體病癥或指示器官或代謝過程是如何運作的。
[0012] 術(shù)語"受保護"具有在化學和/或放射化學領(lǐng)域的常規(guī)意義，并指用保護基保護官 能基不發(fā)生不需要的反應(yīng)。術(shù)語"去保護"具有在化學和/或放射化學領(lǐng)域的常規(guī)意義，即， 去除保護基。術(shù)語"保護基"或P eP是指抑制或阻止不合乎需要的化學反應(yīng)、但被設(shè)計成由足 夠反應(yīng)性以便能夠在不改變分子其余部分的足夠溫和條件下從所述官能團斷開的基團。在 去保護后，得到所需產(chǎn)物。保護基的使用描述于"Protective Groups in Organic Synthesis"（有機合成中的保護基），第4版，Theorodora W. Greene和Peter G. Μ· ffuts, [Wiley Blackwell, (2006)]〇
[0013] 術(shù)語"氨基氧基"具有其常規(guī)意義，是指式-〇-NH2的取代基，優(yōu)選-ch2-o-nh 2。
[0014] 術(shù)語"反相層析純化"具有其常規(guī)意義，是指其中固定相親油且流動相親水的層 析，一般涉及含水介質(zhì)。適合的層析技術(shù)包括HPLC、中壓液相層析(MPLC)或固相萃取(SPE)。 優(yōu)選的反相層析技術(shù)為HPLC。適合的RP-HPLC柱材料基于二氧化硅，因此，應(yīng)封端，以避免與 顆粒表面上硅烷醇基不期望的相互作用。柱材料應(yīng)具有高表面積覆蓋率，接受適中到高制 備載量的待純化物質(zhì)，并且容易以不同柱形式填充得到，并且在需要較大量的情況下也可 以大量填入較大制備型柱而得到。優(yōu)選的此類HPLC柱包括:Luna C-18 (2) (ΙΟμπι，100 A)，購自Phenomenex;或其它二氧化娃基C-18材料，例如購自Eka的Kromasi 1或購自YMC的 ODS AQJPLC柱最優(yōu)選為Luna C-18 (2) (ΙΟμπι, 100 A)柱。
[0015] 去保護步驟（ii)適合地按在本領(lǐng)域已知的進行[Dulery等，Tetrahedron, 63 , 11952-11958 (2007);和 Foillard 等，[J.Org.Chem·，983-991 (2008)]〇
[0016] 也應(yīng)適當?shù)貜牟襟E（i)-(iii)除去醛和酮，因為即使微量或在實驗室氣氛中空中 傳播，它們也將經(jīng)歷與式IIA氨基氧化合物的不期望的副反應(yīng)。
[0017] 術(shù)語"凍干"具有常規(guī)意義，即，冷凍干燥的組合物，優(yōu)選以無菌方式制備的組合 物。
[0018] 優(yōu)選特征 在步驟(i)中使用的流動相優(yōu)選為酸性。酸性流動相的優(yōu)點是，在BTM包含堿性基團時， 例如肽或蛋白質(zhì)的氨基，這些被質(zhì)子化，以達到充分的層析分離。
[0019] 優(yōu)選在步驟(i)的流動相中使用的酸包括三氟乙酸(TFA)，更優(yōu)選包括含水TFA。在 步驟(i)流動相中的適合TFA濃度為0.01-5%體積，優(yōu)選0.05-1%體積，更優(yōu)選0.1-0.3%體積。 TFA的優(yōu)點是，它為揮發(fā)性，并且在制備第二個方面的凍干組合物時比乙酸銨更容易去除。
[0020] 因此，對于步驟(i)用含水TFA作為流動相，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在HPLC層析期間不在有 意義的程度上發(fā)生化合物IA的去保護，因為與含水TFA流動相的接觸時間短(20-40min)，并 且因為化合物IA結(jié)合到固定相，因此不可達到去保護。然而，在含水TFA流動相內(nèi)在溶液中 儲存期間，在數(shù)分鐘接觸時間下發(fā)生去保護。
[0021 ]在流動相為酸性時，去保護優(yōu)選通過分離的純化化合物IA在酸性流動相中在5至 60°C溫度放置一段時間以允許反應(yīng)，和/或向所述溶液加入更多酸來實現(xiàn)。因此，例如在環(huán) 境溫度在氬下在0.1%含水TFA中儲存過夜顯示約0.8%保持受保護的(化合物IA)。完全去保 護和/或較短反應(yīng)時間需要加入更多TFA，例如0.13-0.15% TFA。
[0022] 因此，優(yōu)選在不分離純化化合物IA下進行第一個方面的步驟(i)，以便其作為來自 步驟(i)的流動相中的溶液用于步驟（ii)。這具有提高效率的優(yōu)點，因為發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，如 果被分離(例如，通過凍干），則純化化合物IA傾向于顯示在去保護介質(zhì)中的低溶解性，這使 其必須作為懸浮體使用，甚至在稀釋時。這進而導(dǎo)致較大溶劑體積用于步驟(iii)中凍干， 這顯著延長凍干時間，減小每次可處理的最大批量。對要處理的最大體積而言，冷凍干燥器 的容量通常決定批量。
[0023] 在第一個方面，優(yōu)選R1和R2二者獨立為烷基。更優(yōu)選R1和R2選自甲基和乙基，最 優(yōu)選R1為甲基，R2為乙基，即，乙氧基乙叉基（"Eei"）保護基。
[0024] BTM可來源于合成或天然，但優(yōu)選來源于合成。術(shù)語"合成"具有其常規(guī)意義，即人 造，與從天然源分離相反，例如來自哺乳動物體。此類化合物的優(yōu)點是可完全控制其制備和 雜質(zhì)特性。因此，天然來源的單克隆抗體及其片段在本文所用術(shù)語"合成"的范圍外。BTM的 分子量優(yōu)選最高30，000道爾頓。更優(yōu)選分子量在200至20，000道爾頓的范圍內(nèi)，最優(yōu)選300 至18，000道爾頓，400至16，000道爾頓尤其優(yōu)選。當BTM為非肽類時，BTM的分子量優(yōu)選為最 高